Aula 2 - Validação de um método análitico

1. Prof. Bernardo Nicodemo Chimbuco, MSc.
Departamento de Ciências da Saúde,
Instituto Politécnico da URNM
AULA 2 - Validação de métodos analíticos
Tema I – Introdução à análise quantitativa
dos medicamentos

2. ✓ Parâmetros importantes na validação das
técnicas de análise.
✓ Definições e critérios estatísticos
para validar uma técnica ou método de
análise.
✓ Exemplo de um método analitico
validado.
Tópicos

3. ✓ Conhecer a definição de validação dos
métodos analíticos e sua importância no
campo farmacéutico.
✓ Conhecer os parámetros de validação de
um método analitico, sua definição,
procedimentos, assim como os seus
critérios estadísticos de aceitação dos
mesmos
OBJECTIVOS

4. Controlo de qualidade
Estudos de estabilidade
Estudos biofarmacéuticos
Funções do analista farmaceutico
Aula passada

5. Fases de desenvolvimento de um método
analítico.
✓ Requerimento de um método analítico:
✓ Posta a ponto do método analítico (estudos com Padrão
até a utilização do método em amostras reais).
✓ Definição dos parâmetros de idoneidade e validação do
método analítico (Quando dá resultados confiáveis).
1. Precisão exigível,
2. Sensibilidade desejável,
3. Grau de seletividade,
4. Tempo e o custo,
5. Tipos de instrumentos a utilizar.

6. Definição de Validação de uma técnica analítica e seus
critérios estatísticos.
“Associação Espanhola de Farmacêuticos industriais”
“Processo mediante o qual obtém-se provas documentadas
e demonstrativas de que um processo de fabricação ou
método de análise é confiável para produzir o resultado
previsto dentro de intervalos definidos”

7. O OBJETIVO DA VALIDAÇÃO DE UMA
TÉCNICA ANALITICA
Conhecer as características de funcionamento de
um método analítico.
1. O material a ser analisado.
2. Reagentes usados no processo de análise.
3. Materiais calibrados
4. Factores ambientais.
5. Analistas.
6. Instrumentos ou aparelhos.
FATORES QUE PODEM PROVOCAR VARIAÇÕES EM
UM MÉTODO ANALÍTICO:

8. Parâmetros para validar uma técnica analítica
❖ Linealidade
❖ Precisão
❖ Exatidão
❖ Especificidade
❖ Limite de detecção e quantificação.

9. LINEALIDADE
Capacidade de um método analítico de
obter resultados linearmente proporcionais
à concentração de analito na mostra dentro
de um intervalo determinado.

10. a) O intervalo linear dinâmico do
instrumento tem de ser mais amplo que
o intervalo de concentrações a estudar.
b) Preparar uma série de padrões de analito
de concentrações crescentes (O mais usual é
processar três curvas de calibrada).
FASES PARA DESENVOLVER O
ENSAIO

11. A seleção do intervalo de concentração varia em
dependência do objetivo do análise usando-se de
forma geral as seguintes regra:
❖ Matéria prima: Intervalo de concentração de 80-
120% da teórica.
❖ Princípio ativo em um produto acabado:
Intervalo de 50-150% da teórica.
❖ Impurezas e fluidos biológicos: 10-200% da
concentração média do analito em fluido biológico.
❖ Cada análise deve ser realizada de forma
duplicado.

12. ❖ Determinar a curva de calibrada que relacione a
resposta com a concentração
❖ A reta de calibrada é do tipo: E= mx + b.
✓ Sendo x a concentração, m o valor da
pendente e b o valor independente.
(Geralmente acha-se a reta de regressão pelo
ajuste dos mínimos quadrados).
❖ Tratamento estatístico dos dados analíticos.

