Este documento descreve normas de segurança, técnicas e conceitos básicos utilizados em laboratório de microbiologia, incluindo cultura pura, esterilização e assepsia. A prática 1 ensina identificação de equipamentos, transferência de culturas e detecção de microrganismos ambientais. A prática 2 aborda métodos físicos e químicos de controle de crescimento, como calor e agentes antissépticos.

1. Material e Técnicas Básicas Utilizadas no Laboratório
de Microbiologia

2. Normas de segurança
• Uso de jaleco;
• Desinfecção das mãos com solução germicida, água e sabão, após
contato com material microbiológico;
• Gestos bruscos;
• Contato de áreas desprotegidas com material infeccioso deve ser
comunicado ao professor;
• Instrumental usado não deve ser desprezado sobre a bancada;
• Verificar posição da entrada de ar do bico de Bunsen;

3. Normas de segurança
• Para abrir ou fechar tubos com material microbiológico, ou meio
de cultura a ser inoculado, segure-o com a mão esquerda, remova a
tampa com a direita retendo-a com o dedo mínimo;
• Ao terminar de usar o microscópio, desligá-lo;
• Lâminas utilizadas devem ser descartadas na travessa de vidro
sobre a bancada;
• Não abrir os meios de cultura que estiverem sobre a bancada sem
autorização do professor, para se evitar contaminações.

4. Cultura pura
Crescimento, em meio de cultivo adequado, de um conjunto de células
idênticas, correspondentes a mesma espécie

5. Esterilização – eliminação de toda e qualquer forma de vida presente em
determinado material ou ambiente.
Assepsia – uso de manobras assépticas, que são técnicas que impedem a
entrada de micro-organismos onde não são desejados.

7. Prática 1
Objetivos:
 Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros
objetos de uso mais frequente em microbiologia;
 Definir cultura pura, esterilização e asspsia;
 Descrever as principais técnicas de manobras assépticas,
 Desenvolver habilidade de manipular tubos com meios estéries, bem
como transferir micro-organismos de meio sólido para meio sólido e para
meio líquido;
 Conscientizar-se da presença de micro-organismos no ambiente.

8. Execução
1ª: Apresentação do material de laboratório: mostrar a vidraria
principal (tubos, pipetas Pasteur, placas, etc)
2ª: Treinar manobras assépticas:
1 – Distribuição, de um tubo para o outro, caldo simples estéril,
usando pipeta (2,0ml). Repetir quando a técnica não se mostrar
adequada.
2 – Transferir uma porção do crescimento de Serratia sp crescida
em tubo de agar inclinado contendo meio de agar simples, para outro
meio idêntico, com auxílio de alça de inoculação.
3 – Transferir uma porção do crescimento de Serratia sp crescida
em tubo de agar inclinado para meio líquido de caldo simples. Incubar os
tubos no escuro por, no mínimo 48 horas.

9. 3ª: Verificar a presença de micro-organismos no ambiente:
1 – Verter o meio de agar simples fundido em placa e esperar
solodificar.
2 – Expor uma das placas durante 15 minutos ao ar.
3 – Com uma 2ª placa, realizar uma das seguintes opções:
1) Friccionar um swab na bancada e em seguida espqlhar o mesmo
na superfície do agar;
2) Friccionar alguns fios de cabelo sobre o agar;
3) Tocar suavemente a superfície dos dedos na superfície do
agar;
4) Soprar, tossir ou esperrar sobre a superfície do agar.
Incubar as placas a temperatura ambiente por cerca de uma semana.

10. Interpretação dos resultados
2ª: Manobras assépticas
a) Leitura dos tubos de caldo simples estéreis, submetidos a
transferência em condições assépticas: a observação de turvação no meio
de cultura indica a presença de crescimento bacteriano, e portanto,
manobra asséptica inadequada.

11. Interpretação dos resultados
b) Leitura dos tubos de agar simples inclinado, inoculado com
Serratia sp: a presença de crescimento vermelho-alaranjado
indica Serratia sp; a presença de outro tipo de crescimento que
não apresente a referida cor indica contaminação, e portanto,
manobra asséptica inadequada.

