O documento discute a produção de plantas transgênicas através de técnicas de transformação genética como Agrobacterium e biobalística. Ele também descreve a construção gênica envolvendo promotores, genes de seleção e análises de biossegurança como Southern blot e sequenciamento para verificar a inserção do transgene.

1. Introdução a Tecnologia do
rDNA e Produção de Plantas
Transgênicas
Caracterização do Transgene
e Estrutura do locus
Andréa A. Carneiro

2. PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS
Agrobacterium
Biobalística

3. PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS
Agrobacteria
Biobalística

4. PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS
Agrobacteria
Biobalística

5. PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS
Agrobacteria
Biobalística

6. PRODUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS
Agrobacteria
Biobalística

7. Agrobacterium tumefaciens TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS
plasmídeo “Ti”
(tumor inducer)
célula transformada
TRANSGÊNICA !
célula da planta
“GALHA DA COROA”
crescimento acelerado e
desordenado do tecido TUMORIZAÇÃO

8. Transformação Genética de Plantas
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium 4.Transferência do
T-DNA para a célula
vegetal
Plasmídeo Ti 2.Ativação dos
genes vir
EE ED
Ti
Genes vir 3.Cópia e
T-DNA
excisão
Genes Vir
do T-DNA
att, chvA, B, E, pscA
CROMOSSOMA BACTERIANO

9. Transformação por
Agrobacterium spp.
Casa de
vegetação
co-cultivo
calo
plaqueamento
(eliminação
Agrobacterium) indução e regeneração
seleção

10. Transformação Genética de Plantas
Transferência Direta de DNA
• Microinjeção
• Transformação de protoplastos via
polietileno glicol
• Eletroporação
• Fibrilas de carboneto de silício
• Bombardeamento de Partículas
Ponto comum: Fatores físicos ou químicos
facilitam a entrada do DNA na célula vegetal

11. Transformação Genética de Plantas
Transferência Direta de DNA
Bombardeamento de Partículas
Microcarreador
Material
Genético
Célula

12. BIOBALÍSTICA (“gene gun”)
Tubo de
aceleração
de gás
Disco de
ruptura
Aparato para Macrocarreador
disparo dos
microcarreadores
Tela de
Microcarreadores anteparo
cobertos
com DNA
Tecido alvo

13. Transformação Genética de Plantas
CONSTRUÇÃO GÊNICA
• Genes – Uma região de DNA que codifica para a
produção de uma proteína ou característica
• Rede interativa - DNA, RNA e proteínas

14. Transformação Genética de Plantas
CONSTRUÇÃO GÊNICA
• Transgenes – genes manipulados através das técnicas
de DNA recombinante (rDNA)
– Obtidos de organismos doadores (vírus, bactérias,
fungos, vegetais e animais)
– Sintetizados “in vitro”
– Genes provenientes do mesmo organismo (cisgênico)
ou de organismos diferentes (transgênico)
– Transgênico pode ser produzido pela adição,
deleção, iRNA.

15. Evento Características
T25 Tolerância ao herbicida glufosinato de amônio
MON 810 Resistência a insetos da ordem Lepidóptera
BT11 Resistência a insetos da ordem Lepidóptera e tolerância ao
herbicida glufosinato de amônio
NK 603 Tolerância ao herbicida glifosato
GA21 Tolerância ao herbicida glufosinato de amônio
HERCULEX Resistência a insetos da ordem Lepidóptera e tolerância ao
herbicida glufosinato de amônio
MIR162 Resistência a insetos da ordem Lepidóptera
MON 810 x Resistência a insetos da ordem Lepidóptera e tolerância ao
NK603 herbicida glifosato
BT11 x Resistência a insetos da ordem Lepidóptera, tolerância aos
GA21 herbicidas glifosato e glufosinato de amônio
MON89034 Resistência a insetos da ordem Lepidóptera
TC1507 x Resistência a insetos da ordem Lepidóptera, tolerância aos
NK603 herbicidas glifosato e glufosinato de amônio

