Este documento descreve protocolos para desinfecção de diferentes tipos de material vegetal ("explants") para cultura in vitro. Discute-se a importância da desinfecção e métodos utilizados em sementes, folhas e caules. Resultados demonstram que sementes apresentam menor risco de infecção enquanto folhas e caules não-esterilizados apresentam maior risco.

1. Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro
GENÉTICA
MOLECULAR E
BIOTECNOLOGIA
TÉCNICAS DE DESINFECÇÃO DO MATERIAL
VEGETAL (EXPLANTS)
Docente: Fernanda Leal
Discentes:
CRISTIANA VALENTE Nº 33708;
DAVID RODRIGUES Nº 33714;
FRANCISCO PINTO Nº 33707;
LUÍS SAMPAIO Nº 33706;
PEDRO VEIGA Nº 33698

2. Índice
Introdução ..................................................................................................................................... 3
Desinfecção e Importância dos métodos .................................................................................. 4
Métodos de desinfecção utilizados nos diferentes "explants” ................................................. 4
Objectivos...................................................................................................................................... 5
Material utilizado .......................................................................................................................... 5
Procedimentos .............................................................................................................................. 6
Resultados ..................................................................................................................................... 7
Discussão ....................................................................................................................................... 9
Conclusões .................................................................................................................................... 9
2

3. Introdução
“In vitro” ("em vidro") é uma expressão latina que designa todos os processos
biológicos que têm lugar fora dos sistemas vivos, no ambiente controlado e fechado de
um laboratório e que são feitos normalmente em recipientes de vidro.
A cultura “in vitro” de plantas refere-se ao cultivo de sementes, embriões ou
fragmentos de tecido vegetal sob condições assépticas, em meios nutritivos
adequados, dispondo de luz, temperatura e humidade controladas, com o objectivo de
obter uma rápida multiplicação de plantas, isentas de pragas e doenças.
Como principais vantagens a cultura “in vitro” apresenta as seguintes:

Pode ser a única forma de as propagar vegetativamente;

As plantas têm geralmente um crescimento mas rápido;

Podemos fornecer todas as condições óptimas;

Podemos obter maior número de plantas em menor tempo;

Obtêm-se plantas iguais à planta-mãe;

Se usarmos outro “explant” também podemos ter variabilidade;

Permite juntar espécies muito diferentes.
Apesar de todas estas vantagens, a cultura “in vitro” possui igualmente diversas
desvantagens sendo algumas delas as seguintes:

A propagação massiva não pode ser aplicada actualmente em todas as espécies
vegetais;

A regeneração pode não ser possível, especialmente para árvores lenhosas
adultas. Existem mais problemas para obter raízes que rebentos;

Podem não ter um crescimento uniforme e em lugar disso ter diferentes taxas
de crescimento e maduração “in vitro”;

É um processo muito dispendioso e pode ter um custo laboral superior a 70%;

Uma planta infectada pode produzir clones infectados. Isto é incomum, já que
as plantas em stock são seleccionadas e vedadas com cuidado para evitar isto.
3

4. Desinfecção e Importância dos métodos
Pré – tratamento: retirar o lixo existente no material e passar abundantemente
por água corrente;
Tratamento: passar o “expant” por etanol a 70%, seguindo-se a passagem por
um agente desinfectante (hipoclorito de sódio ou cálcio, cloreto de mercúrio, peróxido
de hidrogénio, etc.);
Pós – tratamento: remover restos do agente desinfectante, passando o
“explant” por água destilada num frasco, durante 5 a 10 minutos, repetir o processo
três vezes.
O tempo que dura o tratamento e o tipo de desinfectante a utilizar depende do
material vegetal que estamos a trabalhar; depende, por exemplo, do tipo de “explant”
e do seu grau de contaminação.
Métodos de desinfecção utilizados nos diferentes "explants”
Folhas:
1 – Lavagem com água corrente;
2 – Solução de hipoclorito de sódio a 4% com 2 a 3 gotas de Tween 80, 15 minutos
devido à grossura;
3 – Três passagens por água destilada até à sua utilização.
Sementes:
1 – Passagem por etanol a 70%, durante 3 a 4 minutos;
2 – Passagem por uma solução de hipoclorito de sódio com 2 a 3 gotas de Tween 80,
durante 15 minutos;
3 – Três passagens por água destilada, cada uma delas demorando 10 minutos.
4

