O documento descreve técnicas de citogenética e genética médica como cariotipagem, FISH e PCR para diagnóstico de distúrbios genéticos. Apresenta os passos da cariotipagem, aplicações de FISH e PCR e técnicas de eletroforese e Southern Blot. Conclui mencionando o futuro da genética médica.
1. Alexandra Carvalho – Diego Meneses – Eveny Costa – Fabiana Sátiro – Felipe Rodolfo
– Illy Gomes – Larissa Pessoa – Mayck Barbosa – Rosa Viana –
Universidade Federal do Piauí
Campus de Parnaíba
Disciplina: Práticas em Biomedicina I
Professora: France Keiko N. Yoshioka
Biomedicina 2012-02
7. Cariotipagem
Passo I
• Colheita – punção venosa,
• Cultivo;
• Adição de agentes estimulantes da mitose in vitro;
• Inibir a mitose em metáfase;
• Ruptura da célula e do núcleo celular;
• Coloração e visualização em lâmina.
Passo II
• Cromossomos organizados pelo tamanho e posição do centrômero
→Acrocêntricos - NORs
→Submetacêntricos
→Metacêntricos
8. Técnicas de coloração do cariótipo
• Bandeamentos G
• Bandeamento Q
• Bandeamento R
• Bandeamento C
• Bandeamento de alta resolução (pró-metafásico)
• Cariotipagem espectral (SKY)
9. • Células nucleadas,
• Amostras sangue periférico, sangue fetal, líquido amniótico;
• Pareamento dos cromossomos homólogos;
• Rápido, fácil e baixo custo;
• Permite a contagem do número de cromossomos;
• Permite avaliar a qualidade dos preparados cromossômicos.
Coloração convencional
10. Técnica mais usada;
tratamento com
tripsina (desnaturante
proteico) e coloração
com Giemsa
Cada par de
cromossomas cora
segundo um padrão
de bandas clara e
escuras (bandas G)
Coloração com
quinacrina mostarda (ou
outros semelhantes);
observação ao
microscópio de
fluorescência
Cromossomas coram
segundo um padrão
de bandas brilhantes
e opacas (bandas Q =
bandas G)
Desnaturação térmica e
salina seguida de
coloração com Giemsa
ou flurocromo(
Acridina)
Bandas escuras e
claras (bandas R)
estão invertidas
relativamente ao
bandeamento G e Q
Bandeamento G
Bandeamento Q
Bandeamento R
14. • Coloração que contém heterocromatina constitutiva ;
• Partes: centrômeros e partes dos cromossomos e braços
longos dos cromossomos 1,9,16 e Y.
Bandeamento C
Procedimentos especiais
Infertilidade
15. Síndrome de DiGeorge
• Usado com técnicas de bandeamentos G ou R,
• Estágios iniciais da mitose, prófase e pró – metáfase;
• Útil principalmente para microdeleções cromossômicas -
anomalias estruturais ;
• Revelam mais bandas que os métodos que usam a fase
Metáfase.
Bandeamento de alta resolução
16. Cariotipagem espectral (SKY)
• Cromossomos de uma
célula de uma só vez,
• Cores fluorescentes;
• 24 diferentes espectros
fluorescentes sendo o 23 ª
e 24ª para o cromossomo X
e Y;
• Coloração genômica total ;
• Sistema de computador
para análise de imagem.
18. O que essas técnicas nos permitem diagnosticar?
→Euploidia múltiplo exato do conjunto cromossômico
(tetraploidia)
→Aneuploidia qualquer outro número que não seja múltiplo do
conjunto genômico (monossomia , trissomia)
• Síndrome de Down (trissomia do 21)
• Síndrome de Edward (trissomia do 18)
• Síndrome de Patau (trissomia do 13)
• Síndrome de Turner (monossomia do cromossomo X)
Translocações recíprocas – troca de segmentos entre cromossomos
19. Distúrbios genéticos A nível gênico
Deleção
Adição
Inversão
Transição
Exames laboratoriais referentes à:
20. FISH - hibridização in situ por
fluorescência
• Preparação de sondas específicas de DNA.
• Kits pelos laboratórios de citogenética.
