1) O documento descreve os parâmetros e procedimentos para validação de métodos cromatográficos, incluindo especificidade, exatidão, precisão, linearidade, limite de detecção e quantificação. 2) São detalhados os testes, critérios de aceitação e número de determinações necessárias para cada parâmetro de validação de acordo com diretrizes como ANVISA, ICH e FDA. 3) O documento fornece informações sobre como estabelecer a curva de calibração e avaliar sua linearidade para assegurar a

1. Validação de métodos cromatográficos Mestranda: ADRIANA ELIAS PIRES Orientadora: CLÁUDIA CARDOSO Departamento de Química – UFMS Campo Grande – MS, 2003

2. SINAIS

3. OBJETIVO DO MÉTODO? RESULTADOS PRETENDIDOS? MATRIZES DE AMOSTRAS? POSSÍVEIS INTERFERENTES? NÍVEIS DE EXATIDÃO, PRECISÃO, SENSIBILIDADE, LD REQUERIDOS? PLANEJAMENTO DE METODOLOGIA

4. QUALIFICAÇÃO DO EQUIPAMENTO ANALÍTICO ESTABILIDADE DAS SOLUÇÕES ANALÍTICAS ICH TESTE DE ADEQUAÇÃO DO SISTEMA SELEÇÃO DA MATRIZ DETERMINAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS DE INTERESSE DETERMINAÇÃO DO SOLVENTE EXTRATOR, VOLUME DE SOLVENTE, MODO DE EXTRAÇÃO E TEMPO DE EXTRAÇÃO (n>3) RECUPERAÇÃO 4 CONC. EM TRIPLICATA MONITORAMENTO POR CLAE: CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS; CURVA DE CALIBRAÇÃO VALIDAÇÃO

5. Processo que fornece uma evidência documentada de que o método é confiável dentro de uma determinada faixa de aplicação que o analito será analisado. VALIDAÇÃO

6. VALIDAÇÃO Assegura credibilidade às medidas obtidas. Requisito indispensável para publicação de novas metodologias. Permite que a transferência de um método entre laboratórios ocorra da forma mais satisfatória.

7. Guias da US Food and Drug Administration (FDA) Reviewer guidance, Validation of chromatographic methods guideline for submitting samples and analytical data for methods validation guidance for industry: analytical procedures and methods validation guidance for industry: bioanalytical method validation US Pharmacopeia 24 Internacional Conference on Harmonization (ICH) Q2A Texto on validation of analytical methods Q2B Validation of analytical procedures: methodology No BRASIL: Agência Nacional de Vigilância Sanitária. RE nº899, de 29 de maio de 2003. ESTRUTURA PARA VALIDAÇÃO DE MÉTODOS

8. PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

9. ESPECIFICIDADE EXATIDÃO PRECISÃO LINEARIDADE FAIXA DE APLICAÇÃO LIMITE DE DETECÇÃO LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO ROBUSTEZ

10. ESPECIFICIDADE Capacidade de um método de diferenciar um composto em presença de outros componentes da amostra (impurezas, intermediários de síntese, excipientes, produtos de degradação e componentes da matriz). Potenciais interferentes ⇒ ESTRESSE Especificidade x Seletividade

11. EXATIDÃO Grau de concordância ou compatibilidade entre o valor médio dos resultados e o valor de referência aceito. Exatidão X Acurácia Exatidão = Conc. média experimental X 100% ANVISA Conc. aceita

12. 4 CAMINHOS: Análise de amostra de concentração conhecida (padrão de referência) e comparação dos dados com o valor verdadeiro. 2. Comparação dos dados do método novo com os de uma metodologia bem caracterizada de exatidão estabelecida. 3. Recuperação de quantidades conhecidas de analito adicionadas à matrizes brancas. 4. Recuperação de quantidades conhecidas de analito adicionadas à matrizes com o analito. EXATIDÃO ICH, ANVISA, USP

13. EXATIDÃO Nº DE DETERMINAÇÕES: Três concentrações em triplicata: 80, 100 e 120% da concentração teórica da amostra . ANVISA, ICH Recuperação para resíduos: Três concentrações: 1L OQ, 2 LOQ e 10 LOQ . GARP CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO: Amostras, inclusive produtos farmacêuticos: 100  2% Impurezas: 0,1% absoluto ou 10% relativo J.of Chromatography A, 987 (2003) 57 Resíduos: 70 a 120% GARP Análises bioanalíticas:  15%, sendo no LQ  20%. ANVISA, FDA, ICH Traços  100ppb  60 a 110% J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 19 (5) 737-757, 1996.  100ppb  80 a 100%  1ppm  70 a 120%

14. PRECISÃO Avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas do método. CV = DP x 100 ICH, ANVISA CMD onde, CV é o coeficiente de variação, DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média determinada.

15. PRECISÃO 1. REPETITIVIDADE: Expressa precisão entre os resultados de medidas do mesmo método para a mesma amostra , no mesmo laboratório , pelo mesmo operador usando mesmo equipamento em um curto intervalo de tempo .

