Aula de Microbiologia Tema: Recombinação Genica Baseado no capítulo 10 do livro Tortora

1. Recombinação Gênica
Tallita Tavares
Mestranda em Ciências Marinhas Tropicais

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• Recombinação genética
• Troca física de material genético.
– Recombinação homóloga: Troca de seqüências homólogas de
DNA a partir de duas linhagens distintas;
– Envolve a participação de cerca de 25 genes (E. coli);
– Vias redundantes (garantia de continuidade do processo)
• Ex: Gene recA, presente em Bacteria, Archaea e Eucarya,
leva a produção de RecA, essencial a quase todas as vias
de recombinação.

3. Processo:
Gene A
Gene B
Gene A
Gene A

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• Se as sequências homólogas forem diferentes...Podem ser
formados novos genótipos:
– Em Eucariotos: Cromossomos homólogos são diferentes;
– Em Procariotos: Como introduzir um outro DNA diferente na
célula?
• É necessário um doador diferenciado do material a ser recombinado.
Como?!
• Recombinação entre fragmentos de DNA homólogo de um
doador e de um receptor por:
– TRANSFORMAÇÃO;
– TRANSDUÇÃO ;
– CONJUGAÇÃO
•

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• Transformação (envolve a presença de DNA livre da
célula doadora que é incorporado por uma receptora
que pode passar a apresentar alterações genéticas).
• Transdução (transferência de DNA de uma célula para
outra mediada por um vírus).
• Conjugação (transferência mediada pelo contato entre
as céls).

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Processos de transferência de DNA

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Como detectar recombinantes ?

9. Transformação
• Para ocorrer, a doadora deve ter sofrido uma lise branda
para não lisar o DNA;
• A receptora deve ter competência:
– capacidade de captação do DNA exógeno;
– determinada geneticamente e regulada;
– envolve proteínas na captação e processamento do DNA
(autolisinas, ligases, nucleases, etc).Bacillus: quorum sensing.

10. Transformação
• O DNA pode ser captado como DNA de fita simples ou de fita
dupla. PROCESSO:
• Ligação da célula ao DNA exógeno por meio de uma proteína de
ligação ao DNA;
• Captação e ligação a proteína de transferência (protege o DNA de
proteases até chegar ao cromossomo);
• Junto ao cromossomo, há a invasão da fita, promovida pela RecA;
• Após a recombinação, a replicação gera duas fitas – uma parental e
uma recombinante.
• Gêneros de bactérias naturalmente competentes – Acinetobacter,
Azotobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria,
Thermus.

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TRANSFORMAÇÃO (Griffith, década de 20)

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• OBS1: Pode ocorrer a transfecção – bactérias são transformadas
por um DNA oriundo de um vírus (fago).
• OBS2: Muitos procariotos não são transformáveis naturalmente -
Competência artificialmente induzida – E. coli em ↑[CaCl2]e
incubadas a baixas temperaturas.
• Eletroporação – tratamento das células com pulso elétrico de
duração controlada que promove a formação de poros na
membrana celular.

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Eletroporador Cubetas

14. Transdução
• Transferência mediada por vírus. Mas como o DNA chega ao vírus?
– Infecção → inserção de seu DNA → empacotamento de fragmentos
do DNA do hospedeiro junto ou em vez do seu (PARTÍCULA
TRANSDUTORA)
• Transdução generalizada: DNA derivado de qualquer região do
genoma, substituindo o do vírus
– Se os genes não recombinarem-se com os da receptora, serão
perdidos;
• Transdução especializada: Sequência de DNA específica, integra-
se ao DNA viral
– Se não recombinarem, são incorporados pelo vírus.