• Preparação das sondas:
→ Método direto
→ Método indireto
• Preparação dos cromossomos.
• Preparação das lâminas.
• Desnaturação da sonda e do DNA cromossômico →
aquecimento em solução de formamida (70C).
26. PCR
Extração e purificação do DNA
1. Tampão de extração (EDTA, SDS em pH básico),
2. Adicionar Proteinase K;
3. Adicionar RNAse;
4. Adicionar Fenol;
6. Adicionar Clorofórmio/ álcool isoamílico;
8. Adicionar Acetado de Na 3M e etanol gelado.
27. • DNA molde,
• Primers (delimitam a sequência a ser amplificada);
• DNA polimerase (Taq polimerase);
• dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP);
• Tampão contendo pH de ação da DNA polimerase;
• Cloreto de magnésio (íons Mg2+).
Componentes básicos necessários para
realização de uma reação de PCR:
29. Cuidados especiais nas reações de PCR
• A alta sensibilidade.
• Qualquer sequência alvo de DNA pode ser amplificada
por PCR.
• Inclusão de controles em cada experimento.
Possíveis fontes de contaminação da PCR
Amostras biológicas Ponteiras plásticas
Métodos de coleta de amostras Tubos de reagentes/vidraria
Pessoal do laboratório Reagentes
Ambiente do laboratório/ ar
condicionado
Tubos de centrífuga/ centrífuga
Gelo/ nitrogênio líquido Termociclador/ banho-maria/ bloco de
aquecimento
Homogenizador de tecidos Transiluminador
30. RT-PCR
Componentes básicos para a realização de uma RT‐PCR
• Transcriptase reversa,
• DNA polimerase;
• Taq polimerase;
• dNTPs;
• Primers;
• Íons Mg2+.
1ª Etapa (37° C)
Transcriptase reversa, DNA polimerase, primers, dNTPs
2ª Etapa (ciclos de 94°, 60°, 72° C)
Taq polimerase, dNTPs, Primers, Íons Mg2+
33. Eletroforese
• Estudos da relação patógeno-hospedeiro,
• Determinação do peso molecular de proteínas;
• Caracterização de moléculas de ácidos nucléicos;
• DNA recombinante, sequenciamento de nucleotídeos;
• Mapeamento de fragmentos de restrição;
• Amplificação de DNA.
34. Aplicações da PCR e Eletroforese de DNA
→ Diagnóstico pré‐natal.
• Diagnóstico pré‐natal e detecção de portadores da distrofia muscular
Duchenne envolvendo a triagem de deleções e duplicações usando a reação
em cadeia da polimerase (PCR) multiplex. O paciente 1 não tem as bandas
E e F, deleção dos éxons 45 ‐ 48. O paciente 2 não tem as bandas f e h e o
paciente 3 não tem a banda d.
35. •PCR ‐ RFLP – polimorfismo de fragmentos de restrição (Análise de mutações)
Aplicações da PCR e Eletroforese de DNA
→ Diagnóstico de hemoglobina S (HbS).
• Mutação no códon (GAG > GTG) elimina um sítio de restrição da Enzima DdeI ;
assim após a digestão o alelo normal gera 3 fragmentos: 201, 88 e 87 pb e o alelo
mutante 2 fragmentos: 288 e 88pb.
36. Southern Blot
• É um método de análise de ácidos nucleicos que
permitem mapear fragmentos de DNA de interesse em
uma coleção de fragmentos que é o nosso genoma.
• Indicado para diagnóstico de doenças e na identificação
de pessoas.
• A metodologia permite a detecção de genes inteiros ou
grande parte deles, assim como inserções e deleções.
Doença Tipo de mutação Teste
Síndrome do X
frágil
Expansão de trinucleotídeos
(CGG) na região promotora
do gene FMR1
PCR associado à Southern
blot
Distrofia de Becker
e Duchenne
Mutações do tipo deleção e
duplicação no gene da
distrofia (DMD).
