C neoformans e linfócitos B
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Este documento resume um estudo sobre a resposta de linfócitos B induzida por polissacarídeos de formas MAT alfa e MAT a de Cryptococcus neoformans em camundongos. Os principais achados são: (1) Os polissacarídeos induziram proliferação de linfócitos B e produção de IgM em cultura; (2) Camundongos imunizados produziram anticorpos específicos, principalmente IgG1 e IgG2b; (3) A resposta variou entre linhagens de camundongos e entre as form
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- 1. Adila Regina Trubat Santos Rodrigues Orientadora: Dra. Lígia Maria Torres Peçanha Laboratório de Imunoparasitologia Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes Estudo da resposta de linfócitos B murinos induzida por polissacarídeos de formas MAT alfa e MAT a de Cryptococcus neoformans. Universidade do Brasil -UFRJ
- 2. Cryptococccus neoformans • Animais Phascolarctos cinereus Tursiops truncatus Columba livia • Ambiental - árvores e solo Eucalyptus calmulidensis Araucaria augustifolia
- 3. Patógeno oportunista •Infecção por inalação de esporos ou leveduras •Meningoencefalite •Lesões de pele Anfotericina B e fluconazol
- 4. Fatores de virulência NENHUMA INTERVENÇÃO TERAPÊUTICA BASEADA NA INTERFERÊNCIA DOS FATORES DE VIRULÊNCIA FOI ATÉ AGORA DESCRITA Produção de cápsula Prototrofia - fenoloxidase e produção de melanina Conjugação
- 6. Composição da cápsula GXM é o componente em maior abundância na cápsula, compreende um polímero de aproximadamente 1 milhão de daltons e é composto por um esqueleto de manose, com substituições de ácido glucorônico e xilose
- 7. A galactoxilomanana é um polímero que consiste em um esqueleto de galactose com cadeias laterais trímeras de galactose e manose. Cada cadeia lateral da GalXM sustenta entre um e três resíduos de xilose Composição da cápsula
- 8. Composição da cápsula Manoproteína – xilose, galactose e manose
- 9. Atividades Imunobiológicas Glucoronoxilomanana (GXM) •Antifagocítica - Anti opsonizante •Cápsula aumenta a produção de IL 10 •Decréscimo da expressão de MHC II e B7 •Aumento da produção de óxido nítrico na presença de Ac •Ativa complemento •Suprime Ac •Produção de TNF alfa (GalXM)
- 10. Atividades Imunobiológicas Manoproteína •Induz TNF por macrófagos •Induz IL 12 •Induz IFNγ •Componente protetor
- 20. Kuong-Chung et al, Mycology, 1992, 60:602-605 Mat α é mais virulento que Mat a
- 23. Th1 X Th2
- 24. •Liga C3 nos não encapsulados •Presença de IgG e IgM em níveis normais não são suficientes para iniciar ativação •Importante na opsonização Complemento
- 25. Papel Protetor dos Anticorpos Administração de mAbs para cápsula prolonga a sobrevivência: •Eficiência de isotipos: •IgG2a>IgG1>IgM •IgA>IgG2b>>IgG3 •IgG3 não protetor ou potencia a doença; •Mudança de IgG3 para IgG1 confere proteção
- 26. Células B Linhagens de camundongos que montam respostas de anticorpos mais intensas são mais resistentes à infecção com C. neoformans Linhagens de camundongos deficientes de células B (como a CBA/N) são mais susceptíveis à infecção com o fungo. Neuville et al. 2000; 68: 3724-3726. Dromer et al. Immunogenetics 1988; 28: 417-424. Marquis et al. Infect Immun. 1985. 47(1):288-93
- 27. Objetivos •Verificar o efeito imunomodulador de polissacarídeos sobre a resposta de linfócitos B in vivo e in vitro. •Caracterizar a resposta in vivo induzida por polissacarídeos purificados de C. neoformans em relação aos isotipos induzidos e a seu efeito imunizante e protetor. •Comparar da resposta induzida in vivo por polissacarídeos isolados de amostras MAT alfa e MAT a.