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TRANSDUÇÃO
Generalizada
Vírus defectivo

16. Transdução
especializada

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Transdução comumente ocorre em:
• Desulfovibrio, Escherichia, Pseudomonas,
Rhodococcus, Rhodobacter, Salmonella,
Staphylococcus e Xanthobacter.
• Methanothermobacter thermoautotrophicus

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Plasmídeos
Elementos genéticos que se replicam independentemente
do cromossomo da células hospedeira
Não contêm genes necessários à célula sob todas as
condições
Diferentes dos vírus: Não apresentam forma
extracelular, existindo no interior das células como
ácidos nucléicos

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Natureza física dos plasmídeos
• DNA de fita dupla
• Maioria circular
• 1 a 1000 pares de quilobases
• 1/20 do tamanho do cromossomo
• Superenovelados
• Podem ser diferentes na mesma célula (circulares
ou lineares)

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Replicação dos plasmídeos
• Genes plasmidiais controlam a replicação.
• Cópias de plasmídeos: em geral, 1 a 3 cópias, mas já foram
encontrados até mais de 100 cópias!
• Semelhante a reprodução do cromossomo (origem de replicação,
bidirecional).
C U R I O S I D A D E S :
• Epissomos: plasmídeos que podem se integrar ao cromossomo e
serem repicados por ele.
• Cura: eliminação de plasmídeos pela célula.
• Incompatibilidade: impedimento de incorporação de plasmídios.

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Plasmídeos de resistência
• Plasmídeos R : resistência a antibióticos e inibidores de
crescimento
• Ex: plasmídeo R100 confere resistência à sulfonamidas,
estreptomicina, cloranfenicol, tetraciclina, ácido fusídico,
espectinomicina e mercúrio.
• R100 poder ser transferido para: Escherichia, Klebsiella,
Proteus, Salmonella e Shigella
• Ameaça a terapia antimicrobiana tradicional !

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FIGURA 10.19
Plasmídeo R

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Toxinas
• Codificada por genes plasmidiais de virulência
• Ex: fator de colonização (CFA) de Escherichia coli: adesão às
células epiteliais do intestino.
• Produção de hemolisina e enterotoxina (diarréia).

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Bacteriocinas
• Peptídeos que inibem ou matam espécies
relacionadas.
• Exemplos:
– E. coli: colicinas, plasmídeos Col
– Bacillus subtilis: subtilisinas
– Lactobacillus: Nisina A

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Conjugação
• Contato entre células;
• Presença de um plasmídeo
conjugativo na célula doadora;
• Célula doadora (macho ou +) e a
receptora (fêmea ou -);
•Plasmídeo conjugativo: contém
informações para síntese do pilus
sexual e para a formação do par de
acasalamento.

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Transferência de DNA plasmidial por conjugação

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FIGURA 10.21 B

28. Após a transferência...
• A célula receptora de plasmídeos conjugantes deve ser
capaz de:
– Sintetizar o pilus sexual;
– Mobilizar o DNA para transferência;
– Alterar seus receptores de superfície para tornar a célula
incapaz de ser receptora de plasmídeos similares;
– Exibir as características presentes no plasmídeo.

29. Conjugação ao cromossomo bacteriano
• Alguns plasmídeos podem, ainda, se inserir no cromossomo
bacteriano através de sequências de inserção:
• Quando inseridos, têm replicação controlada pelo
cromossomo, mas os genes de conj. continuam ativos:
– Podem mobilizar a transferência deste ou...
– De partes dele (mais comum);
* Como há replicação, a nova cél. doadora adquire os genes plasmidiais;
** Quando na célula receptora, o cromossomo pode recombinar com o
original.
*** O plasmídeo tb pode excisar levando partes do cromossomo bacteriano.

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Confecção de mapas genéticos

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Mapa genético

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Transposição
• Processo em que um gene se move de um local para outro
no genoma (não ocorre entre seqüências homólogas e não
utiliza o sistema geral de recombinação da célula).
• Evento raro: 10-5 – 10-7
• Tipos de transposição:
– Conservativa
– Replicativa
• Podem transportar genes de resistência a
antibióticos.
• Elementos transponíveis:
– Transposons
– Seqüências de inserção
– Alguns vírus (Mu)

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FIGURA 10.32
Mutagênese por transposição

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Técnicas de genética bacteriana
In vitro

35. Enzimas de restrição
• Reconhecem e clivam sequências de DNA;
• Clivam 1 ou 2 fitas;
• Função natural:
– Proteção das células contra DNAs estranhos, excisando-os.
• Artificialmente:
– Usadas opostamente: para inserir DNAs estranhos!
• Reconhecem sequências curtas e palindrômicas,
em geral.