5. Caules:
1 – Passagem por etanol a 70%, agitamos, durante 30 segundos;
2 – Passagem por uma solução de ácido cítrico (150 mg) e ácido ascórbico (100 mg),
durante 5 minutos;
3 – Imersão em etanol a 70%, durante alguns instantes;
4 – Imersão em hipoclorito de sódio (20 cm3 de lixívia comercial e 100 cm3 de água
destilada), durante 20 minutos;
5 – Três passagens por água destilada.
Objectivos

Ter o primeiro contacto com este material;

Perceber que devemos aplicar desinfecções diferentes consoante o tipo de
“explant”;

Observar as infecções do material vegetal após instalação em cultura “in vitro”
e, assim, verificar a eficácia dos tratamentos de desinfecção aplicados nos
“explants”;

Cuidados a ter na execução de cultura “in vitro”.
Material utilizado
Material vegetal:

Sementes

Caules

Folhas

“Explant” de material já instalado em cultura “in vitro”
5

6. Material de laboratório:

Erlenmeyers

Pinças

Bisturis

Etanol a 70%

Placas de petri

Frascos com meio de cultura

Parafilm

Papel de alumínio

Papel de filtro

Marcadores

Algodão hidrófilo

Água destilada

Hipoclorito de sódio

Tween 80
Procedimentos
Todos os trabalhos têm de ser realizados em condições de assepsia, sendo para
tal executados numa câmara de fluxo laminar. Esta filtra o ar, não permitindo a
circulação de ar contaminado, tendo de ser ligada 20-30 minutos antes para prévia
desinfecção do ar dentro da câmara.
São fornecidos aos alunos diferentes tipos de “explants” que são então
desinfectados em etanol a 70%, posteriormente por hipoclorito de sódio e, por fim,
por água destilada. Em alguns casos terá de ser efectuado um tratamento de
desinfecção específico.
Após esterilização dos “explants”, procede-se à instalação destes num meio de
cultura (MS) previamente preparado pelos técnicos.
Em cada meio de cultura será indicado o tipo de “explant”, a data da sua
instalação no meio, a identificação do grupo e do curso.
6

7. Os frascos serão colocados num fitoclima a 25ºC e com um fotoperíodo de 12
horas de luz.
Resultados
Tabela dos resultados observados nas culturas de folhas:
Semana
Placa
1
2
3
4
5
Infecções no meio de
cultura (número de
focos)
Infecções no “explant”
(número de "explants"
infectados/6)
Formação
de fenóis
1ª
2ª
3ª
1ª
2ª
3ª
1ª
2ª
3ª
1ª
2ª
3ª
1ª
2ª
3ª
bactérias (1)
bactérias (1)
bactérias (1), fungos (1)
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
fungos (1)
fungos (1)
fungos (1)
fungos (1)
fungos (1), bactérias (1)
fungos (1), bactérias (1)
fungos (1), bactérias (1)
fungos (1), bactérias (1)
Não
Não
Não
Não
bactérias (3)
bactérias (3)
fungos (2), bactérias (2)
fungos (2), bactérias (2)
fungos (2), bactérias (2)
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
Tabela dos resultados observados nas culturas de embriões de sementes:
Frasco
1
2
3
4
5
Semana
Infecções no meio de
cultura (número de
focos)
Infecções no explant
(número de "explants"
infectados/2)
Formação
de fenóis
1ª
2ª
3ª
1ª
2ª
3ª
1ª
2ª
3ª
1ª
2ª
3ª
1ª
2ª
3ª
não
bactérias (1)
bactérias (1), fungos (1)
não
não
bactérias (1)
não
não
não
não
não
não
bactérias (1)
bactérias (1)
bactérias (1)
Não
bactérias (1)
bactérias (1)
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
bactérias (1)
bactérias (1)
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
7

