Artigo bioterra v19_n2_07

1. REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228
Volume 19 - Número 2 - 2º Semestre 2019
LEVEDURA ISOLADA A PARTIR DE FRUTO TROPICAL UTILIZADA NA
PRODUÇÃO DE CERVEJA ARTESANAL
Michell Ranzolin Santos1
, Reginaldo Matheus Góis Mascarenhas2
, Marta Judite Nunes Lima3
,
Flávio Henrique Ferreira Barbosa4
, Tiago Branquinho Oliveira5
RESUMO
O presente trabalho visa apresentar leveduras isoladas a partir de frutos tropicais para bioprodução de
cerveja artesanal. A cerveja é uma das bebidas alcóolicas mais antigas já registradas em sítios
arqueológicos, e seu descobrimento pode ter sido ao acaso na Mesopotâmia a cerca de 6.000 a 8.000
a.c, através de uma fermentação espontânea da massa do pão. Pode -se definir cerveja como sendo uma
bebida carbonatada, alcóolica e fermentada através da ação das leveduras, preparada com lúpulo, cevada
e água de boa qualidade, podendo ainda ter como adjuntos o trigo, milho, arroz ou outros grãos. A
levedura é um microrganismo unicelular, sendo responsável pela fermentação alcóolica, sendo que as
linhagens do gênero Saccharomyces são as mais indicadas para a produção de cerveja. Para a fabricação
da cerveja, vários processos estão envolvidos como moagem do malte, mosturação, fervura do mosto,
decantação, resfriamento, fermentação, maturação, filtração, pressurização, engarrafamento e
pasteurização. A temperatura é um dos fatores cruciais para a fermentação do mosto cervejeiro, pois ela
é essencial para a conversão do amido pelas leveduras e para inativar enzimas que produzem substâncias
indesejáveis que ocasionam um sabor ou aroma desagradável no produto final.
Palavras-chaves: Cerveja, Saccharomyces, Frutos Tropicais, Fermentação.
YEAST ISOLATED FROM TROPICAL FRUIT USED IN CRAFT BEER
PRODUCTION
ABSTRACT
The present work aims to present isolated yeasts from tropical fruits for bioproduction of craft beer.
Beer is one of the oldest alcoholic beverages ever recorded in archaeological sites, and its discovery
may have been randomly in Mesopotamia at about 6,000 to 8,000 bc by spontaneous fermentation of
the bread dough. Beer can be defined as a carbonated drink, alcoholic and fermented through the action
of yeasts, prepared with hops, barley and water of good quality, and may have wheat, corn, rice or other
grains as adjuvants. The yeast is a unicellular microorganism, being responsible for the alcoholic
fermentation, and the strains of the genus Saccharomyces are the most suitable for the production of
beer. For brewing, various processes are involved such as malting, blending, wort boiling, decantation,
cooling, fermentation, maturation, filtration, pressurizing, bottling and pasteurization. Temperature is
one of the crucial factors for the fermentation of the brewer's wort it is essential for the conversion of
the starch to the yeasts and to inactivate enzymes that produce undesirable substances that cause an
unpleasant taste or aroma in the final product.
Keywords: Beer, Saccharomyces, Tropical Fruits, Fermentation.
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2. 1. INTRODUÇÃO
1.1 A Cerveja
Em termos gerais, define-se cerveja
como uma bebida fermentada e carbonatada
com teor alcoólico variando entre 3 e 8%
(v/v), preparada a partir de malte de cevada,
lúpulo, fermento e água de boa qualidade,
permitindo-se ainda o uso de outras
matérias primas como arroz, milho e trigo
(SIQUEIRA; BOLINI; MACEDO, 2008).
A origem da bebida se inicia há cerca de
nove mil anos. Provas arqueológicas que
iluminam a história da cerveja foram
encontradas na Mesopotâmia, região onde
sumérios formaram uma das mais antigas
civilizações e cultivaram grãos. As cervejas
antigas de teor alcoólico bem baixo (algo
como 2,0 ou 3,0%), recebiam muitas vezes
a adição de ervas, raízes e frutos, como
alecrim, anis, canela, zimbro, gengibre e
avelãs, além de mel (SINDICERV, 2015).
