This document summarizes the key points of hemocyanin, an oxygen-transport metalloprotein found in some arthropods and mollusks. It contains two copper atoms that reversibly bind to oxygen. The deoxygenated form is colorless and the oxygenated form is blue. It has been crystallized from various species and its basic structural unit is a hexamer of subunits.

1. Trabalho realizado por:
João Ribeiro
Nuno Bastos
Grupo 4 P5
Química Bioinorgânica
Licenciatura em Bioquímica
Ano lectivo 2012/2013

2. Traços Gerais
A hemocianina é uma metaloproteína cuja principal função
é transportar o oxigénio em alguns artrópodes e moluscos.
• Contém 2 átomos de cobre que se
ligam reversivelmente ao O2.
• Encontra-se suspensa na hemolinfa.
• A forma desoxigenada é incolor e a
forma oxigenada é azul.

3. Por estar presente nas mais diversas espécies
de moluscos e artrópodes, através do PDB,
encontram-se várias estruturas, obtidas por
cristalografia de raios-X da hemocianina. Cada uma
das estruturas está associada a uma única espécie.
Citar-se-ão as estruturas que têm como
identificação 1OXY, 1NOL e 1LLA, por serem as
primeiras a serem inseridas no PDB, ou seja, que
representam os primeiros estudos cristalográficos
desta proteína.
Traços Gerais

4. As hemocianinas fazem parte do grupo das proteínas de cobre de tipo III
do qual também pertencem, por exemplo, a catecol oxidase e a tirosinase.
Alinhamento das sequências de aminoácidos dos sítios
activos da catecol oxidase da batata doce, tirosinase humana
e hemocinina do caracol (adaptada de Eicken et al, 1999).
Centro activo de várias proteínas de cobre do tipo
III: A e C correspondem à hemocianina de límulo e
polvo-gigante-do-pacífico, respetivamente; B,
catecol oxidase de batata doce e D tirosinase de
um microorganismo (Li et al, 2009)
Traços Gerais

5. A unidade básica de organização das hemocianinas é um conjunto de
seis subunidades, com um peso aproximado de 450000 Da.
A hemocianina circulante pode ser composta por uma, duas, quatro ou
oito desses hexâmeros, pelo que o seu peso é crescente e a sua solubilidade é,
consequentemente, maior.
x6
Traços Gerais

6. Hemocianina de Limulus polyphemus. A sua estrutura
secundária é 33% α-hélices , 18% folhas-β, 19% β-turn e
30% sem estrutura específica.Incorpora um centro de
cobre binuclear do tipo III. Rasmol, 1OXY
Centro ativo da Hemocianina de
Limulus polyphemus. Composta por dois átomos de
cobre, assinalados a amarelo, estando no centro a
molécula de oxigénio. A amarelo estão
representados os resíduos de Histidina que
coordenam com os centros metálicos, pelo átomo de
azoto. DeepView, 1OXY
Estrutura da proteína e do centro
ativo

7. Na forma desoxigenada, os iões
cobre estão sob a forma de Cu+.
Geometria do centro metálico
Desdobramento de orbitais,
para um complexo de
geometria trigonal plana
d¹⁰
transições d-d proibidas por spin
Orbitais completamente preenchidas
Complexo incolor

8. Os centros de cobre(I) na desoxihemocianina têm uma geometria trigonal
planar com 3 ligações Cu-N(His).
Há 2 estruturas cristalinas (R e T) da desoxihemocianina que diferem em
grande parte na distância Cu-Cu e na distorção piramidal desta geometria.
Estado T - tensoEstado R - relaxado
Formas R e T

9. A ligação reversível ao oxigénio é feita através de um
centro de cobre binuclear geralmente referido como centro de
cobre de ‘tipo III’.
Mecanismo de transporte

10. Durante a coordenação do O₂,
há uma reorientação dos ligandos que
altera a geometria de coordenação
para piramidal quadrada. Esta
alteração do campo de ligando altera
e destabiliza as orbitais ativas do
cobre, favorecendo a transferência
eletrónica.
Mecanismo de transporte

11. Ligação/ Libertação do O₂

12. ΔH
Ligação/ Libertação do O₂

13. Na oxihemocianina os dois iões cobre estão sob
a forma Cu2+, levando a que o O₂ seja reduzido pelos 2
eletrões, para O₂²¯.
No complexo binuclear, ambos os cobres(II) têm
um geometria piramidal quadrada com duas ligações de
2,0 Å a 2 histidinas, pelo átomo de azoto, no plano
equatorial. Cada uma das outras histidinas está em
posição trans-axial aos centros de cobre a uma distância
de 2,4 Å.
Alterações Estruturais

14. Estrutura do sítio ativo da
oxihemocianina da espécie L.
polyphemus. Os azotos ligados
directamente ao centro de cobre
estão numerados. Os mais
distanciados são os ligandos trans-
axiais. Rasmol, 1OXY.
Estrutura do sítio ativo da
desoxihemocianina da espécie L.
polyphemus. Rasmol, 1LLA.
Alterações Estruturais

15. O espectro de absorção da oxihemocianina exibe
uma transição muito intensa a 350 nm (ε≈20000
M¯¹cm¯¹) e uma banda mais fraca a 550 nm (ε≈
1000 M¯¹cm¯¹) que são atribuídas às transferência
de carga Ligando-Metal, O₂²¯ Cu(II)
Geometria do centro metálico

16. A banda de maior energia é atribuída à
transição πσ*(O2
2-) dx2-y2 (Cu(II)) e a mais
baixa à transição πv*(O2
2-) dx2-y2(Cu(II)),
onde πσ* é a orbital da espécie O2
2- no plano
Cu₂O₂ (ligação σ aos centros metálicos de
Cu(II)) enquanto a orbital πv* é
perpendicular a esse plano.
Geometria do centro metálico

17. EPR- Silencioso na forma oxigenada
e desoxigenada
EXAFS
Distância entre catiões de cobre
Oxihemocianina - 3,6 Å
Desoxihemocianina - 3,5 a 4,6 Å
Esfera de coordenação
Oxihemocianina - 3 átomos de azoto e 2
àtomos de oxigênio
Desoxihemocinanina - 3 átomos de
azoto
Oxihemicianina
Desoxihemocianina
Ressonância Paramagnética Eletrónica (EPR) e
Espetroscopia Alargada da Estrutura Fina de
Absorção de Raios X (EXAFS)

18. • Theodor Svedberg
Descobriu a metaloproteína na espécie de
caracol, Helix pomatia.
• Anne Volbeda
Primeira investigadora a estudar a estrutura
da hemocianina.
• Edward Solomon
Principal investigador da geometria do centro
metálico da Hemocianina.
Principais
Investigadores

19. A KLH, Keyhole Limpet Hemocyanin, é uma metaloproteína,
composta por várias subunidades da hemocianina, encontrada
na hemolinfa do molusco californiano, Megathura crenulata.
Megathura crenulata, molusco de
onde é retirado a KLH.
Aplicações
Biotecnológicas
Aplicações:
• Transporte de proteínas
• Terapia em cancro

20. • Sullivan B., Bonaventura J., Bonaventura C., Functional Differences in the Multiple Hemocyanins of the Horseshoe
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Referências Bibliográficas