- 29. Metodologia B-3501 - WT, tipo conjugativo alfa (MAT alfa ) C.neoformans var. neoformans - sorotipo D B-3502 - WT, tipo conjugativo a (MAT a) Os fungos Kuong-Chung et al, Mycology, 1992, 60:602-605
- 30. Os animais BALB/c - Th1C57Bl/6 - Th2
- 31. Metodologia ELISA para avaliação da produção de IgM Medida da proliferação de linfócitos B por incorporação de timidina Linfócitos B em cultura estimulados ou não com polissacarídeos de C. neoformans MAT a e MAT alfa , LPS e anti-IgD-Dextrana Isolamento de linfócitos B de baços de camundongos normais C57Bl/6 e BALB/c
- 32. 0 1 10 0 1 10 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 LPS Meio Dose do conjugado 3501 (Mat alfa) 0 1 10 0 1 10 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 DEX Meio Dose do conjugado 3501 (Mat alfa) 0 1 10 0 1 10 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 LPS Meio Dose do conjugado 3502 (Mat a) 0 1 10 0 1 10 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 DEX Meio Dose do conjugado 3502 (Mat a) IncorporaçãodeTimidinaTritiada(cpm) Medida da proliferação de linfócitos B por incorporação de timidina BALB/c
- 33. 0 10 1 1 10 1 0 5000 10000 15000 20000 25000 LPS Meio Dose polissacarídeo 3501 (Mat alfa) 0 10 1 0 10 1 0 5000 10000 15000 20000 25000 DEX Meio Dose do polissacarídeo 3501 (Mat alfa) 0 10 1 0 10 1 0 5000 10000 15000 20000 25000 LPS Meio Dose do polissacarídeo 3502 (Mat a) 0 10 1 0 10 1 0 5000 10000 15000 20000 25000 DEX Meio Dose do polissacarídeo 3502 (Mat a) IncorporaçãodeTimidinaTritiada(cpm) Medida da proliferação de linfócitos B em cultura por incorporação de timidina C57Bl/6
- 34. 0 1 10 0 1 10 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 14000 15000 LPS Meio Dose do Conjugado 3501 (Mat alfa) 0 1 10 0 1 10 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 14000 15000 LPS Meio Dose do Conjugado 3502 (Mat a) 0 1 10 0 1 10 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 14000 15000 DEX Meio Dose do Conjugado 3501 (Mat alfa) 0 1 10 0 1 10 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 14000 15000 DEX Meio Dose do Conjugado 3502 (Mat a) ConcentraçãodeIgMnosobrenadantedecultura(ng/ml) Produção de IgM em sobrenadante de cultura de linfócitos B BALB/c
- 35. 0 1 10 0 1 10 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 14000 15000 LPS Meio Dose do Conjugado 3501 (Mat alfa) 0 1 10 0 1 10 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 14000 15000 LPS Meio Dose do Conjugado 3502 (Mat a) 0 1 10 0 1 10 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 14000 15000 DEX Meio Dose do Conjugado 3501 (Mat alfa) 0 1 10 0 1 10 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 12000 13000 14000 15000 DEX Meio Dose do Conjugado 3502 (Mat a) ConcentraçãodeIgMnosobrenadantedecultura(ng/ml) Produção de IgM em sobrenadante de cultura de linfócitos B C57Bl/6
- 36. Imunização de camundongos C57Bl/6 e BALB/C com polissacarídeos de C. neoformans de Mat alfa e Mat a (50µg/animal i.p.) Obtenção de soros Realização de testes ELISA: cinética de produção de IgM específica para as frações da cápsula de C. neoformans Metodologia Realização de testes ELISA: mapeamento da produção de isotipos de imunoglobulinas específicas para as frações da cápsula de C. neoformans 14 dias7,14 e 21 dias
- 37. 3501 3502 BALB/c C57Bl/6 Cinética de produção de IgM em animais imunizados 8 15 21 0 20 40 60 80 100 8 15 21 0 20 40 60 80 100 8 15 21 0 20 40 60 80 100 8 15 21 0 20 40 60 80 100 BA C D ND Dias após a imunização (34) (9) (19) (<10) (<10) (<10) (<10) (14) (69) (19) (18)
- 38. Produção de isotipos de imunoglobulinas específicas para as frações de cápsula de C. neoformans BALB/c imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 350 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 imune 01 imune 02 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 700 IgM imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 350 IgG1 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 IgG2b imune 01 imune 02 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 IgG3 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 700 Títuloséricodeanticorposanti-polissacarídeo A B C D E F G H Tipo de Antígeno usado na imunização (21) (>10) (>10) (>10) (>10) (>10) (>10) (>10)(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)(>10)(>10) (41)
