Metodologia ensino de medição superior, conhecimentos técnicos com informações que serão uteis para aprendizado de unidades de medidas técnicos com informações que serão uteis para aprendizado de unidades de medidas

1. INTRODUÇÃO
Micobactérias de Crescimento Rápido (MCR) são microrganismos que estão
amplamente distribuídos no meio ambiente, particularmente no solo e na água,
incluindo água potável, tubulações de sistemas de distribuição de água, piscina, esgoto e
superfícies, mesmo em condições supostamente adversas, como baixo pH, pouca carga
orgânica e temperaturas variadas (MACEDO et al, 2009). Capazes de formarem
colônias visíveis a olho nu em um período máximo de sete dias quando incubadas em
meio sólido, as espécies de MCR são classificadas basicamente em três complexos,
Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium smegmatis e Mycobacterium chelonae-abscessus.
Apesar de ser amplamente distribuídas na natureza, a partir da década de
1950 admitiu-se a importância das MCR na patologia humana, como causadoras de
inúmeros surtos hospitalares, como o que aconteceu em 1975, em um hospital da
Carolina do Norte, nos Estados Unidos. Neste surto foi isolado do esterno de 19
pacientes submetidos à cirurgia cardíaca a cepa de M. abscessus. Destes pacientes cinco
foram à óbito em decorrência da infecção pelo bacilo (WALLACE et al, 1998;
PITOMBO et al, 2009).
No Brasil, apesar dos relatos de surtos de infecções nosocomiais por MCR
envolvendo procedimentos médicos serem esporádicos, a partir de 2004 o quadro
assumiu grandes proporções colocando as entidades responsáveis em sinal de alerta.
Foram registrados no período entre 2004 a 2007 diversos surtos no Brasil, como o
ocorrido no município de Goiânia, no qual foi isolado 18 cepas micobacterianas de
crescimento rápido em indivíduos que passaram por procedimentos cirúrgicos como
laparoscopia e artroscopia. Estas micobactérias, de uma maneira geral, causaram a
formação de eritema e edema associados à formação de abscessos localizados, restritos
à região do joelho ou do abdômen (CARDOSO et al, 2008). Todos os isolados de
micobactérias foram identificados por PCR-PRA e pelo sequenciamento parcial do gene
rpoB como Mycobacterium massiliense. Embora os isolados tenham sido obtidos de
pacientes de hospitais diferentes, todos foram geneticamente idênticos (CARDOSO et
al, 2008).
A patogênese das infecções micobacterianas envolve vários aspectos inerentes
tanto ao microrganismo quanto ao hospedeiro que afetam diretamente a eliminação do
parasita. O entendimento destes aspectos é importante na caracterização dos
mecanismos tanto de defesa quanto de ataque. Normalmente, quando bactérias

2. ambientais são passivamente introduzidas no hospedeiro ocorre uma rápida eliminação
do patógeno devido a uma eficiente resposta imune inata (LEE et al, 2009). No entanto,
infecções causadas por M. massiliense tem sido descritas como tendo uma evolução
crônica, e em alguns casos, a doença é disseminada independente do estado imune do
indivíduo (LE BOURGEOIS et al, 2005)
Ainda não foi claramente elucidado os mecanismos de infecção usados por
algumas micobactérias de crescimento rápido contra o hospedeiro, porém acredita-se
que o mecanismo de defesa seja semelhante ao estabelecido para Mycobacterium
tuberculosis. Visando analisar tais mecanismos, Sousa e colaboradores (2010)
realizaram um estudo com camundongos das linhagens C57BL/6 e BALB/c. No estudo
em questão os camundongos foram infectados com 106 UFC/mL de M. massiliense
GO06 por via intravenosa e em diferentes dias de infecção a carga bacteriana do
pulmão, baço e fígado de cada animal foi determinada para avaliar a patogenicidade e
virulência do isolado em camundongos. Após determinação carga bacilar nos três
órgãos, foi observado nas duas linhagens C57BL/6 e BALB/c um aumento da carga
bacteriana durante os primeiros dias de infecção. Contudo, após 14 dias de infecção foi
notado que a linhagem BALB/c apresentava maior carga bacilar quando comparada
com à linhagem C57BL/6 (DE SOUSA et al, 2010). Nesse estudo de Sousa e
colaboradores (2010) demonstraram que a cepa de M. Massiliense GO06 isolada do
surto em Goiânia era patogênica e de alta virulência nas duas linhagens de
camundongos, sendo os camundongos BALB/c mais susceptíveis que os C57BL/6.
A diferença no controle da infecção observada neste trabalho pode estar
correlacionada ao fato que camundongos de linhagens diferentes, possuem mecanismos
de resposta imune díspares. A linhagem C57BL/6 exibe uma resposta imune com
padrão mais Th1, caracterizada como ideal no controle da infecção por micobactérias.
Essa resposta é induzida principalmente pelas citocinas IL-12 (Interleucina 12) e IFN-γ
(Interferon Gamma) após estímulo de microrganismos que ativam as células dendríticas,
macrófagos e células Natural Killer (FLYNN & CHAN 2001; ANNUNZIATO &
ROMAGNANI 2009). Após a fagocitose da micobactéria por macrófagos ou células
dendríticas ocorre a produção de IL-12. Essa citocina apresenta um importante papel no
controle da infecção, uma vez que favorece a resposta imune celular contra esses
patógenos, desempenhando funções essenciais, dentre as quais podemos citar: induzem
a produção de IFN-γ pelos linfócitos T CD4, CD8 e NK, leva à proliferação de