16. Nº DE DETERMINAÇÕES: 3 concentrações em triplicata contemplando intervalo linear ou 6 determinações a 100% da concentração teórica da amostra. ICH, ANVISA, J.Chromatogr.A 987 (2003) 57 Análises bioanalíticas: 3 concentrações em quintuplicata. ICH, ANVISA, J.Chromatogr.A 987 (2003) 57 Precisão do instrumento: 10 injeções de uma solução de amostra. FDA PRECISÃO: 1. REPETITIVIDADE CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO: DOSEAMENTO:  2% ; precisão do instrumento  1% J.Chromatogr.A 987 (2003) 57 IMPUREZAS:  5% no LQ; precisão do instrumento  10% no LQ. J.Chromatogr.A 987 (2003) 57 RESÍDUOS:  20% GARP

17. PRECISÃO 2. PRECISÃO INTERMEDIÁRIA: Expressa a precisão dos resultados obtidos usando o mesmo laboratório , mas em dias diferentes , com analistas diferentes e/ ou equipamentos diferentes . Um mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes. ANVISA Uso de amostras autênticas é indicado. ICH

18. PRECISÃO 3. REPRODUTIVIDADE: Expressa a precisão dos resultados obtidos pelo mesmo método e mesma amostra , por diferentes operadores , usando diferentes equipamentos em diferentes laboratórios . Estudos colaborativos, geralmente aplicados à padronização de metodologia analítica, por exemplo, para inclusão em farmacopéias. ICH, ANVISA ALGUNS CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO: ± 2% do valor do laboratório primário; J.Chromatog.A 987 (2003) 57 não se admite valores acima de 5%. ANVISA Análises bioanalíticas:  15%, sendo no LQ,  20%. ANVISA,FDA

19. LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO Linearidade é a habilidade do método produzir resultados diretamente proporcionais à concentração do analito numa dada faixa de variação. Faixa de variação é o intervalo entre o maior e o menor níveis de analito que demonstra ser determinado com precisão, exatidão e linearidade usando o método como descrito.

20. LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO 80 a 120% da concentração teórica do teste; ICH, ANVISA, FDA Impurezas: desde o nível esperado até 120% do limite máximo especificado. Em toxicologia os limites devem se adequar às quantidades a serem controladas ; ICH, ANVISA, FDA Resíduos: ½ a 5 LOQ. GARP Testes de uniformidade de conteúdo: 70 a 130%; ICH, ANVISA Ensaios de dissolução:  20% em relação à faixa de variação do teste . ICH, ANVISA Nº DE DETERMINAÇÕES: Cinco concentrações em replicata (n>2), ANVISA,,ICH nas seguintes faixas mínimas de variação:

21. LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO A linearidade pode ser demonstrada pelo exame visual do gráfico que relaciona os sinais obtidos na análise e a concentração do analito. A equação da reta é definida por: y = a x + b onde: y= resposta; x= concentração; a = coeficiente angular (inclinação/ sensibilidade ); b = coeficiente linear (intersecção no eixo y qdo x=0)

22. Curva de calibração: padrão externo  relaciona a resposta do aparelho com a massa do analito sem levar em conta a matriz. LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO Rev. Brasileira de Toxicologia. 11 (1) (1998) 1 e Q.B.Cass; A.L.G. Degani. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação.

23. Curva de calibração: padrão interno  cuja medida permite comparação relativa com o analito, sem interferir com a resposta deste. LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO Padrão interno: retenção próxima, boa resolução em relação ao analito, alta pureza e estabilidade. Rev. Brasileira de Toxicologia. 11 (1) (1998) 1 e Q.B.Cass; A.L.G. Degani. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação. Y = A. analito A. p.interno X = C. analito

24. Curva de calibração com adição do analito à matriz  elimina a interferência da matriz e outras etapas do método. LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO Rev. Brasileira de Toxicologia. 11 (1) (1998) 1 e Q.B.Cass; A.L.G. Degani. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação. Intersecção no eixo y = qtde de analito na amostra. Quando há Impossibilidade de matriz branca.

25. LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO REGRESSÃO LINEAR (método dos mínimos quadrados) : é uma forma de estimar qual a melhor reta que passa pelos pontos obtidos experimentalmente.

26. LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO (r) : expressa a relação de x e y na curva, onde os valores ideais são 1 e –1. CRITÉRIO MÍNIMO ACEITÁVEL: = 0,99 ANVISA ;  0,999 FDA COEFICIENTE DE DETERMINAÇÃO (R) : r 2

27. LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LQ) É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.

28. LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO FORMAS DE DETERMINAÇÃO: BASEADA NA AVALIAÇÃO VISUAL: métodos não instrumentais. ICH, ANVISA ex. CCD, Titulação, Mudança de cor.

29. 2. BASEADA NA RELAÇÃO SINAL-RUÍDO: procedimentos analíticos que exibem ruído de linha de base. Relação sinal-ruído típica é 10:1. ICH, ANVISA, FDA, USP LQ: FORMAS DE DETERMINAÇÃO

30. 3. BASEADA NO DESVIO PADRÃO DA RESPOSTA E NA INCLINAÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO. ICH, ANVISA LQ: FORMAS DE DETERMINAÇÃO LQ = 10 DP S onde DP é o desvio padrão da resposta e S é a inclinação da curva de calibração.