8. Tabela dos resultados observados nas culturas de caules:
Semana
Placa
1
2
3
4
5
Infecções no meio de
cultura (número de
focos)
Infecções no “explant”
(número de "explants"/2)
Formação de
fenóis
1ª
2ª
3ª
1ª
2ª
3ª
1ª
2ª
3ª
1ª
2ª
3ª
1ª
2ª
3ª
não
fungos (1)
bactérias (1), fungos (1)
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
fungos (1), bactérias (1)
fungos (2)
fungos (1)
Não
Não
Não
bactérias (2)
bactérias (2)
bactérias (2)
bactérias (1)
bactérias (1), fungos (1)
bactérias (2), fungos (2)
fungos (1)
fungos (1)
fungos (1)
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
sim
sim
sim
Tabela dos resultados observados nas culturas de caules desinfectados:
Frasco
Semana
1ª
1 2ª
3ª
1ª
2 2ª
3ª
1ª
3 2ª
3ª
1ª
4 2ª
3ª
1ª
5 2ª
3ª
Infecções no meio de
cultura (número de
focos)
Infecções no “explant”
(número de "explants"/2)
Formação de
fenóis
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
Não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
não
8

9. Gráficos do número de focos de infecções em cada semana:
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
1ª semana
2ª semana
12
3ª semana
14
10
8
6
5
1
6
4
0
Nº de Focos de
Infecções
0
Nº de Focos de
Infecções
0
Nº de Focos de
Infecções
Discussão
Podemos observar que as sementes são, entre os “explants” que não vieram de
cultura “in vitro”, as que tem menor probabilidade de aparecerem infectadas.
Podemos observar também que as folhas e os caules não provenientes de
cultura “in vitro” apresentam um grau de infecção muito semelhante.
Visivelmente podemos observar que os caules que provieram de cultura “in
vitro” não apresentam nenhuma infecção, ao contrário dos caules que não provieram
de cultura “in vitro”.
Podemos ainda observar que com o tempo as infecções tornam-se mais
frequentes.
Conclusões
Devido ao facto de as sementes possuírem um tegumento que protege o embrião, este
está menos sujeito às contaminações e infecções pelo meio externo, apresentando após
implantação uma frequência muito menor de contaminações. Ao contrário, as folhas e os
caules, como estão expostos à superfície e sem protecção, apresentam maior frequência de
infecções quando “in vitro”.
9

10. Logicamente podemos justificar o facto de os caules provenientes de cultura “in vitro”
não apresentarem infecção por terem sido produzidos em ambiente de assépsia, sem contacto
com a atmosfera exterior e possíveis fontes de contaminação, ao contrário dos caules não
provenientes de cultura “in vitro” que, como estiveram expostos ao exterior durante o seu
desenvolvimento, adquiriram microrganismos contaminantes que mais tarde, apesar dos
métodos de desinfecção, se propagaram em colónias infectantes.
A maior frequência de infecções ao longo do tempo pode ser explicada ou pela
propagação das infecções já existentes ou pelo mau manuseamento dos frascos nos
momentos de recolha de dados.
Pode-se também justificar algumas das infecções existentes pelo mau manuseamento
do material e “explants”. Como exemplos podem referir-se: possível infecção do meio de
cultura durante a sua preparação; esterilização deficiente do material antes da sua utilização;
manuseamento errado do material durante a utilização, levando a nova infecção deste;
condições inadequadas de trabalho pelos alunos durante a implantação (trabalhar na
extremidade da bancada de fluxo laminar, trabalhar próximo do rosto, não ter cuidados em
caso de doença infectante, etc.); deficiente isolamento dos frascos no momento de fecho; mau
manuseamento dos frascos e caixas-de-Petri durante a recolha de dados, podendo levar a
novas infecções.
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