3. linfócitos T CD4, favorece a expansão clonal de células Th1 e aumenta a citotoxicidade
dos linfócitos CD8 assim como das células NK. Além disso, tal citocina ativa as células
do sistema imune, mais diretamente as Natural Killer que elevam a secreção de IFN-γ.
(MAHESHWARI et al, 2002; JUNQUEIRA-KIPNIS et al, 2003). O interferon gamma
além de estar envolvido nos mecanismos bactericidas das células fagocíticas, ativa
fatores de transcrição que estimulam a diferenciação das células T CD4+ virgem ao
subtipo Th1, amplificando, dessa forma, o padrão induzido, que é de resposta imune
natural forte (COOPER 2009). Em contrapartida, BALB/c apresenta uma resposta
tendendo ao tipo Th2, sendo esta marcada pela produção das citocinas IL-4, IL-5, IL-6,
IL-13, IL-10 e TGF-β envolvidas principalmente na regulação das lesões inflamatórias
provocadas pela infecção (COOPER & KHADER 2008). Todavia este tipo de resposta
não é efetiva no controle de infecções micobacterianas, haja visto que essas citocinas
regulam negativamente a resposta Th1 (OTTENHOFF 2012). Com isso, podemos supor
que o balanço entre as repostas Th1 e Th2 possa ser mais eficiente no controle da
infecção e manutenção de todos órgãos.
Desta maneira, o estudo da infecção por Mycobacterium massiliense em
camundongos híbridos BC-F1 oriundos do cruzamento das duas linhagens C57BL/6 e
BALB/c, poderá caracterizar melhor a interação entre patógeno e hospedeiro.
METODOLOGIA
Animais
Camundongos da linhagem BC-F1 utilizados nesse estudo, foram obtidos
através do cruzamento de fêmeas BALB/c com machos C57BL/6, com idade entre 6-8
semanas, provenientes do biotério do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da
UFG (IPSTP-UFG). Os animais foram mantidos em gaiolas, com água e dieta ad
libitum, em sala de controle com ciclo de luminosidade, umidade e temperatura.
O protocolo para este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
Animal da Universidade Federal de Goiás e todos os animais foram mantidos de acordo
com orientações da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório
(SBCAL/COBEA).
Inóculo de Mycobacterium massiliense