- 39. Produção de isotipos de imunoglobulinas específicas para as frações de cápsula de C. neoformans C57Bl/6 IgM imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 350 IgG1 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 IgG2b imune 01 imune 02 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 IgG3 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 700 IgG2a imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 Títulosséricosdeanticorposanti-polissacarídeo imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 350 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 700 imune 01 imune 02 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 F A B C D E JIHG Tipo de Antígeno usado na imunização ND ND ND ND (>10) (>10)(>10) (39) (50) (31) (34) (16) (13) (11) (<10) (100) (54) (32) (20) (>10)
- 40. Infecção de camundongos C57BL/6 e BALB/C com C. neoformans MAT alfa e MAT a (1x105 leveduras/animal i.v.) Avaliação da carga fúngica por unidades formadoras de colônias nos pulmões, baço cérebro e sangue. Avaliação de isotipos de imunoglobulinas Metodologia
- 41. Perfil de infecção com cepas 3501 (MAT alfa) ou 3502 (MAT a) de C. neoformans – BALB/c Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 NúmerodeColônias A B C D (0)(10,7) (7,2) (0,25) (7,7) (0) (0) (0) (1,7) (23,2) (0) (0) (1,0) (0,25) (0) (0) D
- 42. C D A B (0)(2,3)(0,4)(0,6) (0)(2,2)(0,7)(23,7)(220,8) (3,2) (10,5) (0) (1814) (46,9) (2,4) (0) Perfil de infecção com cepas 3501 (MAT alfa) ou 3502 (MAT a) de C. neoformans – C57Bl/6 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 1000 2000 3000 4000 5000 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 1000 2000 3000 4000 5000 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 1000 2000 3000 4000 5000 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 1000 2000 3000 4000 5000 NúmerodeColônias
- 43. infect alfa infect a 0 50 100 150 200 250 300 350 infect alfa infect a 0 100 200 300 400 500 600 infect alfa infect a 0 100 200 300 400 500 600 700 infect alfa infect a 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 IgM infect alfa infect a 0 50 100 150 200 250 300 350 IgG1 infect alfa infect a 0 100 200 300 400 500 600 IgG2b infect alfa infect a 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 IgG3 infect alfa infect a 0 100 200 300 400 500 600 700 Títulosséricosdeanticorposanti-polissacarídeo A B C D E F G H Tipo de forma conjugativa do fungo usada na infecção (>10) (>10)(>10)(>10)(>10)(>10)(>10) (>10) (>10) (>10) (>10) (27) (40) (34) (50) (17) Produção de imunoglobulinas em animais infectados – BALB/c
- 44. A B C D E F G H I J IgM infect alfa infect a 0 50 100 150 200 250 300 350 IgG1 infect alfa infect a 0 100 200 300 400 500 600 IgG2b infect alfa infect a 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 IgG3 infect alfa infect a 0 100 200 300 400 500 600 700 IgG2a infect alfa infect a 0 50 100 150 200 250 300 Títulosséricosdeanticorposanti-polissacarídeo infect alfa infect a 0 50 100 150 200 250 300 350 infect alfa infect a 0 100 200 300 400 500 600 infect alfa infect a 0 50 100 150 200 250 300 infect alfa infect a 0 150 300 450 600 750 infect alfa infect a 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 Tipo de forma conjugativa do fungo usada na infecção (37) (>10) (>10) (>10) (>10)(>10)(>10)(>10) (>10)(>10) (61) (24) (24) (50) (39) (75) (48) (14) (21) (18) Produção de imunoglobulinas em animais infectados – C57Bl/6
- 45. Imunização de camundongos C57/B6 e BALB/C com polissacarídeos de C. neoformans de Mat alfa e Mat a (50µg/animal i.p.) Desafio com C. neoformans Mat alfa e Mat a (105 leveduras i. v.) Avaliação da carga fúngica por unidades formadoras de colônias nos pulmões, baço e cérebro. Avaliação de isotipos de imunoglobulinas Metodologia 15 dias 21 dias
- 46. Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 NúmerodeColônias CBA FED (0)(0)(3,3)(6,3) (0) (0) (0) (0) (0) (0) (0)(1)(0)(0)(23,5)(1,7) (0)(0)(0,6)(1) (0,6)(0)(0)(0,25)(1) Carga fúngica em camundongos BALB/c imunizados com polissacarídeos e posteriormente infectados
- 47. Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 Cérebro Pulmão Baço Sangue 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 NúmerodeColônias CBA FED (0) (0) (0) (0) (0) (0) (0)(0)(0)(0)(0) (0,5)(0,5)(0,4) (2,3)(0) (1808) (46,9) (2,4) (0) (371,3) (121,7) (7,3) (3,5) Carga fúngica em camundongos C57Bl/6 imunizados com polissacarídeos e posteriormente infectados
- 48. Produção de isotipos de imunoglobulinas em animais imunizados e posteriormente infectados com C. neoformans BALB/c
