Apresentação da FIOCRUZ

1. Técnicas Básicas de Biologia
Molecular
Diamar Costa-Pinto
FIOCRUZ

2. Visão da Apresentação
PCR
Bibliotecas genômica e de expressão
Fragmentação - digestão
Separação - eletroforese
Clonagem molecular
Sequênciamento
Southern, Northern e Western blotting
By Diamar

3. Diagnóstico do século 21
- Podemos fazer análises genômicas,
pois a maioria dos cromossomo já estão
mapeados.
- O projeto genoma tem sido uma
grande ferramenta para unir genomas e
laboratório clínico.
Mapas Genéticos, Citológicos e
Físicos
EST – Sequências expressas marcadas.
cDNA curtos que ligam mapas físicos a
genéticos
RFLP- Polimorfismo dos comprimentos
dos fragmentos de restrição
By Diamar

4. Procurar um gene dentro de um genoma
humano é comparável a procurar uma pessoa
sem sobrenome em uma casa sem endereço
em uma rua desconhecida em uma cidade não
identificada de um país estrangeiro.
Solange Farah
By Diamar

5. Enzimas de Restrição
1953 – a eficiência de replicação de um
bacteriófago dependia da célula hospedeira
Verificou-se, então, a presença de nucleases
Bactéria restringe o crescimento do fago e
protege o seu DNA metilando-o (modificando)
Fenômeno chamado restrição/modificação
Advento das endonucleases de restrição
Sítio é normalmente uma palíndrome
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6. Enzimas de Restrição
(continuação)
Palíndrome:
ARARA
ARARA
OMO
OMO
ANA
ANA
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7. Enzimas de Restrição
(continuação)
Reconhecem seqüências de 4 a 8 pares de
bases
Cortes com extremidades abruptas ou coesivas
Primeira letra maiúscula é gênero e as duas
outras minúsculas são espécies
1073 – foram usadas para clonagem molecular
Pode-se recombinar DNA humano com qualquer
outra espécie
Fragmentos separados por eletroforese
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8. Enzimas de Restrição
(continuação)
By Diamar

9. By Diamar

10. Vídeo de Enzima de
Restrição
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11. Eletroforese
Já conhecida desde 1930
Difundida em 1950-1960
Movimentação de moléculas submetidas a
campo elétrico
Usa um substrato: papel, agarose,
poliacrilamida
Separa proteínas por cargas e peso molecular
Separa ácido nucléicos por peso molecular
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12. Eletroforese
Fonte de eletroforese
Vertical
- +
Visualização do gel de agarose
-
Horizontal
+ By Diamar

13. Eletroforese
By Diamar

14. Vídeo de Eletroforese
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15. Clonagem Molecular
Consiste no isolamento e propagação de
moléculas de DNA idênticas
Primeiro: inserto + vetor = rDNA
Segundo: rDNA + célula hospedeira =
transformação
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16. By Diamar

17. Engenharia Genética (1970): o DNA recombinante permite isolar um
gene específico, com uma característica desejada, e transfere este
gene para outro organismo vivo
Célula humana Bactéria
DNA
Plasmídeo
Transformação
DNA da bactéria
Digestão Enzima de restrição
Tesoura genética
rDNA
Clonagem
DNA da célula humana
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18. O DNA recombinante
Não se limita a organismos de uma mesma espécie
A compatibilidade sexual torna-se irrelevante
Permite modificações em uma única geração, o que
antes levaria dezenas ou centenas de gerações
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19. Vídeo de Clonagem
Molecular
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20. Vetor
São moléculas de transporte
Moléculas de DNA
Diversos tipos: plasmídeos, cosmídeos, fagos,
vírus, YACs, etc.
Diferenças de tamanho de inserto
Podem ter comportar linear e/ou circular
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21. Vetor
(continuação)
Vetores de expressão procarióticos
Promotores fortes
Sítios de ligação a ribossomos
Sítios de clonagem
Vetores de expressão eucarióticos
Origem de replicação eucariótica
Região de controle de transcrição e tradução,
poliadenilação de mRNA, capping
Sinais especiais para processamento e secreção
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22. Vetor
(continuação)
Características gerais
Região promotora
Sítio Múltiplo de Clonagem - Polylinker
Gene de resistência a antibióticos
Origem de replicação
Gene repórter
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23. Vetor
(continuação)
PLASMÍDEOS:
Penetra naturalmente nas bactérias
Fita dupla
Circular
Extracromossômico
Resistência a antibióticos
Vetores shuttle
Insertos até 4000 pb
pUC 18, pUC 19
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24. Vetor
(continuação)
FAGOS
Vírus de bactérias
Fago λ é o mais utilizado
Fita dupla linear
Recirculariza durante a infecção na bactéria
Aceita até 20 mil pb
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25. Vetor
(continuação)
COSMÍDEOS
Pequeno tamanho 4 a 6 Kb
Engenherado: empacota rDNA no capsídeo do
fago para infectar bactéria
Possuem seqüências cos
Aceitam insertos de até 50 mil pb
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26. COSMÍDEOS
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27. Vetor
(continuação)
YACs (Yeast Artificial Chromosome)
Células hospedeiras as leveduras
Comportam-se como cromossomos
Aceitam 400 mil pb
Possuem seqüências de DNA específicas de
levedura: telômero, centrômero e origem de
replicação
ARS: Seqüência de replicação autônoma
CEN: Seqüências centroméricas
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28. Engenharia Genética – Produção em série
- Hormônio de crescimento
- Insulina humana
- Vacina da Hepatite B
- Hormônio sexuais
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29. Sequenciamento
Frederick Sanger (1977), Inglaterra
Segundo Prêmio Nobel
Síntese de DNA in vitro por término
didesoxi
Mapa físico dos genes e dos
cromossomos
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30. Sequenciamento
(continuação)
Hood: Semi-automatizado (1986)
Venter: Genoma de bactéria usando
ddNTPs fluorescentes automatizados,
robóticas e PCR (1995)
Perkins-Elmer Corp: Comercializado o
Sequenciamento totalmente automatizado
(1999)
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31. Considerações
P P
P A P A
C
P P C
C5 BN G C5 BN G
C4 C1 T C4 C1 T
U
Ribose Pentose
C3 C2 C3 C2
OH OH OH OH
NTP ddNTP (Didesoxinucleotídeo)
dNTP
O - Necessário
para ligação
Ácido ribonucleico fosfodiéster
Ácido desoxirribonucleico
5’ 3’
Polimerização
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32. Estuda a integridade da sequência de um DNA
molde. Analisa diferentes tamanhos de
fragmentos formados a partir de um primer e da
inserção randômica de dNTPs (polimeriza) e
Sequenciamento ddNTPs (para a reação) em gel de poliacrilamida.
A C G T
DNA molde
Primer
DNA polimerase
T G C A
Fragmento 1
ddNTP dNTP dNTP dNTP
C A
Fragmento 2
ddNTP dNTP
G C A
Fragmento 3
ddNTP dNTP dNTP
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33. Sequenciamento automatizado