4. Uma alíquota da cepa Mycobacterium massiliense isolada pelo LACEN-GO no
surto ocorrido em Goiânia, foi cultivada durante três dias em meio Mueller Hinton
caldo, contendo Tween 80 a 0,05%, sendo mantida sob agitação em temperatura
ambiente até atingir a fase log de crescimento. Posteriormente, a cultura foi ajustado à
concentração de 2x106 UFC/mL.
Infecção endovenosa com Mycobacterium massiliense
Os animais foram agrupados, aleatoriamente, em 5 grupos com 3 animais cada.
A infecção foi realizada pela via intravenosa (via plexo retro-orbital), sendo inoculado,
106 CFU/animal.
Determinação das Unidades Formadoras de Colônia
Para determinar a carga bacteriana nos camundongos após a infecção, três
camundongos de cada grupo foram eutanasiados nos dias 1, 7, 14, 21 e 30 de infecção,
para coleta do pulmão, baço e fígado. Os órgãos coletados foram homogeneizados em
PBS, Tween 80 a 0,05%. Posteriormente, o homogenato foi diluído e plaqueado em
placas contendo meio Mueller Hinton ágar, quando então estas foram incubadas de 3 a 7
dias a 37°C em estufa com atmosfera úmida contendo 5% de CO2. Após este período de
incubação, as colônias crescidas foram contadas para determinar a UFC (unidades
formadoras de colônias).
Produção do extrato proteico de M. massiliense
A partir do inóculo de M. massiliense produzido para infecção coletou-se 1 mL
deste e em seguida foi realizada centrifugação por 6000rpm durante 10 min. Desprezou-se
o sobrenadante, e o ressuspendeu-se o pellet em 500ul de PBS, posteriormente este
volume foi sonicado por 10 ciclos de 30s cada. Feito isso o pellet foi novamente
centrifugado, porém em uma rotação de 10000rpm, durante 10min. Depois disso o
sobrenadante foi desprezado e o pellet foi ressuspendido em 500ul de PBS, quando
então foi fervida por 5min. A concentração do extrato proteico foi considerada 1
mg/mL.

5. ELISA
Foram coletados sangue para a obtenção de soro e realização da técnica de
ELISA para a detecção de anticorpos IgG1 e IgG2a específicos para o extrato proteico.
Placas de poliestireno de 96 orifícios (Nunc) foram adsorvidas com o extrato proteico
de M. massiliense (10 μg/mL) diluídos em tampão carbonato/bicarbonato de sódio
0,05M (pH 9,6) e incubadas por 18 h a 4°C. Após este período, as placas foram
bloqueadas por 2 h a 37°C com tampão carbonato/bicarbonato de sódio contendo leite
desnatado 1%. As amostras de soros foram diluídas a 1:80 e adicionadas nos orifícios,
com posterior incubação por 2 h a 37°C. Depois as placas foram lavadas seis vezes com
Tampão Sódio-Fosfato (PBS) Tween 20 0,05%. Os anticorpos conjugados a biotina
(anti-mouse IgG1 e IgG2a Pharmingen) foram diluídos a 1:5000 em PBS contendo leite
desnatado 0,1% (PBSL) e adicionados aos orifícios da placa. Após incubação por 1 h a
37°C, as placas foram lavadas por seis vezes com PBS Tween 20 0,05%.
Estreptoavidina-peroxidade (BD Biosciences) diluída em PBSL a 1:10000 foi
adicionada aos orifícios e as placas foram incubadas por 1 h a 37°C. Novamente as
placas foram lavadas. A reação foi revelada com o tampão citrato-fosfato pH 4,5
contendo OPD (ortho-phenylenediamine - Merck) e água oxigenada a 20 V. A reação
enzimática foi finalizada com a adição de ácido sulfúrico 4 N. As placas foram lidas a
492 ηm na leitora de ELISA (LabsystemsMultiskanThermo).
Análise estatística
Os resultados apresentados neste trabalho foram tabulados no Prism 5 software
(Graphpad Software 5.0), expressos como média ± SD. Analise estatística múltipla
(Kruskal Wallis seguido de teste de Dunn’s) foi utilizada para avaliar as possíveis
diferenças entre os grupos. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente
significativo.
RESULTADOS
Para avaliar o perfil da resposta imune induzida pela infecção com M.
massiliense em camundongos BC-F1, o sangue de todos os animais foi coletado nos
dias 7, 14, 21 e 30 de infecção. Posteriormente foi determinado no soro os níveis de
anticorpos IgG1 e IgG2a anti-extrato proteico de M. massiliense. Como demonstrado na

