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Recombinação Gênica
Tallita Tavares
Mestranda em Ciências Marinhas Tropicais
© 2004 Pearson Education, Inc.
• Recombinação genética
• Troca física de material genético.
– Recombinação homóloga: Troca de seqüências homólogas de
DNA a partir de duas linhagens distintas;
– Envolve a participação de cerca de 25 genes (E. coli);
– Vias redundantes (garantia de continuidade do processo)
• Ex: Gene recA, presente em Bacteria, Archaea e Eucarya,
leva a produção de RecA, essencial a quase todas as vias
de recombinação.
Processo:
Gene A
Gene B
Gene A
Gene A
© 2004 Pearson Education, Inc.
• Se as sequências homólogas forem diferentes...Podem ser
formados novos genótipos:
– Em Eucariotos: Cromossomos homólogos são diferentes;
– Em Procariotos: Como introduzir um outro DNA diferente na
célula?
• É necessário um doador diferenciado do material a ser recombinado.
Como?!
• Recombinação entre fragmentos de DNA homólogo de um
doador e de um receptor por:
– TRANSFORMAÇÃO;
– TRANSDUÇÃO ;
– CONJUGAÇÃO
•
© 2004 Pearson Education, Inc.
• Transformação (envolve a presença de DNA livre da
célula doadora que é incorporado por uma receptora
que pode passar a apresentar alterações genéticas).
• Transdução (transferência de DNA de uma célula para
outra mediada por um vírus).
• Conjugação (transferência mediada pelo contato entre
as céls).
© 2004 Pearson Education, Inc.
Processos de transferência de DNA
© 2004 Pearson Education, Inc.
© 2004 Pearson Education, Inc.
Como detectar recombinantes ?
Transformação
• Para ocorrer, a doadora deve ter sofrido uma lise branda
para não lisar o DNA;
• A receptora deve ter competência:
– capacidade de captação do DNA exógeno;
– determinada geneticamente e regulada;
– envolve proteínas na captação e processamento do DNA
(autolisinas, ligases, nucleases, etc).Bacillus: quorum sensing.
Transformação
• O DNA pode ser captado como DNA de fita simples ou de fita
dupla. PROCESSO:
• Ligação da célula ao DNA exógeno por meio de uma proteína de
ligação ao DNA;
• Captação e ligação a proteína de transferência (protege o DNA de
proteases até chegar ao cromossomo);
• Junto ao cromossomo, há a invasão da fita, promovida pela RecA;
• Após a recombinação, a replicação gera duas fitas – uma parental e
uma recombinante.
• Gêneros de bactérias naturalmente competentes – Acinetobacter,
Azotobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria,
Thermus.
© 2004 Pearson Education, Inc.
TRANSFORMAÇÃO (Griffith, década de 20)
© 2004 Pearson Education, Inc.
• OBS1: Pode ocorrer a transfecção – bactérias são transformadas
por um DNA oriundo de um vírus (fago).
• OBS2: Muitos procariotos não são transformáveis naturalmente -
Competência artificialmente induzida – E. coli em ↑[CaCl2]e
incubadas a baixas temperaturas.
• Eletroporação – tratamento das células com pulso elétrico de
duração controlada que promove a formação de poros na
membrana celular.
© 2004 Pearson Education, Inc.
Eletroporador Cubetas
Transdução
• Transferência mediada por vírus. Mas como o DNA chega ao vírus?
– Infecção → inserção de seu DNA → empacotamento de fragmentos
do DNA do hospedeiro junto ou em vez do seu (PARTÍCULA
TRANSDUTORA)
• Transdução generalizada: DNA derivado de qualquer região do
genoma, substituindo o do vírus
– Se os genes não recombinarem-se com os da receptora, serão
perdidos;
• Transdução especializada: Sequência de DNA específica, integra-
se ao DNA viral
– Se não recombinarem, são incorporados pelo vírus.
© 2004 Pearson Education, Inc.
