1) O documento descreve os parâmetros e procedimentos para validação de métodos cromatográficos, incluindo especificidade, exatidão, precisão, linearidade, limite de detecção e quantificação. 2) São detalhados os testes, critérios de aceitação e número de determinações necessárias para cada parâmetro de validação de acordo com diretrizes como ANVISA, ICH e FDA. 3) O documento fornece informações sobre como estabelecer a curva de calibração e avaliar sua linearidade para assegurar a

1. Validação de métodos cromatográficos Mestranda: ADRIANA ELIAS PIRES Orientadora: CLÁUDIA CARDOSO Departamento de Química – UFMS Campo Grande – MS, 2003

2. SINAIS

4. QUALIFICAÇÃO DO EQUIPAMENTO ANALÍTICO ESTABILIDADE DAS SOLUÇÕES ANALÍTICAS ICH TESTE DE ADEQUAÇÃO DO SISTEMA SELEÇÃO DA MATRIZ DETERMINAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS DE INTERESSE DETERMINAÇÃO DO SOLVENTE EXTRATOR, VOLUME DE SOLVENTE, MODO DE EXTRAÇÃO E TEMPO DE EXTRAÇÃO (n>3) RECUPERAÇÃO 4 CONC. EM TRIPLICATA MONITORAMENTO POR CLAE: CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS; CURVA DE CALIBRAÇÃO VALIDAÇÃO

5. Processo que fornece uma evidência documentada de que o método é confiável dentro de uma determinada faixa de aplicação que o analito será analisado. VALIDAÇÃO

8. PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO

9. ESPECIFICIDADE EXATIDÃO PRECISÃO LINEARIDADE FAIXA DE APLICAÇÃO LIMITE DE DETECÇÃO LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO ROBUSTEZ

11. EXATIDÃO Grau de concordância ou compatibilidade entre o valor médio dos resultados e o valor de referência aceito. Exatidão X Acurácia Exatidão = Conc. média experimental X 100% ANVISA Conc. aceita

13. EXATIDÃO Nº DE DETERMINAÇÕES: Três concentrações em triplicata: 80, 100 e 120% da concentração teórica da amostra . ANVISA, ICH Recuperação para resíduos: Três concentrações: 1L OQ, 2 LOQ e 10 LOQ . GARP CRITÉRIOS DE ACEITAÇÃO: Amostras, inclusive produtos farmacêuticos: 100  2% Impurezas: 0,1% absoluto ou 10% relativo J.of Chromatography A, 987 (2003) 57 Resíduos: 70 a 120% GARP Análises bioanalíticas:  15%, sendo no LQ  20%. ANVISA, FDA, ICH Traços  100ppb  60 a 110% J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., 19 (5) 737-757, 1996.  100ppb  80 a 100%  1ppm  70 a 120%

14. PRECISÃO Avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas do método. CV = DP x 100 ICH, ANVISA CMD onde, CV é o coeficiente de variação, DP é o desvio padrão e CMD, a concentração média determinada.

15. PRECISÃO 1. REPETITIVIDADE: Expressa precisão entre os resultados de medidas do mesmo método para a mesma amostra , no mesmo laboratório , pelo mesmo operador usando mesmo equipamento em um curto intervalo de tempo .

19. LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO Linearidade é a habilidade do método produzir resultados diretamente proporcionais à concentração do analito numa dada faixa de variação. Faixa de variação é o intervalo entre o maior e o menor níveis de analito que demonstra ser determinado com precisão, exatidão e linearidade usando o método como descrito.

21. LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO A linearidade pode ser demonstrada pelo exame visual do gráfico que relaciona os sinais obtidos na análise e a concentração do analito. A equação da reta é definida por: y = a x + b onde: y= resposta; x= concentração; a = coeficiente angular (inclinação/ sensibilidade ); b = coeficiente linear (intersecção no eixo y qdo x=0)

22. Curva de calibração: padrão externo  relaciona a resposta do aparelho com a massa do analito sem levar em conta a matriz. LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO Rev. Brasileira de Toxicologia. 11 (1) (1998) 1 e Q.B.Cass; A.L.G. Degani. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação.

23. Curva de calibração: padrão interno  cuja medida permite comparação relativa com o analito, sem interferir com a resposta deste. LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO Padrão interno: retenção próxima, boa resolução em relação ao analito, alta pureza e estabilidade. Rev. Brasileira de Toxicologia. 11 (1) (1998) 1 e Q.B.Cass; A.L.G. Degani. Desenvolvimento de métodos por HPLC: fundamentos, estratégias e validação. Y = A. analito A. p.interno X = C. analito

25. LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO REGRESSÃO LINEAR (método dos mínimos quadrados) : é uma forma de estimar qual a melhor reta que passa pelos pontos obtidos experimentalmente.

26. LINEARIDADE & FAIXA DE VARIAÇÃO COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO (r) : expressa a relação de x e y na curva, onde os valores ideais são 1 e –1. CRITÉRIO MÍNIMO ACEITÁVEL: = 0,99 ANVISA ;  0,999 FDA COEFICIENTE DE DETERMINAÇÃO (R) : r 2

27. LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LQ) É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.

29. 2. BASEADA NA RELAÇÃO SINAL-RUÍDO: procedimentos analíticos que exibem ruído de linha de base. Relação sinal-ruído típica é 10:1. ICH, ANVISA, FDA, USP LQ: FORMAS DE DETERMINAÇÃO

30. 3. BASEADA NO DESVIO PADRÃO DA RESPOSTA E NA INCLINAÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO. ICH, ANVISA LQ: FORMAS DE DETERMINAÇÃO LQ = 10 DP S onde DP é o desvio padrão da resposta e S é a inclinação da curva de calibração.

31. LIMITE DE DETECÇÃO (LD) É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser detectado, porém não necessariamente quantificado, sob as condições experimentais estabelecidas.

32. LIMITE DE DETEÇÃO FORMAS DE DETERMINAÇÃO: 1. BASEADA NA AVALIAÇÃO VISUAL ICH, ANVISA 2. BASEADA NA RELAÇÃO SINAL-RUÍDO. Relação sinal-ruído típica é 2 ou 3:1. ICH, ANVISA, FDA, USP 3. BASEADA NO DESVIO PADRÃO DA RESPOSTA E NA INCLINAÇÃO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO, ICH, ANVISA, USP LD = 3,3 DP I CH, USP ou LD = 3 DP ANVISA S S

33. ROBUSTEZ Um método robusto tem a capacidade de não ser afetado por uma pequena e deliberada modificação em seus parâmetros.

35. QUAIS OS PARÂMETROS DE VALIDAÇÃO REQUERIDOS???

36. Características de performance versus tipo de procedimento analítico pela ICH: sim não sim não Faixa de variação sim não sim não Linearidade não não sim não LQ não sim não não LD sim sim sim sim Especificidade sim sim não não sim sim não não Precisão Repetitividade P. Intermediária sim não sim não Exatidão Ensaios-limite Quantitativo Doseamento Testes de impurezas Identificação Procedimento analítico

37. Características de performance versus tipo de procedimento analítico pela USP: USP Pharmacopeia 24, 1999 * Pode ser requerido dependendo da natureza do teste. não * * sim sim Faixa de aplicação não * não sim não Linearidade não * não sim não LQ sim * sim não não LD sim * sim sim sim Especificidade não sim não sim sim Precisão não * * sim sim Exatidão Ensaios-limite Quantitativo Identificação características de performance (ex. dissolução) Impurezas ou produtos de degradação Principais componentes Procedimento analítico

39. FIM