12. c) Leitura dos tubos de caldo simples inoculados com Serratia sp: a
observação de turvação no meio de cultura indica crescimento da
Serratia sp, mas não permite verificar se houve ou não contaminação
Interpretação dos resultados

13. 3ª: Presença de micro-organismos no ambiente
Observar a presença de diferentes colônias na superfície
das placas; observar os diferentes tipos de bactérias e fungos;
preparar lâminas e observa-las ao microscópia. Distinguir os
diferentes tipos microbianos.
Interpretação dos resultados

14. Morfologia Colonial
• Pigmentação
Interpretação dos resultados

15. Métodos Físicos e Agentes Químicos no Controle do
Crescimento Microbiano: Esterilização, Desinfecção e
Antissepsia
O crescimento dos micro-organismo pode ser
controlado através de métodos físicos e químicos.
Eliminação total ou parcial

16. Esterilização – Eliminação total dos micro-organismos presentes em
determinado material ou ambiente.
Desinfecção – Inativação ou redução do número de micro-
organismos presentes em material inanimado. A desinfecção não
implica na eliminação de todos os micro-organismos viáveis, porém
elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfícies ou local de
trabalho. Assim, a desinfecção tem como objetivo eliminar os micro-
organismos.
Antissepsia – Consiste no mesmo conceito de desinfecção, porém
está relacionado com substâncias (antissépticos) aplicados em tecido
vivo.

17. I – Métodos Físicos de Controle do Crescimento de
Micro-organismos

18. Calor
1 – Calor úmido
Autoclave – utiliza o calor na forma de vapor d’água sob
pressão. Destrói formas vegetativas e esporuladas (121ºC/15-
30minutos). Usados para meios de cultivo, vidrarias, etc.
Água em ebulição – utiliza o calor na forma de
vapor d’água livre. Destrói apenas formas
vegetativas (100ºC/20minutos

19. Tindalização – utiliza o calor na forma de vapor d’água livre. Visa
destruir formas vegetativas e esporuladas. É também denominado
esterilização fracionada ou intermitente (100ºC/20min. Durante 3
dias consecutivos). Usado no preparo de alguns medicamento,
vacinas, etc.
Pasteurização – Reduz as populações microbianas sem destruir
necessariamente todas as formas vegetativas. Muito utilizado nas
indústrias de alimentos (leite, cremes, cerveja, etc). Dois tipos:
- Alta temperatura – usa um tempo curto (15 seg.) a 72ºC
- Baixa temperatura – usa um tempo mais longo (30 seg) a 63ºC

20. 2 – Calor Seco
Fornos ou estufas – utiliza o calor seco a 180ºC durante 1 ou 2
horas. Muito usado para vidrarias e para materiais danificáveis pela
umidade como os metais ou óleos.
Flambagem – esteriliza agulhas e alças microbiológicas:
aquecimento ao rubro

21. Incineração – para eliminar animais de laboratório

22. Radiações
Ultravioleta – o comprimento de onda mais efetivo para efeitos
germicidas é entre 2600-2700A. Muito usado para salas
cirúrgicas. O poder de penetração é muito baixo. Atua no DNA
formando dímeros de timina.
Raios γ - empregado para materiais descartáveis e material
cirúrgico termolábil. Método caro e perigoso. Uso industrial.