TRANSDUÇÃO
Generalizada
Vírus defectivo
Transdução
especializada
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Transdução comumente ocorre em:
• Desulfovibrio, Escherichia, Pseudomonas,
Rhodococcus, Rhodobacter, Salmonella,
Staphylococcus e Xanthobacter.
• Methanothermobacter thermoautotrophicus
© 2004 Pearson Education, Inc.
Plasmídeos
Elementos genéticos que se replicam independentemente
do cromossomo da células hospedeira
Não contêm genes necessários à célula sob todas as
condições
Diferentes dos vírus: Não apresentam forma
extracelular, existindo no interior das células como
ácidos nucléicos
© 2004 Pearson Education, Inc.
Natureza física dos plasmídeos
• DNA de fita dupla
• Maioria circular
• 1 a 1000 pares de quilobases
• 1/20 do tamanho do cromossomo
• Superenovelados
• Podem ser diferentes na mesma célula (circulares
ou lineares)
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Replicação dos plasmídeos
• Genes plasmidiais controlam a replicação.
• Cópias de plasmídeos: em geral, 1 a 3 cópias, mas já foram
encontrados até mais de 100 cópias!
• Semelhante a reprodução do cromossomo (origem de replicação,
bidirecional).
C U R I O S I D A D E S :
• Epissomos: plasmídeos que podem se integrar ao cromossomo e
serem repicados por ele.
• Cura: eliminação de plasmídeos pela célula.
• Incompatibilidade: impedimento de incorporação de plasmídios.
© 2004 Pearson Education, Inc.
Plasmídeos de resistência
• Plasmídeos R : resistência a antibióticos e inibidores de
crescimento
• Ex: plasmídeo R100 confere resistência à sulfonamidas,
estreptomicina, cloranfenicol, tetraciclina, ácido fusídico,
espectinomicina e mercúrio.
• R100 poder ser transferido para: Escherichia, Klebsiella,
Proteus, Salmonella e Shigella
• Ameaça a terapia antimicrobiana tradicional !
© 2004 Pearson Education, Inc.
FIGURA 10.19
Plasmídeo R
© 2004 Pearson Education, Inc.
Toxinas
• Codificada por genes plasmidiais de virulência
• Ex: fator de colonização (CFA) de Escherichia coli: adesão às
células epiteliais do intestino.
• Produção de hemolisina e enterotoxina (diarréia).
© 2004 Pearson Education, Inc.
Bacteriocinas
• Peptídeos que inibem ou matam espécies
relacionadas.
• Exemplos:
– E. coli: colicinas, plasmídeos Col
– Bacillus subtilis: subtilisinas
– Lactobacillus: Nisina A
© 2004 Pearson Education, Inc.
Conjugação
• Contato entre células;
• Presença de um plasmídeo
conjugativo na célula doadora;
• Célula doadora (macho ou +) e a
receptora (fêmea ou -);
•Plasmídeo conjugativo: contém
informações para síntese do pilus
sexual e para a formação do par de
acasalamento.
© 2004 Pearson Education, Inc.
Transferência de DNA plasmidial por conjugação
© 2004 Pearson Education, Inc.
FIGURA 10.21 B
Após a transferência...
• A célula receptora de plasmídeos conjugantes deve ser
capaz de:
– Sintetizar o pilus sexual;
– Mobilizar o DNA para transferência;
– Alterar seus receptores de superfície para tornar a célula
incapaz de ser receptora de plasmídeos similares;
– Exibir as características presentes no plasmídeo.
Conjugação ao cromossomo bacteriano
• Alguns plasmídeos podem, ainda, se inserir no cromossomo
bacteriano através de sequências de inserção:
• Quando inseridos, têm replicação controlada pelo
cromossomo, mas os genes de conj. continuam ativos:
– Podem mobilizar a transferência deste ou...