6. (Figura 1A), em todos os pontos em que os níveis séricos de anticorpos foram
determinados houve uma semelhança nos níveis entre as duas classes de anticorpos
IgG1 e IgG2a. Com quatorze dias de infecção foi observados níveis significativos de
anticorpos tanto da classe IgG1 quanto IgG2a quando comparado com o grupo salina
(Figura 1B). Estes resultados demonstram que camundongos BC-F1 apresentam um
perfil de resposta balanceada frente a infecção por M. massiliense.
Figura 1. Níveis séricos de anticorpos específicos anti-extrato proteico de M.
massiliense após o desafio intravenoso com M. massiliense GO06. Camundongos BC-F1
foram infectados com 106 UFC/mL de M. massiliense GO06. (A) aos 7, 14, 21 e 30
dias de infecção, os níveis séricos de anticorpos IgG1 e IgG2a foram avaliados. (B)
comparação dos níveis séricos de anticorpos específicos IgG1 e IgG2a anti-extrato
protéico de M. massiliense em camundongos BC-F1 aos 14 dias de infecção com M.
massiliense. Diferença estatística: * (p<0,05).

7. Como observado na Figura 1, os camundongos BC-F1 apresentaram níveis
similares de anticorpos das classes IgG1 e IgG2a sendo um perfil balanceado de
resposta. Diante disso, foi avaliado se esse balanço nos níveis de anticorpos, permitiu o
controle ou não da infecção por M. massiliense. Para isso, camundongos BC-F1
infectados por via endovenosa com M. massiliense foram eutanasiados nos dias 7, 14,
21 e 30, para coleta dos pulmões, baço e fígado. Os quais foram posteriormente
homogeneizados e plaqueados em meio MH para determinação da carga bacteriana. A
figura 2 demonstra que camundongos BC-F1 infectados por via endovenosa com M.
massiliense apresentaram um controle da infecção, sendo observado a formação de uma
curva descendente na cinética da carga bacilar determinada nos órgãos dos animais.
Este resultado demonstra que a resposta imune apresentada por camundongos BC-F1
contra M. massiliense foi efetiva na redução da carga bacilar nos três órgãos avaliados,
reduzindo após 30 dias de infecção três logs de UFC no baço. Já no fígado e pulmão foi
observado apenas a redução de 1,5 logs de UFC.
Figura 2. Determinação da carga bacilar no pulmão, baço e fígado de camundongos
BC-F1 nos dias 7, 14, 21 e 30 de infecção por via intravenosa com 106 UFC/mL de M.
Massiliense GO06.
DISCUSSÃO

8. Neste estudo foi avaliada a susceptibilidade de camundongos híbridos BC-F1,
oriundos do cruzamento entre as linhagens BALB/c e C57BL/6, a cepa de M.
massiliense GO06.
Nossos resultados demonstram que frente a infecção por M. massiliense,
camundongos BC-F1 apresentam níveis igualitários das classes de anticorpos IgG1 e
IgG2a específicos para M. massiliense. Possivelmente, esse semelhança nos níveis de
classes de anticorpos pode estar relacionada a diversidade do MHC apresentada por esta
linhagem. Pois esta é oriunda do cruzamento de duas linhagens que apresentam
respostas imunes diferentes frente a infecção por patógenos intracelulares. Enquanto
camundongos BALB/c montam uma resposta do tipo Th2 com produção de IgG1,
camundongos C57BL/6 geram uma resposta Th1 com produção de IgG2a (REF). Essas
duas linhagens apresentam sucetibilidade a infecção por M. massiliense, isso mostra que
a polarização da resposta imune não ideal para o controle da infecção. Assim, uma
resposta imune balanceada pode ser ideal no controle da infecção e na manutenção do
órgão infectado por patógenos intracelulares.
Em nosso trabalho foi observado que os camundongos BC F1 que apresentaram
uma resposta imune balanceada, foram capazes de controlar a infecção por M.
massiliense, reduzindo carga bacilar no baço, fígado e pulmão. Possivelmente este
controle observado é devido a resposta imune gerada por esta linhagem de
camundongos, sendo diferente da observada em um estudo realizado por De Souza et
al., com a mesma cepa em linhagens diferentes. Neste estudo foi observado que tantos
camundongos BALBc que apresentam uma resposta imune predominantemente Th2 e
C57bl6 do tipo Th1, não foram capazes de reduzir a carga bacilar nos órgãos avaliados.
Estes dados demonstram que a polarização de único tipo de resposta não é ideial para o
controle da para infecção por M. Massiliense, sendo necessário o balanço entre ambos
os tipos de respostas imunes (REF).

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