PCR e Souther blot para
detecção de deleções
37. Southern Blot
DNA digerido por uma
enzima de restrição
Separação dos fragmentos
em gel de agarose
Transferência dos fragmentos do gel
para uma membrana de
nitrocelulose
Membrana com os
fragmentos transferidos
Hibridização com sonda
marcada radioativamente
Autorradiografia: as bandas
correspondem a fragmentos
onde a sonda hibridizou
38. Northern Blot
• Análise do RNA,
• Desnaturação antes da Eletroforese em gel com adição
de formaldeído;
• Depois da eletroforese o RNA é transferido para um
filtro incubado com uma sonda desnaturada, marcada
que hibridiza o RNA específico;
• Exposição do filtro ao raio X.
39. Separação dos fragmentos
em gel de agarose
Transferência dos fragmentos do gel
para uma membrana de
nitrocelulose
Membrana com os
fragmentos transferidos
Hibridização com sonda
marcada radioativamente
Autorradiografia: as bandas
correspondem a fragmentos
onde a sonda hibridizou
Purificação do RNA
Northern Blot
40. Dot blot
Trata-se de uma metodologia que permite detectar
biomoléculas. É uma simplificação da metodologia de
Southern blot, northern blot e westhern blot.
• Moléculas não são separadas por eletroforese,
• Aplicadas diretamente a um suporte sólido como um
ponto (dot);
• A membrana é submetida ao processo de desnaturação é
hibridizada com a sonda de interesse.
Indicações
Em casos em que a mutação investigada é prevalente na
população investigada, ou seja, a mutação de uma base ou
um pequeno número de bases é responsável por uma fração
significativa de casos da doença naquela população.
41. Westhern Blot
Também conhecido como protein blotting ou
immunoblotting, é um poderoso e importante método em biologia
molecular utilizado para imunodetecção de proteínas após a
separação destas por eletroforese em gel e transferência para
membrana adsorvente.
43. Alexandra Carvalho – Diego Meneses – Eveny Costa – Fabiana Sátiro – Felipe Rodolfo
– Illy Gomes – Larissa Pessoa – Mayck Barbosa – Rosa Viana –
Universidade Federal do Piauí
Campus de Parnaíba
Disciplina: Práticas em Biomedicina I
Professora: France Keiko N. Yoshioka
Biomedicina 2012-02
44. Referências Bibliográficas
• BAMOHAD, J. G. Genética Médica. Elsevier. 2010. capítulo 6.
Citogenética Clínica: A base cromossômica da doença humana.
• NASSBAUM, et al. Tompson & Tompson. Guanabara Koogan. 2002.
Capítulo 9. Fundamentos de citogenética.
Notas do Editor
Os profissonais biomédicos são habilitados a trabalhar na área de
Patogênese
Os esporos da bactéria C. tetani entra na pele por ferida ou violação, na presença de anaerobiose os esporos germinam, logo após ocorre a produção das toxinas que são liberadas após a lise celular, caindo na corrente sanguínea e vasos linfáticos chegando no SNC: agindo com o aumento da liberação do acetilcolina e inativando a proteína que regula a liberação dos neurotransmissores inibitórios da glicina e ácido gama-aminobutírico(GABA)
Esse procedimento utiliza a capacidade de a nitrocelulose ligar-se fortemente ao DNA fita simples, mas não a fita dupla. O Primeiro passo é a realização de eletroforese de DNA clivado por enzimas de restrição, para alguma região de interesse que se quer identificar. O segundo passo é converter o DNA de fita dupla em fita simples quando colocado uma solução de NaOH no gel. O gel é então recoberto por uma folha de nitrocelulose e sobre esta é colocada uma pilha de papel, que por capilaridade as moléculas no gel irão se deslocarem-se para a nitrocelulose. O DNA de fita simples liga-se a
membrana de nitrocelulose na mesma posição em que estava no gel. Após isso é feita a retirada da nitrocelulose e sua secagem a 80° C, que fixa o DNA permanentemente no lugar. a membrana de nitrocelulose é umedecida com uma quantidade mínima de uma solução contendo uma sonda de DNA de fita simples marcada com um isótopo radioativo. A membrana é lavada para remover a sonda radioativa não-ligada, secada, e é feita uma autoradiografia pela exposição a um filme de raio X. A posição das moléculas complementares a sonda radioativa é indicada pelo surgimento de manchas escuras no filme revelado.