1. MÓDULO II
Enzimas de
Restrição

2. Enzimas de Restrição:
tesouras bioquímicas
Laboratório Virtual de Biotecnologia
Introdução
Em
usadas para fragmentar o material
1953,
Salvador
e
genético, deixando as extremidades
Giuseppe Bertani da Universidade de
das cadeias livres para poderem ser
Illinois e Jean Weigle do Instituto de
ligadas, em tubos de ensaio, com
Tecnologia da Califórnia encontraram
material
evidências de um sistema imunitário
qualquer espécie) abrindo um imenso
primitivo
leque de possibilidades.
em
Luria
bactérias.
Eles
genético
humano
(ou
de
observaram que certas estirpes da
bactéria
Escherichia
coli
eram
resistentes a infecções provocadas por
vários
bacteriófagos
infectam
parecia
bactérias).
ser
uma
(vírus
O
que
fenómeno
propriedade
da
parede da bactéria que restringia o
crescimento e a replicação de certos
bacteriófagos. Em 1962, Werner Arber
forneceu as primeiras evidências de
que a resistência dessas bactérias se
devia a um complexo de enzimas que
reconhecia selectivamente e destruía
DNA estranho à bactéria, impedindo
assim que os vírus se replicassem.
Arber e Stuart Linn conseguiram isolar
extractos de E. coli que cortavam de
eficiente
bacteriófagos.
continham
a
o
DNA
Estes
primeira
restrição
conhecida.
descoberta
a
de
extractos
enzima
de
Estava
mais
poderosa
ferramenta da Biotecnologia.
O
interesse
pelas
enzimas
As
enzimas
de
endonucleases,
restrição,
são
ou
enzimas
pertencentes a um grupo especial de
enzimas designadas nucleases. Este
grupo corresponde ao conjunto das
enzimas que genericamente quebram
as ligações fosfodiéster que unem os
nucleótidos adjacentes nas moléculas
de DNA. As enzimas de restrição
designam-se
endonucleases
porque
clivam o DNA em posições internas,
ao contrário das exonucleases que
digerem progressivamente o DNA das
Vários anos mais tarde, Werner
forma
O que são enzimas de restrição?
extremidades para o centro.
Existem três grupos principais de
enzimas de restrição: tipo I, tipo II e
tipo III. As enzimas do tipo I e III
reconhecem sequências específicas de
DNA mas clivam-no em locais muito
afastados
dessas
reconhecimento.
sequências
Além
disso,
de
estas
enzimas necessitam de ATP para se
de
restrição aumentou em 1973, quando
se percebeu que elas poderiam ser
moverem ao longo da cadeia de DNA
entre o local de reconhecimento e o
local de restrição. Estes dois factos
2

3. tornam estes dois tipos de enzimas de
restrição pouco úteis na Biotecnologia.
As enzimas de restrição do tipo II
reconhecem
sequências
que
Por outro lado, as enzimas de
normalmente têm entre quatro e oito
restrição do tipo II são ideais por duas
nucleótidos de comprimento. Estas
razões principais: todas clivam o DNA
sequências
são
de forma previsível e consistente,
palindrómicas,
ou
dentro ou nas imediações do local de
cadeias complementares apresentam
reconhecimento; e não necessitam de
sequências idênticas quando lidas de
ATP, sendo que utilizam o magnésio
5’ para 3’. Por exemplo, a enzima
como cofactor.
EcoRI
Já
se
restrição
isolaram
do
organismos.
tipo
enzimas
II
seja,
reconhece
as
a
duas
seguinte
sequência:
vários
5’ GAATTC 3’
existem
3’ CTTAAG 5’
de
Actualmente,
de
normalmente
mais de 200 enzimas de restrição
disponíveis comercialmente, tornando
possível cortar o DNA em mais de 100
Quando a EcoRI cliva o DNA, o
resultado são dois fragmentos com a
seguinte disposição:
locais de reconhecimento diferentes.
5’ G
O nome das enzimas de restrição
3’ CTTAA
reflecte a sua origem. Por exemplo, a
enzima EcoRI deve o seu nome ao
AATTC 3’
G 5’
O local de restrição, assim como a
organismo a partir do qual foi isolada
sequência
(E
coli;
sempre o mesmo para cada enzima
primeira
de restrição do tipo II. Estas enzimas
endonuclease identificada). Na tabela
clivam o seu local de restrição de um
1 estão algumas enzimas de restrição
de dois modos possíveis:
e o respectivo organismo a partir do
1) Clivam directamente no meio do
qual foram isoladas.
local,
R
=
=
Escherichia;
estirpe
RY13;
co
I
=
=
de
reconhecimento,
originando
é
extremidades
Organismo
Nome da enzima de restrição
Bacillus amyloliquefaciens H
BamHI
Escherichia coli RY13
EcoRI
Escherichia coli R245
EcoRII
Haemophilus aegyptius
HaeIII
Haemophilus influenzae Rd
HindII
Haemophilus influenzae Rd
HindIII
Providencia stuartii 164
PstI
Tabela 1 – Alguns exemplos de enzimas de restrição e respectivo organismo de origem.
3