23. Filtração
Filtros bacteriológicos – empregados para esterilizar materiais
termolábeis como soro, enzimas, etc. São filtros de materiais
diversos como ésteres (acetato ou nitrato) de celulose e amianto

24. Prática 2
Objetivos:
 Conceituar os diferentes métodos de esterilização;
 Comparar os diferentes métodos físicos de esterilização;
 Listar alguns métodos de esterilização pelo calor;
 Relacionar as finalidades da desinfecção e antissepsia;
 Fazer apreciação dos diferentes agentes antissépticos;
 Testar a eficácia da ação do calor e de agentes químicos sobre o
crescimento microbiano

25. Execução
1ª - Teste da ação do calor sobre as bactérias: será verificada
a ação de dois métodos diferentes de controle dos micro-
organismos que empregam o calor úmido, autoclave e água em
ebulição
 Adicionar 1 a 2 gotas de cultura pura de bactérias (Bacillus
subtilis ou Escherichia coli) a tubos contendo caldo simples e
submetê-los aos seguintes tratamentos:
 Tubo 1: controle, sem tratamento
 Tubo 2: ferver 5 minutos em banho maria
 Tubo 3: ferver 20 minutos em banho maria
 Tubo 4: submeter à autoclavação durante 15 minutos.

26. Interpretação dos Resultados:
1ª - Ação do calor sobre bactérias. Observar os 4 tubos
semeados na aula anterior. A turvação do meio de cultura, ou
a presença de uma película na superfície do meio, indica a
presença do crescimento bacteriano.
Avaliar a eficiência dos tratamentos comparando o
crescimento em relação ao tubo 1 (controle).
Comparar os resultados obtidos com cada uma das duas
espécies bacterianas: B. Subtilis e E. coli. As culturas de B.
Sutilis, por serem esporuladas, são muito mais resistentes e
só são destruídas por autoclavação. Já as formas vegetativas
de ambas as culturas são destruídas em banho-maria.

27. Escherichia coli X Bacillus

28. II – Metodos Químicos de Controle de Crescimento
Microbiano
• Antisséptico – usado em tecidos vivos para inibição do
crescimento (álcool iodado)
• Desinfetante – inibe o crescimento de microorganismos (formas
vegetativas) em material inanimado (fenol, etanol)
• Antimicrobianos – utilizado para o tratamento de doenças
infecciosas (Penicilinas, cloranfenicol)
Toxidade seletiva – atuação sobre microrganismos
sem afetar celulas hospedeiras

29. Fenóis e derivados (fenol, cresol) - desnaturação de proteínas
Álcoois (metílico, etílico, propílico) - solvente para lipídios
- desnatura e coagula proteínas
Compostos de cloro (hipoclorito de sódio,
cloramina, cloro)
- se combina com proteínas
- agente ocidante
Tintura de iodo, água sanitária, permanganato de
potássio
- agentes oxidantes
Detergentes (lauril sulfato de sódio) - rompe membrana celular
- altera permeabilidade celular
- diminui tensão superficial
Corantes (cristal violeta) - tem afinidade por ácidos nucleicos
Óxido de etileno (gás esterilizante) - agente alquilante
- ativo contra formas vegetativas e esporulados.
Usado na preservação de alimento, esterilização
de material plástico, equipamentos médicos etc.
Desnatura proteínas e danifica DNA e RNA (ação
mutagênica)
Agentes Mecanismo de ação

30. 2ª - Teste da eficácia da ação de agentes químicos (antissépticos)
sobre os micro-organismos. Será demonstrada a ação do álcool, álcool
iodado, detergentes, água sanitária, etc. Sobre o crescimento de
Serratia sp (técnica do polegar)
1 – Em placa de petri contendo meio de cultura, delimitar 3 regiões,
utilizando lápis cera. Marcar as regiões 1, 2 e 3;
2 – Sobre a superfície do meio, comprimir ligeiramente o polegar na
região 1, tomando cuidado para não ferir o agar;
3 – Umidece o polegar no papel de filtro embebido com cultura de
Serratia e comprimi-lo ligeiramente na região 2;
4 – Lavar o polegar utilizando qualquer um dos agentes antissepticos a
sua escolha ( alcool, alcool iodado, detergente ou água santária);
5 – Secar o polegar ao ar e novamente comprimi-lo ligeiramente na região
3;
6 – Anotar o composto utilizado. Identificar a placa. Embrulhar com
papel e incubar a temperatura ambiante (25-28ºC) por 24/72h;
Prática 2

31. Interpretação dos Resultados:
2ª - Teste da ação dos agente antissépticos. Observar a placa
da aula anterior, e verificar o crescimento bacteriano nas quatro
regiões. Comparar a eficiência dos diferentes antiossépticos
usados pelos colegas.

