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  1. 1. MÓDULO IV Southern Blotting
  2. 2. Southern Blotting: analisando borrões de DNA Laboratório Virtual de Biotecnologia Introdução iluminando o gel com luz UV, o que A técnica de Southern blotting permite observar as bandas de DNA permite a detecção de moléculas de originadas. Fotografa-se o gel para o DNA, poder comparar posteriormente com o após a sua separação electroforética, por hibridação com uma sonda cuja sequência complementar à desenvolvida por Southern, honra em desse é solução alcalina para desnaturar o M. DNA, uma vez que ele tem que estar se qual Depois, o gel é imerso numa Foi DNA. Edmund do resultado do Southern blotting. em baptizou a técnica. cadeia simples para, posteriormente, hibridar com a sonda. Apesar de ter sido superada pela Após neutralização do pH por imersão PCR, esta técnica continua a ter muita numa solução apropriada, o gel é utilidade em diversas áreas. É uma colocado sobre um papel de filtro ferramenta extremamente poderosa grosso que está em contacto com na análise da estrutura de genes, por uma solução-tampão salina. Por cima exemplo. do gel são colocados por esta ordem uma membrana de nylon (ou O que é a nitrocelulose), uma camada de folhas técnica de Southern blotting? de papel absorvente e um objecto A técnica de Southern blotting baseia-se na habilidade de uma pesado. Assim, a solução-tampão salina passa para as folhas de papel cadeia de DNA para procurar e se absorvente, ligar à sua sequência complementar, transferindo o DNA do gel para a fenómeno denominado hibridação. membrana A realização um de do nylon. As gel, cadeias Southern simples de DNA ligam-se à membrana blotting envolve várias etapas (Fig.1): de nylon (blotting) na mesma posição Após ter sido extraído, o DNA é que ocupavam no gel. Este é um clivado com uma (ou mais) enzima de processo lento e demora cerca de 14 restrição e os fragmentos resultantes horas são processo de blotting, o DNA é fixado à separados de através electroforeticamente a estar concluído. num gel de agarose. A visualização membrana dos Após o administração de calor. fragmentos é feita utilizando de nylon pela brometo de etídio para corar o DNA e 2
  3. 3. A seguir, a membrana é incubada demora 24 horas ou mais a ser com um DNA heterólogo, em geral realizado. Após várias lavagens, para DNA de esperma de salmão, sendo remover restos de sonda e ligações coberta com este para impedir a não posterior ligação não específica da híbridos sonda (pré-hibridação). Em paralelo, exposição da membrana de nylon a prepara-se uma sonda de DNA (ou um RNA) (autorradiografia). em cadeia incorporação de simples por nucleótidos radioactivos. nylon e a sonda são misturadas num gel, de feita raios Comparando por X o é possível do identificar as que são DNA A interpretação dos resultados de um moléculas análise suficientemente é dos complementares à sonda. que a sonda vai emparelhar com as DNA detecção radioactivos filme regiões processo designado hibridação, em de a filme obtido com a fotografia original do Seguidamente, a membrana de específicas, Southern blotting visual das envolve a bandas complementares, formando duplexes autorradiográficas radioactivos. O processo de hibridação tamanho e a presença dos ácidos que indicam o 1. Extracção do DNA das células 2. Restrição do DNA por enzimas de restrição (formação de fragmentos) 3. Electroforese (separação dos fragmentos de DNA) 4. Blotting (transferência dos fragmentos para a membrana de nylon) 5. Hibridação (incubação dos fragmentos de DNA com uma sonda radioactiva) 6. Autorradiografia 7. Análise e interpretação dos resultados Figura 1 – Sequência das diferentes etapas de um Southern blotting. 3
  4. 4. nucleicos na amostra. A ausência de bandas indica sequências a ausência Esta técnica foi muito importante de na complementares para variedade a compreensão de de biológicos, processos uma amostra. A presença de bandas cujo tais como, o splicing de RNA, o peso molecular difere das amostras rearranjo genómico que ocorre em normais podem indicar uma alteração determinadas situações e a detecção no material genético. de oncogenes rearranjados. Ao longo dos últimos anos, foram A técnica de Southern blotting feitos vários melhoramentos a esta pode ser utilizada para distinguir dois técnica. foram indivíduos ou estirpes diferentes de desenvolvidos métodos mais rápidos um organismo que diferem na sua de realizar o processo de blotting. Em constituição vez de recorrerem à capilaridade, comum foram genes Por exemplo, desenvolvidos electroforéticos ou métodos que utilizá-la É para homólogos ou também identificar similares de o diferentes organismos, usando como vácuo. Além disso, muitos dos passos sonda o gene de um dado organismo. envolvidos É nesta utilizam genética. técnica foram ainda muito utilizada na parcialmente automatizados, tornando identificação de genes associados a o doenças genéticas, como nos casos da processo menos menos moroso entediante e até para os investigadores. doença de falciforme, Huntington, fibrose anemia quística, entre outras. Aplicações da A utilidade da técnica de Southern técnica de Southern blotting blotting é limitada quando o local A técnica de Southern blotting é bastante específica dependendo para características da e sensível, isso desconhecido. depende da gene A anormal sua proximidade é acuidade entre a sequência nucleotídica que está a ser utilizada. Em muitos casos, pode dar investigada e a sequência do gene. informações que não poderiam ser Contudo, esta limitação não se aplica obtidas recorrendo a qualquer outro às sondas para os genes actualmente método. identificados desta que do é Através sonda das exacto técnica, é como sendo possível detectar um fragmento de responsáveis por doenças genéticas, restrição único no meio de cerca de uma vez que a sequência desses um milhão de fragmentos que podem genes é bem conhecida. resultar genómico da clivagem de um de DNA organismo eucariótico com enzimas de restrição. 4
  5. 5. Questões de análise No Laboratório Biotecnologia Virtual encontrará de uma animação que ilustra e explica cada etapa da técnica de Southern blotting (canal 2 da LVBtv). 1 – Descreva as diferentes etapas de um Southern blotting. 2 – Enumere as principais vantagens e desvantagens desta técnica relativamente a outras utilizadas para identificar sequências de DNA. 3 – Faça necessário uma para lista do realizar material uma experiência utilizando esta técnica. 4 – Indique duas aplicações desta técnica. 5
  6. 6. ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA Teoria: apresenta sempre o Conclusões: mesmo resultado, Princípios: independentemente da amostra de DNA utilizada? Registos/Observações: Pista 1 Conceitos: Desenho experimental: Material biológico DNA alfa-C5 DNA beta-A7 Sonda 1 Sonda 2 Sonda 3 Pista 1 Pista 2 Pista 2 6 A mesma sonda
  7. 7. ALA CONCEPTUAL ALA METODOLÓGICA Teoria: do mesmo modo a Conclusões: mesma amostra de DNA? Princípios: Registos/Observações: Pista 1 Conceitos: Desenho experimental: Material biológico DNA alfa-C5 DNA beta-A7 Sonda 1 Sonda 2 Sonda 3 Pista 1 Pista 2 Pista 2 7 Todas as sondas marcam
  8. 8. ALA CONCEPTUAL O uso simultâneo de ALA METODOLÓGICA Teoria: os resultados obtidos, Conclusões: quando comparado com Princípios: os resultados individuais das sondas? Registos/Observações: Pista 1 Conceitos: Desenho experimental: Material biológico DNA alfa-C5 DNA beta-A7 Sonda 1 Sonda 2 Sonda 3 Pista 1 Pista 2 Pista 2 8 duas sondas influencia

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