– De partes dele (mais comum);
* Como há replicação, a nova cél. doadora adquire os genes plasmidiais;
** Quando na célula receptora, o cromossomo pode recombinar com o
original.
*** O plasmídeo tb pode excisar levando partes do cromossomo bacteriano.
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Confecção de mapas genéticos
© 2004 Pearson Education, Inc.
Mapa genético
© 2004 Pearson Education, Inc.
Transposição
• Processo em que um gene se move de um local para outro
no genoma (não ocorre entre seqüências homólogas e não
utiliza o sistema geral de recombinação da célula).
• Evento raro: 10-5 – 10-7
• Tipos de transposição:
– Conservativa
– Replicativa
• Podem transportar genes de resistência a
antibióticos.
• Elementos transponíveis:
– Transposons
– Seqüências de inserção
– Alguns vírus (Mu)
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FIGURA 10.32
Mutagênese por transposição
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Técnicas de genética bacteriana
In vitro
Enzimas de restrição
• Reconhecem e clivam sequências de DNA;
• Clivam 1 ou 2 fitas;
• Função natural:
– Proteção das células contra DNAs estranhos, excisando-os.
• Artificialmente:
– Usadas opostamente: para inserir DNAs estranhos!
• Reconhecem sequências curtas e palindrômicas,
em geral.
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Endonucleases de restrição
Palíndromo:
Socorram-me subi no ônibus em Marrocos
EcoRI EcoRI metilase
© 2004 Pearson Education, Inc.
© 2004 Pearson Education, Inc.
Os fragmentos obtidos podem ser analisados por
eletroforese
Sequenciamento do DNA
• Década de 70;
• Maxam e Gilbert (agentes químicos clivavam o DNA em vários
pontos);
• Dideoxi de Sanger (síntese de fita complementar na presença de
dideoxi-nucleotídeos)
 Ambos geram fragmentos radioativos de DNA podendo apresentar uma das
4 diferentes bases ao final de cada molécula.
 Os fragmentos são separados por eletroforese, onde a diferença no
tamanho corresponde a um nucleotídeo
 Ao fim é feita uma auto-radiografia para detecção da altura das bandas e
determinação da sequência
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© 2004 Pearson Education, Inc.
© 2004 Pearson Education, Inc.
44
Sequenciador automático MegaBace
Parte de um eletroferograma gerado no sequenciamento
automático de DNA
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Clonagem molecular
• Transferência de um gene de um genoma para outro;
• Etapas:
– Isolamento do DNA original
– Ligação em um vetor (plasmídios e vírus são os mais usados);
– Introdução e manutenção em um hospedeiro.
(Biblioteca de DNA ou biblioteca genômica)
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Vetores de clonagem
• Plasmídeos:
– pequenos;
– origem de replicação própria;
– múltiplas cópias (presentes em grandes quantidades na cél);
– marcas de seleção (seleção dos clones positivos).
• Limitação: tamanho do inserto (até 10kb).
• Ex: pBR322
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FIGURA 10.41
pBR322
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© 2004 Pearson Education, Inc.
Vetores de clonagem
• Bacteriófagos:
– Permitem a utilização de insertos maiores (até 20kb);
– Clonagem mais eficiente (transdução).
• Cosmídios
– Plasmídeos com genes de bacteriófagos:
• gene exógeno + dna plasmidial + dna fago (sequência para encapsulação)
– Podem ser clonados grandes fragmentos;
– Proteção da do envoltório viral.
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Reação em cadeia da polimerase (PCR)
• Rápido aumento da quantidade de DNA in vitro;
• Etapas:
– Desnaturação térmica do DNA
– Resfriamento para anelamento dos iniciadores
– Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase
(repetem-se vários ciclos)
• Meio reacional: DNA-alvo, iniciadores, DNA pol.,
desoxinucleotídeos, cofator.
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© 2004 Pearson Education, Inc.
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
• Início: DNA pol de E. coli;
– Desnaturada a cada ciclo.