34. Vídeo do Sequenciamento
(Cycseqpc)
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35. Southern Blotting
E. M. Southern (1975)
Fragmentos de DNA são separados em gel de
agarose
Transferidos para membranas por ação capilar
DNA é desnaturado antes ou durante a
transferência
Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na
membrana
Detecta polimorfismo de DNA ou mutação
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36. Southern blot
Descrição:
- Digestão do DNA em teste com enzimas
de restrição;
- Resolução dos fragmentos com
eletroforese em gel de agarose;
- Transferência do DNA para membrana de
nylon;
- Hibridação com uma sonda de DNA ou
RNA marcada com radioatividade ou
quimioluminescentes
Aplicação: Alterações em um único
nucleotídeos; detecção de inserções, deleções
e rearranjos; ordenamento de fragmentos do
DNA em um mapa físico; fragmentos de
cromossomo.
Com o advento da PCR seu uso tornou-se
limitado.
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37. Southern blot
46, XY.Síndrome da insensibilidade
androgênica. Vagina em fundo de
saco, sem útero ou tubas uterinas.
1:20.000. Testículos no abdome ou Exemplo da especificidade das
canal inguinal (confundidos com sondas.
Sonda de cDNA para o
hérnias, na infância). Defeito
gene humano ligado ao X
molecular: varia de deleção
de receptor de andrógeno
completa do gene a mutações de
hibridando no genoma
ponto nos domínios de ligação de
digerido do paciente.
andrógenos ou ligação ao DNA da
proteína receptora de andrógeno.
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38. Vídeo de Southern blot
(DNA _DetectivePC)

39. Northern blotting
Corrida de RNA totais ou mRNA em gel de
agarose
RNAs devem ser desnaturados (formaldeído)
Sensibilidade a RNAses
Transferência para membrana por ação capilar
Sondas de RNA ou DNA para hibridar
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40. Northern blotting
(Continuação)
Úteis em estudo de expressão gênica
Estudo de diferentes tecidos
Estuda o padrão temporal de expressão
de genes durante o crescimento do
indivíduo
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41. Northern blotting
Marcadores
rRNA
RNAs totais de raízes (R), folhas (L) e flores (F).
A – sonda de α-tubulina – hibrida todos
B - sonda de α1- tubulina – hibrida só flores
C - sonda de α3- tubulina – hibrida todos
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42. Western blotting
Corrida de proteínas em gel de poliacrilamida
Separação e caracterização de proteínas
Uso de SDS (sódio dodecil sulfato) para
desnaturação
Transferência para membrana por força elétrica
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43. Western blotting
(continuação)
Proteína alvo é identificada por anticorpo mono
ou policlonal
Revelação do sistema com anticorpo secundário
fluorescente ou radioativo
Informa o tamanho e a quantidade das proteínas
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44. Western blotting
By Diamar

45. Western blotting
Análise de proteínas por anticorpos específicos após
eletroforese e transferência para membrana.
By Diamar

46. Vídeo Immunoblotting
(3EIMMBLOT)

47. RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos
fragmentos de restrição
Uso de enzimas de restrição
Produção de fragmentos de DNA de tamanho
adequados para serem utilizados
As Enzimas de restrição são: previsíveis, pouco
frequentes e clivam fragmentos sítio-específicos de
DNA
Aplicação: compara alelos normais e afetados para
cada mutação estudada.

