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  1. 1. MÓDULO II Enzimas de Restrição
  2. 2. Enzimas de Restrição: tesouras bioquímicas Laboratório Virtual de Biotecnologia Introdução Em usadas para fragmentar o material 1953, Salvador e genético, deixando as extremidades Giuseppe Bertani da Universidade de das cadeias livres para poderem ser Illinois e Jean Weigle do Instituto de ligadas, em tubos de ensaio, com Tecnologia da Califórnia encontraram material evidências de um sistema imunitário qualquer espécie) abrindo um imenso primitivo leque de possibilidades. em Luria bactérias. Eles genético humano (ou de observaram que certas estirpes da bactéria Escherichia coli eram resistentes a infecções provocadas por vários bacteriófagos infectam parecia bactérias). ser uma (vírus O que fenómeno propriedade da parede da bactéria que restringia o crescimento e a replicação de certos bacteriófagos. Em 1962, Werner Arber forneceu as primeiras evidências de que a resistência dessas bactérias se devia a um complexo de enzimas que reconhecia selectivamente e destruía DNA estranho à bactéria, impedindo assim que os vírus se replicassem. Arber e Stuart Linn conseguiram isolar extractos de E. coli que cortavam de eficiente bacteriófagos. continham a o DNA Estes primeira restrição conhecida. descoberta a de extractos enzima de Estava mais poderosa ferramenta da Biotecnologia. O interesse pelas enzimas As enzimas de endonucleases, restrição, são ou enzimas pertencentes a um grupo especial de enzimas designadas nucleases. Este grupo corresponde ao conjunto das enzimas que genericamente quebram as ligações fosfodiéster que unem os nucleótidos adjacentes nas moléculas de DNA. As enzimas de restrição designam-se endonucleases porque clivam o DNA em posições internas, ao contrário das exonucleases que digerem progressivamente o DNA das Vários anos mais tarde, Werner forma O que são enzimas de restrição? extremidades para o centro. Existem três grupos principais de enzimas de restrição: tipo I, tipo II e tipo III. As enzimas do tipo I e III reconhecem sequências específicas de DNA mas clivam-no em locais muito afastados dessas reconhecimento. sequências Além disso, de estas enzimas necessitam de ATP para se de restrição aumentou em 1973, quando se percebeu que elas poderiam ser moverem ao longo da cadeia de DNA entre o local de reconhecimento e o local de restrição. Estes dois factos 2
  3. 3. tornam estes dois tipos de enzimas de restrição pouco úteis na Biotecnologia. As enzimas de restrição do tipo II reconhecem sequências que Por outro lado, as enzimas de normalmente têm entre quatro e oito restrição do tipo II são ideais por duas nucleótidos de comprimento. Estas razões principais: todas clivam o DNA sequências são de forma previsível e consistente, palindrómicas, ou dentro ou nas imediações do local de cadeias complementares apresentam reconhecimento; e não necessitam de sequências idênticas quando lidas de ATP, sendo que utilizam o magnésio 5’ para 3’. Por exemplo, a enzima como cofactor. EcoRI Já se restrição isolaram do organismos. tipo enzimas II seja, reconhece as a duas seguinte sequência: vários 5’ GAATTC 3’ existem 3’ CTTAAG 5’ de Actualmente, de normalmente mais de 200 enzimas de restrição disponíveis comercialmente, tornando possível cortar o DNA em mais de 100 Quando a EcoRI cliva o DNA, o resultado são dois fragmentos com a seguinte disposição: locais de reconhecimento diferentes. 5’ G O nome das enzimas de restrição 3’ CTTAA reflecte a sua origem. Por exemplo, a enzima EcoRI deve o seu nome ao AATTC 3’ G 5’ O local de restrição, assim como a organismo a partir do qual foi isolada sequência (E coli; sempre o mesmo para cada enzima primeira de restrição do tipo II. Estas enzimas endonuclease identificada). Na tabela clivam o seu local de restrição de um 1 estão algumas enzimas de restrição de dois modos possíveis: e o respectivo organismo a partir do 1) Clivam directamente no meio do qual foram isoladas. local, R = = Escherichia; estirpe RY13; co I = = de reconhecimento, originando é extremidades Organismo Nome da enzima de restrição Bacillus amyloliquefaciens H BamHI Escherichia coli RY13 EcoRI Escherichia coli R245 EcoRII Haemophilus aegyptius HaeIII Haemophilus influenzae Rd HindII Haemophilus influenzae Rd HindIII Providencia stuartii 164 PstI Tabela 1 – Alguns exemplos de enzimas de restrição e respectivo organismo de origem. 3