• Atualmente: DNA pol. de Thermus aquaticus
– Taq polimerase (termoestável) (sem atividade corretora)
• DNA pol. de Pyrococcus furiosus
– Pfu polimerase (termoestável) (com atividade corretora)
• RT-PCR: Utiliza inicialmente a transcriptase reversa para
síntese de DNA a partir de RNA.
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M 1 2 3 4 5 6
1353
1078
872
603
Eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos da amplificação por
PCR do rDNA 16S a partir do DNA genômico (poços 2-6), controle
negativo (poço 1) e marcador molecular DNA ΦRF digerido com Hae III
(Amersham Biosciences) (poço M).
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© 2004 Pearson Education, Inc.
Estrutura típica de um gene procarioto.
RBS (Ribosome Binding Site) = sítio ligador de ribosomo; ATG =
códon de iniciação da síntese protéica; Cds (CoDing sequences)
ou ORF (Open Reading Frame) = quadro aberto de leitura; stop
= qualquer um dos três códons de finalização da síntese
protéica; terminador = região terminadora da transcrição
© 2004 Pearson Education, Inc.
• Genoma: Conjunto completo de genes de um organismo.
• Transcriptoma: Conjunto completo de genes expressos sob
certas condições.
• Proteoma: Conjunto completo de proteínas.
• Metaboloma: Conjunto de reações metabólicas.
• Interatoma: Conjunto de interações entre proteínas e RNAs
.
A palavra genome foi inventada em 1920 pelo Dr. H.
Winkler que fundiu a palavra “GENes e cromossOMEs” .
© 2004 Pearson Education, Inc.
Análise proteômica
Microarranjos ou chips de DNA
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  • 1. Recombinação Gênica Tallita Tavares Mestranda em Ciências Marinhas Tropicais
  • 2. © 2004 Pearson Education, Inc. • Recombinação genética • Troca física de material genético. – Recombinação homóloga: Troca de seqüências homólogas de DNA a partir de duas linhagens distintas; – Envolve a participação de cerca de 25 genes (E. coli); – Vias redundantes (garantia de continuidade do processo) • Ex: Gene recA, presente em Bacteria, Archaea e Eucarya, leva a produção de RecA, essencial a quase todas as vias de recombinação.
  • 4. © 2004 Pearson Education, Inc. • Se as sequências homólogas forem diferentes...Podem ser formados novos genótipos: – Em Eucariotos: Cromossomos homólogos são diferentes; – Em Procariotos: Como introduzir um outro DNA diferente na célula? • É necessário um doador diferenciado do material a ser recombinado. Como?! • Recombinação entre fragmentos de DNA homólogo de um doador e de um receptor por: – TRANSFORMAÇÃO; – TRANSDUÇÃO ; – CONJUGAÇÃO •
  • 5. © 2004 Pearson Education, Inc. • Transformação (envolve a presença de DNA livre da célula doadora que é incorporado por uma receptora que pode passar a apresentar alterações genéticas). • Transdução (transferência de DNA de uma célula para outra mediada por um vírus). • Conjugação (transferência mediada pelo contato entre as céls).
  • 6. © 2004 Pearson Education, Inc. Processos de transferência de DNA
  • 7. © 2004 Pearson Education, Inc.
  • 8. © 2004 Pearson Education, Inc. Como detectar recombinantes ?
  • 9. Transformação • Para ocorrer, a doadora deve ter sofrido uma lise branda para não lisar o DNA; • A receptora deve ter competência: – capacidade de captação do DNA exógeno; – determinada geneticamente e regulada; – envolve proteínas na captação e processamento do DNA (autolisinas, ligases, nucleases, etc).Bacillus: quorum sensing.