16. Transformação Genética de Plantas
CONSTRUÇÃO GÊNICA
PROMOTOR REGIÃO CODIFICADORA TERMINADOR
Localização: Célula, tecido, órgão
Estágio de Desenvolvimento Final do Processo
Quantidade produzida
35S; Ubiquitina; Actina NOS; polyA 35S
Proteína
cry; vip; epsps

17. Transformação Genética de Plantas
CONSTRUÇÃO GÊNICA - Promotor
Promotor uidA (GUS) NOS

18. NcoI BamH
1.893 kb
I
cry1C (codon
optimized)
HindIII BglII EcoRI
d35S AMV NOS-Ter
promoter

19. Transformação Genética de Plantas
CONSTRUÇÃO GÊNICA

20. Transformação Genética de Plantas
CONSTRUÇÃO GÊNICA

21. Transformação Genética de Plantas
CONSTRUÇÃO GÊNICA

22. Transformação Genética de Plantas
CONSTRUÇÃO GÊNICA

23. Transformação Genética de Plantas
Biossegurança – Análises Moleculares

24. Biossegurança – Análise Moleculares
Transgene e vetores
 Qual o método de transformação foi utilizado?
– Foi considerado os riscos de cada método?
– Foi utilizado todo o vetor ou apenas partes?
 Quais são os principais transgenes presentes no
evento?
 Resistência a insetos / Genes cry
 Tolerância a herbicidas / Genes epsps

25. Biossegurança – Análise Moleculares
Transgene e vetores
 Quais os organismos foram os doadores de genes?
 Organismo diferente?
 Mesmo organismo?
 Removido do seu contexto fisiológico, o gene se torna
um rDNA com todos os riscos associados de qualquer
rDNA.

26. Biossegurança – Análise Moleculares
Transgene e vetores
 Os genes foram manipulados criando fusões entre diferentes genes
ou tiveram alguma parte sintetizadas in vitro?
 Transgene pode ter sido modificado para ser expresso de
maneira mais eficiente (codon usage)
 Recodificados ao nível dos nucleotídeos para ter um codon
preferido pelo organismo recipiente.
 Ex: genes cry de Bacillus foram recodificados resultando em um
aumento de 100X de expressão (Trends Biotechnol. 2004. 22, 346-353)
Milho AGG – Arginina (14,8%)
Milho CGA - Arginina (4,3%)

27. Biossegurança – Análise Moleculares
Transgene e vetores
 Quais os genes foram utilizados para a seleção das
células modificadas?
 Resistência a antibióticos – nptII –kan; bla - amp
 Tolerância a Herbicida epsps –glifosato; pat e bar -
glifosinato
 O gene de seleção foi retirado? Como?
 Seleção de progênie
 Recombinase
 Como foi confirmado a remoção?
 Southern blot, PCR

28. Biossegurança – Análise Moleculares
Transgene e vetores
 A sequência do transgene e o mapa de restrição são
equivalentes?
 Dados de sequenciamento mostrando:
 O sítio de inserção do transgene no cromossomo
 A sequência que foi inserida
 As sequências flanqueando o transgene
 Foi verificado a ausência de outras integrações,
completa ou parcial?

29. Biossegurança – Análise Moleculares
Transgene e vetores
 Foi verificado rearranjamentos nos cromossomos?
 Qual o número de cópias do transgene presente no
evento gerado?
 Houve integração de sequências estruturais do vetor?

30. Transformação Genética de Plantas
Biossegurança – Análises Moleculares
EcoRI AluI EcoRI
GAATTCCGTAATCGCCATGGTAGCTGGCGAATTCGGGAATG

31. Transformação Genética de Plantas
Biossegurança – Análises Moleculares
Southern blot
PCR
Sequenciamento

33. Mapa de Restrição

34. Biossegurança
Genoma
Transcriptoma, Proteoma e Metaboloma
Saúde humana e animal
Meio ambiente
Biosafety Assessment Tool
https://bat.genok.or/bat/

35. OBRIGADA!
Andréa A. Carneiro
andreac@cnpms.embrapa.br