  4. 4. abruptas. Como exemplo deste tipo para uma determinada enzima do que de extremidades, pode-se referir o uma molécula de DNA que contenha caso apenas algumas centenas de pares de da clivagem originada pela enzima de restrição HaeIII: bases. 5’ GG 3’ CC A digestão de DNA por enzimas de CC 3’ GG 5’ restrição 2) Clivam num local que não o centro do local de restrição, extremidades de originando cadeia simples complementares, chamadas coesivas. Como exemplo deste tipo de extremidades, pode-se referir o caso da clivagem originada pela enzima de restrição EcoRI: processo simples. Basta colocar o DNA em contacto com a enzima à sua temperatura ideal (geralmente 37ºC) em meio de reacção e a enzima inicia o processo de digestão clivando o DNA em vários fragmentos. Aplicações AATTC 3’ 3’ CTTAA das enzimas de As enzimas de restrição foram G 5’ inicialmente As extremidades coesivas são muito Em geral, quanto maior for a DNA, maior probabilidade de que determinado local de será ocorra utilizadas para criar moléculas de DNA recombinante, uma vez que certas enzimas clivam o DNA importantes na clonagem de genes. de um restrição 5’ G molécula é a um deixando as extremidades coesivas. Estas moléculas com extremidades coesivas são posteriormente A acopladas com uma sequência de DNA probabilidade de clivagem de uma de outra origem também digerida com molécula inversamente a mesma enzima de restrição, ou proporcional ao tamanho do local de seja, com as mesmas extremidades reconhecimento da enzima. Assim, coesivas, por intermédio de uma DNA uma enzima que reconheça quatro ligase, nucleótidos clivará uma determinada molécula de DNA recombinante. de DNA é restrição. Estas molécula de DNA uma vez em cada formando-se enzimas uma são nova também 256 pares de bases, enquanto que utilizadas na análise de cromossomas, uma através da realização de mapas de pares enzima de que bases reconheça clivará a cinco mesma restrição; sequenciação de DNA; molécula uma vez em cada 1024 isolamento de genes; e investigação pares de bases. O DNA humano, que forense. Têm ainda um papel importante contém mais de três biliões de pares de bases, terá mais locais de restrição no diagnóstico de certas doenças genéticas onde uma mutação altera o 4
  5. 5. local de restrição de uma enzima, sendo possível distinguir entre genes normais e genes mutados pelo número de fragmentos obtidos com essa enzima de restrição. Este tipo de análise designa-se polimorfismos de análise comprimento de de fragmentos de restrição (restriction fragment length polymorphisms – RFLP’s). Questões de análise 1 – Descreva o modo de actuação de uma enzima de restrição. 2 – Explique por que razão as endonucleases do tipo I e III não são utilizadas em Biotecnologia. 3 – Indique o tipo de extremidades que se podem formar numa molécula de DNA após a clivagem por uma enzima de restrição. 4 – Indique três aplicações das enzimas de restrição. 5
  6. 6. Teoria: ALA METODOLÓGICA Todas as enzimas de Conclusões: restrição cortam do Princípios: mesmo modo a mesma molécula de DNA? Registos/Observações: Pista 1 Conceitos: Desenho experimental: Material biológico DNA pnr-325z DNA beta-Y8 EcoRI HindIII Pista 1 Pista 2 Pista 2 6 ALA CONCEPTUAL
  7. 7. ALA METODOLÓGICA Uma enzima apresenta Teoria: sempre o mesmo resultado, Conclusões: independentemente da Princípios: molécula de DNA utilizada? Registos/Observações: Pista 1 Conceitos: Desenho experimental: Material biológico DNA pnr-325z DNA beta-Y8 EcoRI HindIII Pista 1 Pista 2 Pista 2 7 ALA CONCEPTUAL
  8. 8. ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA Teoria: enzimas de restrição apresenta o mesmo resultado Conclusões: final, quando comparado Princípios: com os resultados individuais? Registos/Observações: Pista 1 Conceitos: Desenho experimental: Material biológico DNA pnr-325z DNA beta-Y8 EcoRI HindIII Pista 1 Pista 2 Pista 2 8 O uso simultâneo de duas

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