  • 10. Transformação • O DNA pode ser captado como DNA de fita simples ou de fita dupla. PROCESSO: • Ligação da célula ao DNA exógeno por meio de uma proteína de ligação ao DNA; • Captação e ligação a proteína de transferência (protege o DNA de proteases até chegar ao cromossomo); • Junto ao cromossomo, há a invasão da fita, promovida pela RecA; • Após a recombinação, a replicação gera duas fitas – uma parental e uma recombinante. • Gêneros de bactérias naturalmente competentes – Acinetobacter, Azotobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Thermus.
  • 11. © 2004 Pearson Education, Inc. TRANSFORMAÇÃO (Griffith, década de 20)
  • 12. © 2004 Pearson Education, Inc. • OBS1: Pode ocorrer a transfecção – bactérias são transformadas por um DNA oriundo de um vírus (fago). • OBS2: Muitos procariotos não são transformáveis naturalmente - Competência artificialmente induzida – E. coli em ↑[CaCl2]e incubadas a baixas temperaturas. • Eletroporação – tratamento das células com pulso elétrico de duração controlada que promove a formação de poros na membrana celular.
  • 13. © 2004 Pearson Education, Inc. Eletroporador Cubetas
  • 14. Transdução • Transferência mediada por vírus. Mas como o DNA chega ao vírus? – Infecção → inserção de seu DNA → empacotamento de fragmentos do DNA do hospedeiro junto ou em vez do seu (PARTÍCULA TRANSDUTORA) • Transdução generalizada: DNA derivado de qualquer região do genoma, substituindo o do vírus – Se os genes não recombinarem-se com os da receptora, serão perdidos; • Transdução especializada: Sequência de DNA específica, integra- se ao DNA viral – Se não recombinarem, são incorporados pelo vírus.
  • 15. © 2004 Pearson Education, Inc. TRANSDUÇÃO Generalizada Vírus defectivo
  • 17. © 2004 Pearson Education, Inc. Transdução comumente ocorre em: • Desulfovibrio, Escherichia, Pseudomonas, Rhodococcus, Rhodobacter, Salmonella, Staphylococcus e Xanthobacter. • Methanothermobacter thermoautotrophicus
  • 18. © 2004 Pearson Education, Inc. Plasmídeos Elementos genéticos que se replicam independentemente do cromossomo da células hospedeira Não contêm genes necessários à célula sob todas as condições Diferentes dos vírus: Não apresentam forma extracelular, existindo no interior das células como ácidos nucléicos
  • 19. © 2004 Pearson Education, Inc. Natureza física dos plasmídeos • DNA de fita dupla • Maioria circular • 1 a 1000 pares de quilobases • 1/20 do tamanho do cromossomo • Superenovelados • Podem ser diferentes na mesma célula (circulares ou lineares)
  • 20. © 2004 Pearson Education, Inc. Replicação dos plasmídeos • Genes plasmidiais controlam a replicação. • Cópias de plasmídeos: em geral, 1 a 3 cópias, mas já foram encontrados até mais de 100 cópias! • Semelhante a reprodução do cromossomo (origem de replicação, bidirecional). C U R I O S I D A D E S : • Epissomos: plasmídeos que podem se integrar ao cromossomo e serem repicados por ele. • Cura: eliminação de plasmídeos pela célula. • Incompatibilidade: impedimento de incorporação de plasmídios.
  • 21. © 2004 Pearson Education, Inc. Plasmídeos de resistência • Plasmídeos R : resistência a antibióticos e inibidores de crescimento • Ex: plasmídeo R100 confere resistência à sulfonamidas, estreptomicina, cloranfenicol, tetraciclina, ácido fusídico, espectinomicina e mercúrio. • R100 poder ser transferido para: Escherichia, Klebsiella, Proteus, Salmonella e Shigella • Ameaça a terapia antimicrobiana tradicional !
  • 22. © 2004 Pearson Education, Inc. FIGURA 10.19 Plasmídeo R
  • 23. © 2004 Pearson Education, Inc. Toxinas • Codificada por genes plasmidiais de virulência • Ex: fator de colonização (CFA) de Escherichia coli: adesão às células epiteliais do intestino. • Produção de hemolisina e enterotoxina (diarréia).