32. Assunto 3: Exame Microscópio de
Micro-organismos

33. 300 nm a 1 µm
Bactérias e Arqueas
Fungos Protozoários Algas
10 µm a 100 µm
Pox vius Herpes vius
27 nm a 300nm
0,2 mm0,2 mm

34. Bactérias e Arqueas
Fungos Protozoários Algas

35. Microscopia
óptica, corada pelo
método de Gram,
de cocos em um
arranjo
denominado
estafilococos.
Microscopia
eletrônica de
varredura das
células
apresentadas
acima.

36. Pox vius Herpes vius
Varredura
Transmissão
Varredura
Transmissão

37. Principais tipos de preparações microscópicas para visualizar
micro-organismos

38. Colorações
SIMPLES
Positiva
Negativa
DIFERENCIAL
SEPARAÇÃO DE GRUPOS
Coloração de Gram
Coloração de Ziehl-Neelsen – Alcool-
ácido resistente
VISUALIZAÇÃO DE
ESTRUTURAS
Esporos
Cápsulas
Flagelo
Tipos de coloração utilizadas em microscopia ópticaTipos de coloração utilizadas em microscopia óptica

39. POSITIVA – corantes carregados
positivamente (núcleo superfície)
Ex: Giemsa
NEGATIVA – corante acídico
(lâmina)
Ex: Nanquim
T. cruzi
Plasmodium falciparum
C. neoformans
COLORAÇÃO SIMPLES
Uso de apenas 1 corantes

40. Coloração de Ziehl-Neelsen
Dificulta a penetração de
vários corantes – grande
hidrofobicidade
COLORAÇÃO DIFERENCIADA
Uso de apenas 2 corante

41. Solução àlcool-ácido
(etanol 95% + HCL concentrado)
5 min,
aquecendo
Água destilada
CarbolfucsinaCarbolfucsina
Até o líquisdo
que pararmde
sair colorido
Água destilada
Azul de Metileno
Água destilada
2 min
Papel de filtro e micorscópio óptico
Coloração de Ziehl-Neelsen

42. COLORAÇÃO DIFERENCIADA
Uso de apenas 2 corantes
LugolLugol
(mordente – forma complexo insolúvel com o corante primário-
iodo para-rosalina)
1 min
Água destilada
Cristal VioletaCristal Violeta
(cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de célula)
1 min
Água destilada
Etanol a 95% (álcool-acetona ou ambos: solvente lipídico
Água destilada
SafraninaSafranina (cora o citoplasma de vermelho)(cora o citoplasma de vermelho)45 seg
Água destilada
Papel de filtro e micorscópio óptico
Coloração de Gram

44. Gram +Gram +
Gram -Gram -

45. Formas
e
Arranjos
(eubactérias)

48. Prática 3
Objetivos:
 Manusear adequadamente um microscópio ótico;
 Conhecer os principais métodos de observação microscópica de micro-
organismos;
 Distinguir,morfologicamente, bactérias, leveduras, bolores e
protozoários;
 Identificar os principais tipos morfológicos das bactérias;
 Discutir a importância do método de Gram na identificação de micro-
organismos;

49. Execução:
1ª - Observação microscópica de lâminas prontas
a) Esporos de Bacillus megaterium (cultura com mais de 48 horas de
crescimento), coradas pelo método de Schaeffer fulton (célula corada de
vermelho (safranina) e esporos corados de verde (verde malaquita)
b) Bactérias coradas pelo Gram: B. subtilis, S. aureus (Gram positiva e
E. coli (Gram negativa)

50. 2ª- Preparação de lâminas para observações microscópicas
1) Preparação a fresco de E. coli. Após flambar a alça, colocar uma
gota de suspensão bacteriana em uma lâmina, cobrir com lamínula.
Adicionar uma pequena gota de óleo de cedro e observar com
objetiva de imersão (100x)
2) Preparação a fresco de Sccharomyces cerevisiae. Retirar, com
uma alça flambada, uma porção do crescimento da levedura e
suspender em uma gota de solução salina em uma lâmina. Cobrir com
lamínula e observar com objetiva de 40x.

