Carregado porSofia Iba
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O documento discute a produção de plantas transgênicas através de técnicas de transformação genética como Agrobacterium e biobalística. Ele também descreve a construção gênica envolvendo promotores, genes de seleção e análises de biossegurança como Southern blot e sequenciamento para verificar a inserção do transgene.
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- 7. Agrobacterium tumefaciens TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS plasmídeo “Ti” (tumor inducer) célula transformada TRANSGÊNICA ! célula da planta “GALHA DA COROA” crescimento acelerado e desordenado do tecido TUMORIZAÇÃO
- 8. Transformação Genética dePlantas Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium 4.Transferência do T-DNA para a célula vegetal Plasmídeo Ti 2.Ativação dos genes vir EE ED Ti Genes vir 3.Cópia e T-DNA excisão Genes Vir do T-DNA att, chvA, B, E, pscA CROMOSSOMA BACTERIANO
- 9. Transformação por Agrobacterium spp. Casa de vegetação co-cultivo calo plaqueamento (eliminação Agrobacterium) indução e regeneração seleção
- 10. Transformação Genética dePlantas Transferência Direta de DNA • Microinjeção • Transformação de protoplastos via polietileno glicol • Eletroporação • Fibrilas de carboneto de silício • Bombardeamento de Partículas Ponto comum: Fatores físicos ou químicos facilitam a entrada do DNA na célula vegetal
- 11. Transformação Genética dePlantas Transferência Direta de DNA Bombardeamento de Partículas Microcarreador Material Genético Célula
- 12. BIOBALÍSTICA (“gene gun”) Tubo de aceleração de gás Disco de ruptura Aparato para Macrocarreador disparo dos microcarreadores Tela de Microcarreadores anteparo cobertos com DNA Tecido alvo
- 13. Transformação Genética dePlantas CONSTRUÇÃO GÊNICA • Genes – Uma região de DNA que codifica para a produção de uma proteína ou característica • Rede interativa - DNA, RNA e proteínas
- 14. Transformação Genética dePlantas CONSTRUÇÃO GÊNICA • Transgenes – genes manipulados através das técnicas de DNA recombinante (rDNA) – Obtidos de organismos doadores (vírus, bactérias, fungos, vegetais e animais) – Sintetizados “in vitro” – Genes provenientes do mesmo organismo (cisgênico) ou de organismos diferentes (transgênico) – Transgênico pode ser produzido pela adição, deleção, iRNA.
- 15. Evento Características T25 Tolerância ao herbicida glufosinato de amônio MON 810 Resistência a insetos da ordem Lepidóptera BT11 Resistência a insetos da ordem Lepidóptera e tolerância ao herbicida glufosinato de amônio NK 603 Tolerância ao herbicida glifosato GA21 Tolerância ao herbicida glufosinato de amônio HERCULEX Resistência a insetos da ordem Lepidóptera e tolerância ao herbicida glufosinato de amônio MIR162 Resistência a insetos da ordem Lepidóptera MON 810 x Resistência a insetos da ordem Lepidóptera e tolerância ao NK603 herbicida glifosato BT11 x Resistência a insetos da ordem Lepidóptera, tolerância aos GA21 herbicidas glifosato e glufosinato de amônio MON89034 Resistência a insetos da ordem Lepidóptera TC1507 x Resistência a insetos da ordem Lepidóptera, tolerância aos NK603 herbicidas glifosato e glufosinato de amônio
- 16. Transformação Genética dePlantas CONSTRUÇÃO GÊNICA PROMOTOR REGIÃO CODIFICADORA TERMINADOR Localização: Célula, tecido, órgão Estágio de Desenvolvimento Final do Processo Quantidade produzida 35S; Ubiquitina; Actina NOS; polyA 35S Proteína cry; vip; epsps
- 17. Transformação Genética dePlantas CONSTRUÇÃO GÊNICA - Promotor Promotor uidA (GUS) NOS
- 18. NcoI BamH 1.893 kb I cry1C (codon optimized) HindIII BglII EcoRI d35S AMV NOS-Ter promoter
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- 23. Transformação Genética dePlantas Biossegurança – Análises Moleculares
- 24. Biossegurança – AnáliseMoleculares Transgene e vetores Qual o método de transformação foi utilizado? – Foi considerado os riscos de cada método? – Foi utilizado todo o vetor ou apenas partes? Quais são os principais transgenes presentes no evento? Resistência a insetos / Genes cry Tolerância a herbicidas / Genes epsps
- 25. Biossegurança – AnáliseMoleculares Transgene e vetores Quais os organismos foram os doadores de genes? Organismo diferente? Mesmo organismo? Removido do seu contexto fisiológico, o gene se torna um rDNA com todos os riscos associados de qualquer rDNA.
- 26. Biossegurança – AnáliseMoleculares Transgene e vetores Os genes foram manipulados criando fusões entre diferentes genes ou tiveram alguma parte sintetizadas in vitro? Transgene pode ter sido modificado para ser expresso de maneira mais eficiente (codon usage) Recodificados ao nível dos nucleotídeos para ter um codon preferido pelo organismo recipiente. Ex: genes cry de Bacillus foram recodificados resultando em um aumento de 100X de expressão (Trends Biotechnol. 2004. 22, 346-353) Milho AGG – Arginina (14,8%) Milho CGA - Arginina (4,3%)
- 27. Biossegurança – AnáliseMoleculares Transgene e vetores Quais os genes foram utilizados para a seleção das células modificadas? Resistência a antibióticos – nptII –kan; bla - amp Tolerância a Herbicida epsps –glifosato; pat e bar - glifosinato O gene de seleção foi retirado? Como? Seleção de progênie Recombinase Como foi confirmado a remoção? Southern blot, PCR
- 28. Biossegurança – AnáliseMoleculares Transgene e vetores A sequência do transgene e o mapa de restrição são equivalentes? Dados de sequenciamento mostrando: O sítio de inserção do transgene no cromossomo A sequência que foi inserida As sequências flanqueando o transgene Foi verificado a ausência de outras integrações, completa ou parcial?
- 29. Biossegurança – AnáliseMoleculares Transgene e vetores Foi verificado rearranjamentos nos cromossomos? Qual o número de cópias do transgene presente no evento gerado? Houve integração de sequências estruturais do vetor?
- 30. Transformação Genética dePlantas Biossegurança – Análises Moleculares EcoRI AluI EcoRI GAATTCCGTAATCGCCATGGTAGCTGGCGAATTCGGGAATG
- 31. Transformação Genética dePlantas Biossegurança – Análises Moleculares Southern blot PCR Sequenciamento
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- 34. Biossegurança Genoma Transcriptoma, Proteoma eMetaboloma Saúde humana e animal Meio ambiente Biosafety Assessment Tool https://bat.genok.or/bat/
- 35. OBRIGADA! Andréa A. Carneiro andreac@cnpms.embrapa.br