  • 24. © 2004 Pearson Education, Inc. Bacteriocinas • Peptídeos que inibem ou matam espécies relacionadas. • Exemplos: – E. coli: colicinas, plasmídeos Col – Bacillus subtilis: subtilisinas – Lactobacillus: Nisina A
  • 25. © 2004 Pearson Education, Inc. Conjugação • Contato entre células; • Presença de um plasmídeo conjugativo na célula doadora; • Célula doadora (macho ou +) e a receptora (fêmea ou -); •Plasmídeo conjugativo: contém informações para síntese do pilus sexual e para a formação do par de acasalamento.
  • 26. © 2004 Pearson Education, Inc. Transferência de DNA plasmidial por conjugação
  • 27. © 2004 Pearson Education, Inc. FIGURA 10.21 B
  • 28. Após a transferência... • A célula receptora de plasmídeos conjugantes deve ser capaz de: – Sintetizar o pilus sexual; – Mobilizar o DNA para transferência; – Alterar seus receptores de superfície para tornar a célula incapaz de ser receptora de plasmídeos similares; – Exibir as características presentes no plasmídeo.
  • 29. Conjugação ao cromossomo bacteriano • Alguns plasmídeos podem, ainda, se inserir no cromossomo bacteriano através de sequências de inserção: • Quando inseridos, têm replicação controlada pelo cromossomo, mas os genes de conj. continuam ativos: – Podem mobilizar a transferência deste ou... – De partes dele (mais comum); * Como há replicação, a nova cél. doadora adquire os genes plasmidiais; ** Quando na célula receptora, o cromossomo pode recombinar com o original. *** O plasmídeo tb pode excisar levando partes do cromossomo bacteriano.
  • 30. © 2004 Pearson Education, Inc. Confecção de mapas genéticos
  • 31. © 2004 Pearson Education, Inc. Mapa genético
  • 32. © 2004 Pearson Education, Inc. Transposição • Processo em que um gene se move de um local para outro no genoma (não ocorre entre seqüências homólogas e não utiliza o sistema geral de recombinação da célula). • Evento raro: 10-5 – 10-7 • Tipos de transposição: – Conservativa – Replicativa • Podem transportar genes de resistência a antibióticos. • Elementos transponíveis: – Transposons – Seqüências de inserção – Alguns vírus (Mu)
  • 33. © 2004 Pearson Education, Inc. FIGURA 10.32 Mutagênese por transposição
  • 34. © 2004 Pearson Education, Inc. Técnicas de genética bacteriana In vitro
  • 35. Enzimas de restrição • Reconhecem e clivam sequências de DNA; • Clivam 1 ou 2 fitas; • Função natural: – Proteção das células contra DNAs estranhos, excisando-os. • Artificialmente: – Usadas opostamente: para inserir DNAs estranhos! • Reconhecem sequências curtas e palindrômicas, em geral.
  • 36.
  • 37. © 2004 Pearson Education, Inc. Endonucleases de restrição Palíndromo: Socorram-me subi no ônibus em Marrocos EcoRI EcoRI metilase
  • 38. © 2004 Pearson Education, Inc.
  • 39. © 2004 Pearson Education, Inc.
  • 40. Os fragmentos obtidos podem ser analisados por eletroforese
  • 41. Sequenciamento do DNA • Década de 70; • Maxam e Gilbert (agentes químicos clivavam o DNA em vários pontos); • Dideoxi de Sanger (síntese de fita complementar na presença de dideoxi-nucleotídeos)  Ambos geram fragmentos radioativos de DNA podendo apresentar uma das 4 diferentes bases ao final de cada molécula.  Os fragmentos são separados por eletroforese, onde a diferença no tamanho corresponde a um nucleotídeo  Ao fim é feita uma auto-radiografia para detecção da altura das bandas e determinação da sequência
  • 42. © 2004 Pearson Education, Inc.