- 49. IgM imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 350 IgG1 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 IgG2b imune 01 imune 02 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 IgG2b IgG3 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 700 IgG3 imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 350 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 700 imune 01 imune 02 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 Títulosséricosdeanticorposanti-polissacarídeo imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 350 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 imune 01 imune 02 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 700 imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 350 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 700 imune 01 imune 02 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 Tipo de antígeno usado na imunização BA C D HGFE I J K L PO NM (>10) (15) (14) (>10) (>10) (>10) (>10) (27) (>10) (23) (>10) (>10) (45) (102) (359) (54) (>10)(20) (>10) (>10) (>10) (>10) (66) (>10) (10)(>10) (>10) (>10) (14) (25) (282) (70)
- 50. Produção de isotipos de imunoglobulinas em animais imunizados e posteriormente infectados com C. neoformans C57Bl/6
- 51. IgM imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 350 IgG1 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 IgG2b imune 01 imune 02 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 IgG3 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 700 IgG2a imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 350 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 700 imune 01 imune 02 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 350 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 imune 01 imune 02 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 700 imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 Títulosséricosdeanticorposanti-polissacarídeos imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 350 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 imune 01 imune 02 0 50 100 150 200 250 300 imune 01 imune 02 0 100 200 300 400 500 600 700 imune 01 imune 02 0 150 300 450 600 750 900 1050 1200 1350 1500 F JG H I A EB C D K OL M N P TQ R S Tipo de antígeno usado na imunização (79)(171)(72)(532) (56) (111)(167) (104) (93) (101) (<10)(40)(16)(21)(10) (37) (26)(14)(50)(58) (<10)(<10)(59)(<10)(51)(19) (<10)(86) (<10)(<10) (46)(<10)(46)(<10)(17)(<10)(<10)(<10)(35)(26)
- 52. Perfil de tamanho e granulosidade – 10 dias de infecção ( x = 1,51) ( x = 3,36) ( x = 2,58)
- 53. Perfil de tamanho e granulosidade – 17 dias de infecção ( x = 0,96) ( x = 1,74) ( x = 0,73)
- 54. CONCLUSÕES
- 55. Proliferação de Linfócitos B em Cultura • Os polissacarídeos de cápsula não induzem isoladamente a proliferação de células B de camundongos BALB/c e C57BL/6; • Os polissacarídeos aumentam a resposta proliferativa de células de camundongos BALB/c induzida por LPS, mas não por anti- IgD-Dextrana. Produção de IgM em Cultura • Os polissacarídeos parecem potenciar a produção de IgM em C57Bl/6 estimulados por LPS. Efeito semelhante ocorre em BALB/c, porém em menor magnitude.
- 56. Cinética da produção de IgM Sérica na imunização • Animais BALB/c imunizados apresentam uma cinética de produção de IgM mais lenta ao 3501, e não respondem ao 3502; • Animais C57BL/B6 imunizados com polissacarídeos de 3501 ou 3502 têm uma resposta mais rápida para o polissacarídeo de 3502 Isotipos de imunoglobulinas séricas na imunização • C57BL/B6 imunizados respondem mais fortemente que BALB/c aos polissacarídeos de 3501 e 3502 (IgM, IgG2a e IgG2b);
- 57. Perfil de infecção • BALB/c tem maior resistência à infecção tanto para as formas MAT alfa, quanto para as formas MAT a; • C57Bl/6 infectados com MAT alfa apresentam infecção maciça do tecido cerebral. Isotipos de imunoglobulinas séricas na infecção • BALB/c praticamente não produzem anticorpos reativos contra as cepas 3501 e 3502; • C57Bl/6 produzem títulos baixos de anticorpos contra 3501
- 58. Isotipos de imunoglobulinas séricas na imunização e posterior infecção • BALB/c produzem resposta muito baixa, sendo detectável IgG3 contra 3501 (imunização e infecção) • C57Bl/6 produzem títulos mais altos, principalmente contra 3501, independente do polissacarídeo da imunização prévia. Perfil de granulosidade e tamanho de células esplênicas • Foi detectado no baço de animais infectados com a forma MAT alfa o aparecimento de uma população de alta granulosidade.
- 59. Não parece haver correlação entre a resistência de BALB/c e a produção de anticorpos O aumento da resistência de C57Bl/6 ocorre paralelamente a uma maior produção de anticorpos