51. 3) Preparação a fresco de Aspergillus versicolor. Cuidadosamente,
para não alterar as estruturas fúngicas, retirar com alça flambada
uma porção do crescimento do fungo e suspender em uma gota de
solução salina, em uma lâmina. Observar entre lâmina e lamínula
com objetiva de 40x.
4) Preparação a fresco de Herpetomonas sp. Retirar, com uma alça
flambada, uma porção do crescimento em meio líquido do protozoário
e colocar sobre uma lâmina. Cobrir cuidadosamente com uma lamínula.
Observar com objetiva de 40x.

52. 5) Coloração de Gram
 Colocar uma gota de salina sobre a lâmina. Com alça flambada retirar
uma pequena porção da cultura e colocar na gota de salina, espalhar
obtendo um esfregaço. Deixar secar.
 Fixar o esfregaço na lâmina, presa ao pregador, passando-a na chama do
bico de Bunsen
LugolLugol
(mordente – forma complexo insolúvel com o corante primário-iodo para-
rosalina)
1 min
Água destilada
Cristal VioletaCristal Violeta
(cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de célula)
1 min
Água destilada
Etanol a 95% (álcool-acetona ou ambos: solvente lipídico
Água destilada
SafraninaSafranina (cora o citoplasma de vermelho)(cora o citoplasma de vermelho)45 seg
Água destilada
Papel de filtro e micorscópio óptico

53. 3ª- A partir das placas expostas (ar, bancada, dedo, boca, etc)
observar diversos tipos de colônias crescidas. Com o auxílio do
professor escolher uma colônia de bactéria e outra de fungo,
para estudo.
a) Colônia de bactéria: Realizar coloração de Gram.
b) Colônia de fungo: Preparar lâmina a fresco com solução salina.

54. Interpretação dos Resultados (Leitura)
1ª – Observação de lâminas prontas:
1) Observação de lâminas de Bacillus megaterium. Distinguir os
esporos, corados em verde das células vegetativas, coradas em
vermelho. Observar esporos dentro e fora da célula.
2) Observação de lâminas de bactérias coradas ao Gram.
Distinguir o tamanho, a forma (coco ou bacilo) e a reação ao Gram,
roxas, Gram (+) ou vermelhas, Gram (-). Observar algum arranjo
característico.

55. Interpretação dos Resultados (Leitura)
2ª – Observação de lâminas preparadas pelo aluno:
1) Observar, na preparação a fresco de E. coli, seu tamanho relativo,
sua forma e sua locomoção.
2) Observar S. cerevisiae quanto a forma, tamanho relativo e a
presença ou ausência de brotamento.
3) Observar A. versicolor quanto ao tamanho. Identificar o micélio,
hifas septadas ou não, e se possível as estruturas que contêm os esporos.
4) Observar Herpetomonas sp quanto ao tamanho e capacidade de
locomoção.
5) Observar as lâminas coradas pelo Gram, como em 2), 1 parte.

56. Interpretação dos Resultados (Leitura)
3ª – Observação de colônias desconhecidas de micro-organismos do
ambiente:
- Observar ao microscópio as lâminas preparadas pelo próprio
aluno. De acordo com as características observadas tais como
tamanho, forma, Gram, presença de hifas, etc. Confirmar tratar-se
de bactéria, levedura ou fungo.