31. LIMITE DE DETECÇÃO (LD) É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas.

32. LIMITE DE DETEÇÃO FORMAS DE DETERMINAÇÃO: 1. BASEADA NA AVALIAÇÃO VISUAL ICH, ANVISA 2. BASEADA NA RELAÇÃO SINAL-RUÍDO. Relação sinal-ruído típica é 2 ou 3:1. ICH, ANVISA, FDA, USP 3. BASEADA NO DESVIO PADRÃO DA RESPOSTA E NA INCLINAÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO, ICH, ANVISA, USP LD = 3,3 DP I CH, USP ou LD = 3 DP ANVISA S S

33. ROBUSTEZ Um método robusto tem a capacidade de não ser afetado por uma pequena e deliberada modificação em seus parâmetros.

34. ROBUSTEZ Preparo das amostras : estabilidade das soluções analíticas, tempo de extração. Espectrofotometria : variação do pH da solução, temperatura, diferentes fabricantes de solventes. Cromatografia Líquida : variação do pH da fase móvel, variação na composição da fase móvel, diferentes lotes ou fabricantes de colunas, temperatura, fluxo da fase móvel. Cromatografia Gasosa : diferentes lotes ou fabricantes de colunas, temperatura, velocidade do gás de arraste. Os principais parâmetros que podem resultar em variação na resposta do método

35. QUAIS OS PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO REQUERIDOS???

36. Características de performance versus tipo de procedimento analítico pela ICH: sim não sim não Faixa de variação sim não sim não Linearidade não não sim não LQ não sim não não LD sim sim sim sim Especificidade sim sim não não sim sim não não Precisão Repetitividade P. Intermediária sim não sim não Exatidão Ensaios-limite Quantitativo Doseamento Testes de impurezas Identificação Procedimento analítico

37. Características de performance versus tipo de procedimento analítico pela USP: USP Pharmacopeia 24, 1999 * Pode ser requerido dependendo da natureza do teste. não * * sim sim Faixa de aplicação não * não sim não Linearidade não * não sim não LQ sim * sim não não LD sim * sim sim sim Especificidade não sim não sim sim Precisão não * * sim sim Exatidão Ensaios-limite Quantitativo Identificação características de performance (ex. dissolução) Impurezas ou produtos de degradação Principais componentes Procedimento analítico

38. G.A.Shabir, J.of Chromatography A, 987 (2003) 57 J. Babak; H.M. Nielsen, J.of Chromatogr. A . 996 (2003) 213. R.C. Prados-Rosales; J.L.L. García; M.D.L. de Castro, J.of Chromatogr. A.993(2003) 121. M. Lampinen; U. Bondesson; E. Fredriksson; M. Hedeland, J.of Chromatogr. B. 789(2003) 347. T. Verhaeghe; L. Diels; R.de Vries; M. De Meuder; J.de Jong, J of Chromatogr.B. 789(2003) 337. C. A. L. Cardoso, N. K. Honda, A. Barison, J. Pharm. Biomed. Anal. 27(2002) 217. Q.B.Cass; A.L.G. Degani. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação. EdUFSCar, São Carlos, 2001. Apostila do curso: Validação de métodos analíticos realizado por ISOLAB Consultoria e Cursos. C.B.Barros; Y.S.Hirata; N.M.N.Sato; Taboão da Serra, dez. 1997. ICH Harmonised Tripartite Guideline, Validation of analytical procedures: methodology. Geneva, 1996. F. Leite. Validação em análise química. ed. Átomo, Campinas, 1996. A.A.M. Chasin; E.S. Nascimento; L.M. Ribeiro-Neto; M.E.P.B. Siqueira; M.H. Andraus; M.C. Salvadori; N.A.G. Fernícola; R. Gorni; S. Salcedo, Rev. Brasileira de Toxicologia. 11 (1) (1998) 1. Reviewer Guidance. Validation of Chromatographic Methods. Center for Drug Evaluation and Research, US Food and Drug Administration, Rockville, MD, Nov, 1994. M.E. Swartz; I.S. Krull, Pharmaceutical Technology, (1998) 12. D.R. Jenke. Chromatographic method validation: a review of current practices and procedures. II. Guidelines for primary validation parameters. J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 19 (5) 737-757, 1996. Resolução - RE nº 899, de 29 de maio de 2003. Guidance for industry. Bioanalytical method validation. US Departament of Health and Human Services, Food and Drug administration, Center for Drug Evaluation and Research and Center for Veterinary Medicine, Rockville, MD, Maio, 2001. J.K.Taylor (1987) Quality assurance of chemical measurements. 2 ed., Lewis Publishers, Chelsea, 1987. USP 24 (United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD, 1999) C.B.Barros, Biológico, 64(2) (2002) 175 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

39. FIM