13. ❖ Coeficiente de correlação linear, r = 0.999 ≈ 1
Esta variável reflete o grau de relação entre as variáveis
X e Y.
❖ Teste de linealidade: existem vários procedimentos
para verificar a linealidade, na presente conferência
se apresentam os de maior importância:
a) Coeficiente de variação dos fatores resposta,
CVf), Critério CVf 5%. Este fator é a relação
entre a leitura e a concentração.
B) Pendente relativa Sb rel (%). Critério Sb rel (%) 2%.
CRITÉRIOS ESTATÍSTICOS PARA
VALIDAR A LINEALIDADE

14. Definição: é o grau de concordância entre os
valores de uma série repetida de ensaios
analíticos efetuados sobre uma amostra
homogênea, ou expresso de outra forma: a
distribuição dos valores analíticos ao seu redor.
É a estimativa da variabilidade das medições.
Expressa a capacidade do método analítico para dar
resultados semelhantes quando se aplica
repetidamente a uma amostra.
PRECISÃO

15. ❖Repectibilidade
❖Precisão intermédia
❖Reprodutibilidade
PRECISÃO

16. • Mesma mostra,
• Mesmo analista,
• Mesmo laboratório,
• Mesmos aparelhos
• Mesmo reativos
• Mesma série de intervalo de tempo (geralmente o
mesmo dia). Cv= ≤1,5 %
PRECISÃO
REPETIBILIDADE: Medida da precisão de um
método efetuado nas mesmas condições como:

17. (1)utiliza-se 2 ou mais concentrações de uma amostra
homogénea, as quais serão analisadas 6 vezes
como mínimo em uma mesma corrida.
(2) preparam-se amostras de 3 concentrações
diferentes, uma inferior, meia e superior do
intervalo especificado e realizar 3 réplicas de cada
uma
(3) Realizar um mínimo de 6 determinações à
concentração do 100 %.
PROCEDIMENTOs:

18. ➢Precisão intermédia:
Medida da precisão dos resultados de um método analítico efetuado
sobre a mesma mostra, mas , em condições diferentes
❖ Dias
❖ Analistas
❖ Laboratório CV= ≤ 3%
❖ Reagentes
❖ Instrumentos
Procedimento:
Implementa-se um desenho onde se avaliarão 3 concentrações de uma
amostra (como mínimo) em duplicado, por ao menos 2 analistas
em 3 dias diferentes. recomenda-se, sempre que for possível, que
cada analista empregue instrumentos e materiais diferentes.

19. ➢ Reprodutibilidade
Implementa-se em forma de estudo
interlaboratorio.
Avaliam-se de 3 a 5 amostras (em um esquema de 2 a 4
concentrações por amostra) e duplicado, envolvendo
diferentes analistas, reativos e instrumentos em
cada laboratório.
As amostras devem ser analisadas no mínimo 6 ensaios
independentes.
➢ Critério CV= 3 %

20. Critérios estatísticos para avaliar a precisão.
A precisão se expressa matematicamente
pelo coeficiente de variação (CV).
O valor aceitável depende da concentração
do analito, do número de réplicas e até
do objetivo da análise
➢ Repetibilidade: Critério CV= 1.5 %
➢ Reprodutibilidade: Critério CV= 3 %
➢ Precisão intermédia CV=3%

21. EXATIDÃO
Indica a capacidade do método analítico para
dar resultados o mais próximos possíveis ao
valor verdadeiro, ou seja é a diferença entre o
valor achado na análise com o valor verdadeiro.
Se a diferença entre o valor achado e o valor
verdadeiro é mínima, então a técnica é exacta.
Se a diferença for grande significa que a técnica
não é exacta e revela a existência de enganos
que devem ser corrigidos.

22. PROCEDIMENTO
Existem vários procedimentos para avaliar a exatidão:
1.Análise repetitiva de uma amostra de concentração
única conhecida: Neste caso se utiliza um placebo ao
que lhe acrescenta uma concentração conhecida de
analito padrão. analisa-se de 6 a 10 vezes.
2. Análise repetitiva de várias amostras de
concentrações diferentes conhecidas:
Um desenho habitual utiliza 3 concentrações (alta,
media e baixa) dentro da fila de linealidade.

23. 3. Método de adição do patrão. Este método se utiliza
quando não se dispõe de um placebo ou de uma amostra
de concentração conhecida.
Para isso se processam duas mostra em paralelo a uma das
quais lhe adiciona uma quantidade conhecida de analito, este
constituirá o valor verdadeiro. A diferença de resultado de
“amostra –patrão” menos “ mostra” se compara com o valor
acrescentado.
4. Comparação com outro método validado: Poderá
implementar-se a concentração única ou em um intervalo
de 2 a 4 concentrações diferentes. Em qualquer caso se
analisarão as amostras 6 vezes como mínimo.
PROCEDIMENTO, CONT.