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Endonucleases de restrição
Palíndromo:
Socorram-me subi no ônibus em Marrocos
EcoRI EcoRI metilase

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40. Os fragmentos obtidos podem ser analisados por
eletroforese

41. Sequenciamento do DNA
• Década de 70;
• Maxam e Gilbert (agentes químicos clivavam o DNA em vários
pontos);
• Dideoxi de Sanger (síntese de fita complementar na presença de
dideoxi-nucleotídeos)
 Ambos geram fragmentos radioativos de DNA podendo apresentar uma das
4 diferentes bases ao final de cada molécula.
 Os fragmentos são separados por eletroforese, onde a diferença no
tamanho corresponde a um nucleotídeo
 Ao fim é feita uma auto-radiografia para detecção da altura das bandas e
determinação da sequência

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44
Sequenciador automático MegaBace
Parte de um eletroferograma gerado no sequenciamento
automático de DNA

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Clonagem molecular
• Transferência de um gene de um genoma para outro;
• Etapas:
– Isolamento do DNA original
– Ligação em um vetor (plasmídios e vírus são os mais usados);
– Introdução e manutenção em um hospedeiro.
(Biblioteca de DNA ou biblioteca genômica)

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Vetores de clonagem
• Plasmídeos:
– pequenos;
– origem de replicação própria;
– múltiplas cópias (presentes em grandes quantidades na cél);
– marcas de seleção (seleção dos clones positivos).
• Limitação: tamanho do inserto (até 10kb).
• Ex: pBR322

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FIGURA 10.41
pBR322

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Vetores de clonagem
• Bacteriófagos:
– Permitem a utilização de insertos maiores (até 20kb);
– Clonagem mais eficiente (transdução).
• Cosmídios
– Plasmídeos com genes de bacteriófagos:
• gene exógeno + dna plasmidial + dna fago (sequência para encapsulação)
– Podem ser clonados grandes fragmentos;
– Proteção da do envoltório viral.

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Reação em cadeia da polimerase (PCR)
• Rápido aumento da quantidade de DNA in vitro;
• Etapas:
– Desnaturação térmica do DNA
– Resfriamento para anelamento dos iniciadores
– Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase
(repetem-se vários ciclos)
• Meio reacional: DNA-alvo, iniciadores, DNA pol.,
desoxinucleotídeos, cofator.

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Reação em cadeia da polimerase (PCR)
• Início: DNA pol de E. coli;
– Desnaturada a cada ciclo.
• Atualmente: DNA pol. de Thermus aquaticus
– Taq polimerase (termoestável) (sem atividade corretora)
• DNA pol. de Pyrococcus furiosus
– Pfu polimerase (termoestável) (com atividade corretora)
• RT-PCR: Utiliza inicialmente a transcriptase reversa para
síntese de DNA a partir de RNA.

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M 1 2 3 4 5 6
1353
1078
872
603
Eletroforese em gel de agarose 1% dos produtos da amplificação por
PCR do rDNA 16S a partir do DNA genômico (poços 2-6), controle
negativo (poço 1) e marcador molecular DNA ΦRF digerido com Hae III
(Amersham Biosciences) (poço M).

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Estrutura típica de um gene procarioto.
RBS (Ribosome Binding Site) = sítio ligador de ribosomo; ATG =
códon de iniciação da síntese protéica; Cds (CoDing sequences)
ou ORF (Open Reading Frame) = quadro aberto de leitura; stop
= qualquer um dos três códons de finalização da síntese
protéica; terminador = região terminadora da transcrição

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• Genoma: Conjunto completo de genes de um organismo.
• Transcriptoma: Conjunto completo de genes expressos sob
certas condições.
• Proteoma: Conjunto completo de proteínas.
• Metaboloma: Conjunto de reações metabólicas.
• Interatoma: Conjunto de interações entre proteínas e RNAs
.
A palavra genome foi inventada em 1920 pelo Dr. H.
Winkler que fundiu a palavra “GENes e cromossOMEs” .

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Análise proteômica

59. Microarranjos ou chips de DNA

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