  • 43. © 2004 Pearson Education, Inc.
  • 44. © 2004 Pearson Education, Inc. 44 Sequenciador automático MegaBace Parte de um eletroferograma gerado no sequenciamento automático de DNA
  • 45. © 2004 Pearson Education, Inc. Clonagem molecular • Transferência de um gene de um genoma para outro; • Etapas: – Isolamento do DNA original – Ligação em um vetor (plasmídios e vírus são os mais usados); – Introdução e manutenção em um hospedeiro. (Biblioteca de DNA ou biblioteca genômica)
  • 46. © 2004 Pearson Education, Inc. Vetores de clonagem • Plasmídeos: – pequenos; – origem de replicação própria; – múltiplas cópias (presentes em grandes quantidades na cél); – marcas de seleção (seleção dos clones positivos). • Limitação: tamanho do inserto (até 10kb). • Ex: pBR322
  • 47. © 2004 Pearson Education, Inc. FIGURA 10.41 pBR322
  • 48. © 2004 Pearson Education, Inc.
  • 49. © 2004 Pearson Education, Inc. Vetores de clonagem • Bacteriófagos: – Permitem a utilização de insertos maiores (até 20kb); – Clonagem mais eficiente (transdução). • Cosmídios – Plasmídeos com genes de bacteriófagos: • gene exógeno + dna plasmidial + dna fago (sequência para encapsulação) – Podem ser clonados grandes fragmentos; – Proteção da do envoltório viral.
  • 50.
  • 51. © 2004 Pearson Education, Inc. Reação em cadeia da polimerase (PCR) • Rápido aumento da quantidade de DNA in vitro; • Etapas: – Desnaturação térmica do DNA – Resfriamento para anelamento dos iniciadores – Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase (repetem-se vários ciclos) • Meio reacional: DNA-alvo, iniciadores, DNA pol., desoxinucleotídeos, cofator.
  • 52. © 2004 Pearson Education, Inc.
  • 53. © 2004 Pearson Education, Inc. Reação em cadeia da polimerase (PCR) • Início: DNA pol de E. coli; – Desnaturada a cada ciclo. • Atualmente: DNA pol. de Thermus aquaticus – Taq polimerase (termoestável) (sem atividade corretora) • DNA pol. de Pyrococcus furiosus – Pfu polimerase (termoestável) (com atividade corretora) • RT-PCR: Utiliza inicialmente a transcriptase reversa para síntese de DNA a partir de RNA.
  • 54. © 2004 Pearson Education, Inc. M 1 2 3 4 5 6 1353 1078 872 603 Eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos da amplificação por PCR do rDNA 16S a partir do DNA genômico (poços 2-6), controle negativo (poço 1) e marcador molecular DNA ΦRF digerido com Hae III (Amersham Biosciences) (poço M).
  • 55. © 2004 Pearson Education, Inc.
  • 56. © 2004 Pearson Education, Inc. Estrutura típica de um gene procarioto. RBS (Ribosome Binding Site) = sítio ligador de ribosomo; ATG = códon de iniciação da síntese protéica; Cds (CoDing sequences) ou ORF (Open Reading Frame) = quadro aberto de leitura; stop = qualquer um dos três códons de finalização da síntese protéica; terminador = região terminadora da transcrição
  • 57. © 2004 Pearson Education, Inc. • Genoma: Conjunto completo de genes de um organismo. • Transcriptoma: Conjunto completo de genes expressos sob certas condições. • Proteoma: Conjunto completo de proteínas. • Metaboloma: Conjunto de reações metabólicas. • Interatoma: Conjunto de interações entre proteínas e RNAs . A palavra genome foi inventada em 1920 pelo Dr. H. Winkler que fundiu a palavra “GENes e cromossOMEs” .
  • 58. © 2004 Pearson Education, Inc. Análise proteômica
  • 60. © 2004 Pearson Education, Inc.