48. Mapa de Restrição
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49. PCR - RFLP
By Diamar

50. RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos
fragmentos de restrição
Um caso de erro inato do metabolismo:
G-6-P-D (glicose-6-fosfato-desidrogenase)
By Diamar

51. RFLP de Planta
DNAs genômico de
Arabidopis é digerido
com EcoRI.
Southern blotting
com sonda azul e
verde.
F1 é heterogênio
possui fragmentos de
ambos os genitores.
F1 autopoliniza:
1:2:1 Ecotipo
diferentes: C-
Colombia, N-
Niederzenzes e H –
Heterozigoto.

52. Oligonucleotídeo alelo-
específico (ASO)
Descrição:
- Hibridação preferencial de sonda
marcada para testar DNA com composição
de bases complenmentar única.
Aplicação:
- Alelos de composição conhecida.
Mutação é conhecida. Revela uma única
alteração de base. Distingue hetero ou
homozigotos para a sequência. A análise é
restrita a mutação familiar conhecida ou para
distúrbios genéticos com nº finito de
mutações diferentes. Ex: beta-talassemia.
By Diamar

53. FISH
Hibridação in situ com fluorescência
Detecta DNA localizados dentro de cromossomos
Usa lâminas de microscopia
Cromossomos estão em metáfase, anáfase e
interfase
Usa sondas de DNA específicas
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54. FISH
(Hibridação in situ com fluorescência)
Prader-Willi: Imprinting genômico deleção no
cromossomo 15 paterno.
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55. By Diamar
FISH
(Hibridação in situ com fluorescência)
Relação evolutiva
entre cromossomos.
DNA de gibão
Hylobates lar
sondado com DNA
Humano.
Setas indicam
cromossomo 8 do
gibão.
Cromossomo
humano 4 hibrida
com cromossomo
(laranja) do macaco
verde africano.
Evolução cromossômica em mamíferos

56. SSCP
Single-strand conformational polymorphism
Polimorfismo Conformacional da Fita Simples
Método baseado na
mobilidade eletroforética.
Protocolo Básico
Gel não desnaturante. PCR do gene alvo.
Sensível para DNA desnaturado.
tamanho e forma da fita
(eletroforese)
simples.
Mobilidade diferente
Detecta a mudança da normal indica
de uma base. mutação.
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57. SSCP
Single-strand conformational polymorphism
Polimorfismo Conformacional da Fita Simples
Heterozigoto
Fragmentos até
200 pb – 90% de
sensibilidade.
Fragmentos
maiores que 400 pb
- 80% de
sensibilidade.
(digestão )

58. Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
Southern blotting em lâmina
Chips de genes
Pode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotídicas
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59. Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
Microdisposição de oligo ou de sondas
- Microssíntese de oligos in situ (no chip)
- Distribuição de sondas oligonucleotídicas pré
fabricadas
- Distribuição de fragmentos de DNA ou cDNA
Hibridação com mRNA ou cDNA fluorescentes
Leitura por scanners
By Diamar

60. Microarray
Microarranjos de DNA – Chips de DNA
É uma técnica que emprega arranjos (arrays),
que contêm um grande número de genes
roboticamente distribuídos de forma ordenada em
uma placa de vidro.
Pode comparar a expressão de um grande
número de gene, simultaneamente.
Existem lâminas de 400.000 pontos.
São feitas com ponteiras de titâneo.
By Diamar

61. Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
Detecção de mutações gênicas e de polimorfismos
Detecção de Expressão gênica em diferentes tecidos
sob condições normais e anormais
Sequenciamento do DNA e genotipagem

62. Microarray – Chip de DNA –
Microarranjos de DNA
Contras Utilização
Técnica cara - Mapear mutações
Sensibilidade é reduzida - Oncogenes
Lâminas não são reutilizadas - Expressão das vias
metabólicas
Repetir várias vezes - Regiões regulatórias
de genes de levedura
Grande quantidade de - Expressão de genes
mRNA (2 a 5 µg) anônimos
- Analisar 10.000 amostras
em 12 horas

64. Microarray – Chip de DNA – Microarranjos de DNA
Descrição:
- Hibridação do DNA em
teste com disposições
ordenadas de nucleotídeos
em chip de silicone.
Aplicação:
- Detecção de DNA em
teste com composição
conhecida.
By Diamar

65. Referências Bibliográficas:
MARSHALL, A., and HODGSON, J. 1998. DNA chips: array
of possibilities. Nature Biotechnology, 16:27-31.
MULLINS, K. B. 1990. The unusual origin of polymerase
chain reaction. Sci. Amer. 262(4): 56-65.
SANGER, F., Nickelen, S. And Coulson, A. R. 1977. DNA
sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S. 74:5463-5467.
SOUTHERN, E.M. 1975. Detection os specific sequences
among DNA fragments separated by gel eletrophoresis. J.
Mol. Biol. 98:503-517.
By Diamar

66. Obrigada!
By Diamar