4. abruptas. Como exemplo deste tipo
para uma determinada enzima do que
de extremidades, pode-se referir o
uma molécula de DNA que contenha
caso
apenas algumas centenas de pares de
da
clivagem
originada
pela
enzima de restrição HaeIII:
bases.
5’ GG
3’ CC
A digestão de DNA por enzimas de
CC 3’
GG 5’
restrição
2) Clivam num local que não o centro
do
local
de
restrição,
extremidades
de
originando
cadeia
simples
complementares, chamadas coesivas.
Como
exemplo
deste
tipo
de
extremidades, pode-se referir o caso
da clivagem originada pela enzima de
restrição EcoRI:
processo
simples.
Basta colocar o DNA em contacto com
a enzima à sua temperatura ideal
(geralmente
37ºC)
em
meio
de
reacção e a enzima inicia o processo
de digestão clivando o DNA em vários
fragmentos.
Aplicações
AATTC 3’
3’ CTTAA
das
enzimas
de
As enzimas de restrição foram
G 5’
inicialmente
As extremidades coesivas são muito
Em geral, quanto maior for a
DNA,
maior
probabilidade
de
que
determinado
local
de
será
ocorra
utilizadas
para
criar
moléculas de DNA recombinante, uma
vez que certas enzimas clivam o DNA
importantes na clonagem de genes.
de
um
restrição
5’ G
molécula
é
a
um
deixando as extremidades coesivas.
Estas moléculas com extremidades
coesivas
são
posteriormente
A
acopladas com uma sequência de DNA
probabilidade de clivagem de uma
de outra origem também digerida com
molécula
inversamente
a mesma enzima de restrição, ou
proporcional ao tamanho do local de
seja, com as mesmas extremidades
reconhecimento da enzima. Assim,
coesivas, por intermédio de uma DNA
uma enzima que reconheça quatro
ligase,
nucleótidos clivará uma determinada
molécula de DNA recombinante.
de
DNA
é
restrição.
Estas
molécula de DNA uma vez em cada
formando-se
enzimas
uma
são
nova
também
256 pares de bases, enquanto que
utilizadas na análise de cromossomas,
uma
através da realização de mapas de
pares
enzima
de
que
bases
reconheça
clivará
a
cinco
mesma
restrição;
sequenciação
de
DNA;
molécula uma vez em cada 1024
isolamento de genes; e investigação
pares de bases. O DNA humano, que
forense.
Têm ainda um papel importante
contém mais de três biliões de pares
de bases, terá mais locais de restrição
no
diagnóstico
de
certas
doenças
genéticas onde uma mutação altera o
4

5. local de restrição de uma enzima,
sendo possível distinguir entre genes
normais
e
genes
mutados
pelo
número de fragmentos obtidos com
essa enzima de restrição. Este tipo de
análise
designa-se
polimorfismos
de
análise
comprimento
de
de
fragmentos de restrição (restriction
fragment
length
polymorphisms
–
RFLP’s).
Questões de análise
1 – Descreva o modo de actuação de
uma enzima de restrição.
2
–
Explique
por
que
razão
as
endonucleases do tipo I e III não são
utilizadas em Biotecnologia.
3 – Indique o tipo de extremidades
que se podem formar numa molécula
de DNA após a clivagem por uma
enzima de restrição.
4
–
Indique
três
aplicações
das
enzimas de restrição.
5

6. Teoria:
ALA METODOLÓGICA
Todas as enzimas de
Conclusões:
restrição cortam do
Princípios:
mesmo modo a mesma
molécula de DNA?
Registos/Observações:
Pista 1
Conceitos:
Desenho experimental:
Material biológico
DNA pnr-325z
DNA beta-Y8
EcoRI
HindIII
Pista 1
Pista 2
Pista 2
6
ALA CONCEPTUAL

7. ALA METODOLÓGICA
Uma enzima apresenta
Teoria:
sempre o mesmo resultado,
Conclusões:
independentemente da
Princípios:
molécula de DNA
utilizada?
Registos/Observações:
Pista 1
Conceitos:
Desenho experimental:
Material biológico
DNA pnr-325z
DNA beta-Y8
EcoRI
HindIII
Pista 1
Pista 2
Pista 2
7
ALA CONCEPTUAL

8. ALA CONCEPTUAL
ALA METODOLÓGICA
Teoria:
enzimas de restrição
apresenta o mesmo resultado
Conclusões:
final, quando comparado
Princípios:
com os resultados
individuais?
Registos/Observações:
Pista 1
Conceitos:
Desenho experimental:
Material biológico
DNA pnr-325z
DNA beta-Y8
EcoRI
HindIII
Pista 1
Pista 2
Pista 2
8
O uso simultâneo de duas