24. CRITÉRIOS ESTATÍSTICOS PARA AVALIAR A EXATIDÃO
Se expressa matematicamente em forma de percentagem
de recuperação ou em forma de diferença entre o
valor achado e o valor verdadeiro.
Formula de porcento de recuperação
% Real - experimental * 100% = 97%≈103%
Efetuar um teste para se determinar se o valor achado
e o valor verdadeiro não diferem significativamente para
um grau de probabilidade determinado.
X: % de Recuperado (Critério 97 % - 103 %)

25. Limite de detecção e Limite de quantificação:
São parâmetros que se relacionam com a
quantidade de analito que se necessita para dar um
resultado satisfatório qualitativo ou quantitativo.
❖ Limite de detecção: é a menor concentração de
analito detectável com certeza razoável por um
procedimento analítico feito.
Quer dizer é a quantidade ou concentração mínima de
analito a partir da qual é factível realizar a análise.
É um termo qualitativo.

26. Limite de detecção e Limite de
quantificação:
❖ Limite de quantificação: é a menor concentração ou QL
de analito de uma amostra que pode ser determinada com
aceitável precisão e exatidão sob as condições
experimentais estabelecidas.
É um termo quantitativo.

27. PROCEDIMENTOS:
Métodos apoiados na separação do padrão, da resposta e no
pendente.
✓ (LD) Concentração de analito que produz um sinal igual
a três vezes a separação padrão do branco (critério 3LD da
IUPAC)
✓ Limite de quantificação (LQ): concentração de analito que
produz um sinal igual a dez vezes a separação padrão do
branco sob as condições experimentais ótimas.

28. O limite de detecção (LD) ou quantificação
(LQ) pode ser expresso como:
Onde:
Cl=Limite de detecção ou quantificação.
K= constante (K=3,3para limite de detecção e
K=10 para limite de quantificação)
Sbl=desviação padrão da resposta.
b=pendente da reta calibrada.

29. Especificidade
Definição
É o grau de selectividade de método analítico para
medir especificamente um analito em presença de
outro componente dessa amostra.
Ou seja Capacidade de um método analítico para
medir exata e especificamente o analito, sem
interferências de impurezas.

30. Procedimento
A seletividade de um método analítico se determina
comparando os resultados da análise de amostras contendo
impurezas, produtos de degradação, substâncias relacionadas ou
excipientes com os resultados da análise de amostras que não
contêm estas substâncias.
EXEMPLOS
❖ Métodos de Identificação: Deve demonstrar que o método
funciona em presença de outras substâncias que podem
interferir e as de composição similar.
❖ Ensaios de impurezas: Deve garantir que o método
analítico permite uma avaliação das impurezas que se
pretendem analisar qualitativa e quantitativamente.

31. Especificidade
❖ Ensaios biofarmacéuticos: Deve assegurar que a
resposta do método corresponde somente ao analito sem
interferências de metabolitos, substâncias endógenas,
outros fármacos, etc.

32. Exemplo de uma técnica analítica validada:
(O importante é mostrar os resultados de cada parâmetro para sua
interpretação).
Determinação do Flavonoides em plantas utilizando a Quercetina
Como Padrão:
Pesaram-se 1,5 mg de quercetina, a qual foi dissolvida
com ajuda de um banho ultra-sônico em acetato de etilo,
l evada a um balão de ensaio 10 mL e igualada com o
mesmo dissolvente.
Desta dissolução, se tomou 100 µL e transferiu-se a
um balão de ensaio de 5 mL e foi adicionado 200 µ L
de uma dissolução de tricloreto de alumínio
preparada aos 2% com uma dissolução de ácido
acético em metanol aos 5%.

33. Exemplo de técnica analítica validada.
Completou –se o volume com a dissolução de ácido
acético em metanol 5% e se realizou uma leitura
espectrofotométrica a 365nm.
Amostra: Concentrado de flavonoides obtidos
através de várias extrações com acetato de
etilo na planta.

35. ➢ Repetibilidade: Critério CV= 1.5 %
➢ Reprodutibilidade: Critério CV= 3 %
➢ Precisão intermédia CV=3%

39. A falta de especificidade de um método não
implicará sua invalidação para o uso proposto,
mas sim requererá a utilização de um
procedimento complementar que garanta a
especificidade do mesmo.
CONSIDERAÇÕES IMPORTANTES