57. Assunto 4: Técnicas de Isolamento e
Contagem de Micro-organismos: Obtenção
de Cultura Pura

58. Meios de Cultura: Destinam-se ao cultivo artificial dos micro-organismos
e portanto devem fornecer os nutrientes indispensáveis ao seu
crescimento. Normalmente contém uma fonte de C, N e sais minerais,
além de fatores de crescimento, para o caso de micro-organismos
exigentes.
Meio de enriquecimento: Adequado ao crescimento de micro-organismos
heterotrófico mais exigentes em termos nutritivos, tais como os
patogênicos. Costuma-se adicionar sangue, soro, extrato de plantas ou
animais. Ex.: B.H.I (Brain Heart Infusion), para protozoários.
Meio Seletivo: Adequado ao isolamento de um grupo particular de micro-
organismos, através da adição de substâncias químicas que vão inibir
certos grupos sem afetar outros, ou, ao contrário, facilitar certos grupos
e não outros. Ex.: adição de antibióticos, de fonte de C específicas, como
a celulose para celulolíticos

59. Meio diferencial: Através da adição de certos reagentes ao meio, após
inoculação e incubação, poder-se-á observar uma modificação que
permita diferenciar tipos de bactérias. Ex.: meio BEM para diferenciar
E. coli, meio de agareur manitol sal para diferenciar Staphylococcus
aureus, meio de Teaguer, que diferencia bactérias lactose positivas
(escuras) das lactose negativa (claras).
MacConkey – Lactose+ - rosaEMB – E. coli – verde metálico
Agar manitol sal – S. aureus
– amarelo ouro

60. Obtenção de culturas puras
 Isolamento:
técnica de semeadura por esgotamento, e diluições em
placas com meio sólido.
 Esgotamento:
Consiste em espalhar, com auxílio de alça de inoculação,
suspensão de micro-organismos na superfície do meio de cultivo
sólido, em três setores distintos, de modo que a quantidade de
material contida na alça seja progressivamente menor.
Passos para o sucesso do esgotamento:
a) realizar o maior número de estrias possíveis;
b) não perfurar o meio;
c) não voltar com a alça sobre as estrias;
d) utilizar pequena quantidade de material para semear

61. Esgotamento

63. Técnica de Diluição para obtenção de cultura pura e
contagem de colônias

64. Prática 4
Objetivos:
 Mostrar ao aluno os métodos de obtenção de cultura pura;
 Treinar o aluno na execução da técnica de esgotamento;

65. Execução:
1ª - Técnica do esgotamento para o isolamento de bactérias (obtenção
de cultura em meio sólido)
a) Utilizar a suspensão mista de bactérias (Serratia sp + Micococcus
sp) a ser distribuída pelo professor;
b) Flambar a alça e retirar com ela uma pequena gota da suspensão
mista de bactérias; semeá-las sobre a superfície de um meio (agar
simples) em placas. A semeadura deve ser feita por estrias, de acordo
com o esquema, na seguinte sequência.
1ª operação: colocar a gota na superfície do meio e passar a alça
em zig-zag sem tocar no meio já semeado, cobrindo outro 1/3 da placa;
2ª operação: mudar a direção do estriamento para a 2ª região da
placa, com o mesmo cuidade da região 1, cobrindo outro 1/3 da placa
3ª operação: mudar a direção da estriamento para a parte final
do meio, sem tocar na superfície já semeada.
c) Embrulhar as placas e incubar na estufa a 37°C por 24 horas.

67. Interpretação dos resultados
1) Observar o aparecimento de colônias isoladas nas placas de agar
simples semeadas. Notar o aparecimento de dois tipos
deferentes de colônias. Observar, cor, forma, tamanho, borda,
etc.
2) Retirar com agulha flambada, uma porção de uma colônia
escolhida e transferir assepticamente para o tubo de agar
simples inclinado, fazendo estrias na superfície do agar. Anotar o
nome do aluno e incubar a 37°C por 24 horas.
3) Após este tempo, observar a cultura crescida no tubo de agar
inclinado, verificando sua pureza através do aspecto homogêneo.
Confirmar a pureza realizando Gram e observar a mesma forma e
reação ao Gram de todas as células observadas.