Ainda segundo o Sindicato Nacional da
Indústria da Cerveja, a bebida parece ter
sido acidentalmente descoberta por uma
fermentação espontânea de cereais ou da
própria massa do pão em contato com a
água. Nesta mesma época, as mulheres
tinham a responsabilidade de fabricar e
distribuir a cerveja, consumida e valorizada
na Antiguidade, sendo considerada uma
bebida divina, era oferecida a deuses como
Ninkasi, a escolhida como referência da arte
suméria de produzir cerveja.
1.2 Os Estilos de Cerveja
A categorização de estilos de
cerveja por tipos de leveduras é um
fenômeno do meio cervejeiro artesanal
contemporâneo. Cervejeiros americanos e a
maioria dos cervejeiros artesanais de outros
países chamam cervejas Ales, ao usar
leveduras de fermentação de topo (ale), e
Lager, quando empregam leveduras de
baixa fermentação (lager). A maioria dos
sistemas de categorização concordarão para
uma terceira classificação, muitas vezes
chamado de fermentação espontânea, por
causa do método; todavia, é “wild”, ou seja,
fermentação (com levedura) selvagem,
talvez o termo mais utilizado pelas
cervejarias artesanais modernas para essas
cervejas fermentadas com bactérias ou
outras leveduras sem ser a Saccharomyces
(BONACCORSI, 2016). De acordo com
este mesmo autor, o termo “wild”
(selvagem), nesse contexto, não implica
fermentação espontânea; muitas delas
podem ser inoculadas diretamente no mosto
resfriado, com as variedades de espécies de
leveduras ou bactérias, conforme a
fermentação desejada.
Figura1: Exemplos de diferentes estilos de cerveja e suas colorações.
Fonte: Cerveja Falle (2019)

3. Tabela 1: Tipos (Estilos) de cerveja.
Fonte:Sindserv,2018.
1.3 A Cerveja no Brasil
Segundo o Portal Cervesia (2018) a
chegada da cerveja ao Brasil demorou, pois,
os portugueses temiam perder o filão da
venda de seus vinhos. O processo de
produção em larga escala na indústria
cervejeira foi proporcionado pela política
de substituição de importações a partir de
1880. Com o passar dos anos, o Estado
brasileiro considerou que, a produção
nacional já estava em condições de
substituir as importações da Inglaterra e
principalmente da Alemanha
(LIMBERGER, 1930; SINDICERV, 2015).
Apesar de milenar, a ênfase do consumo e a
produção de cerveja somente se tornaram
expressivos entre as bebidas alcoólicas nos
últimos 150 anos. Atualmente, pode-se
dizer que seu consumo se encontra
globalizado e a participação do Brasil nesse
ramo internacionalizado tem chamado a
atenção de conceituadas empresas que
atuam no setor (FREITAS, 2015). Vale
salientar que, a produção e o consumo de
cervejas no Brasil são caracterizados pela
presença de poucas marcas sendo quase
todas de um único tipo de cerveja, a cerveja
do tipo lager, as de baixa fermentação
(OLIVEIRA., 2011). De acordo com o
Sindicato Nacional da Indústria da Cerveja
(SINDISERV), as cervejas de baixa
fermentação só começaram a ser produzidas
em larga escala no século passado, com a
descoberta de Linde, o inventor da máquina
frigorífica. Os tipos mais conhecidos de
lager são as Pilsener, Munchener, Vienna,
Dortmund, Einbeck, Bock, Export e Munich
- a maioria delas homenageiam às cidades
de onde vieram as fórmulas. Vale apena
ressaltar que, outros tipos de cerveja
apresentam um consumo restrito,
principalmente por consumidores que mais
exigentes em termos de qualidade sensorial,
que buscam uma bebida diferenciada, sem
dar tanta importância ao preço do produto.
A diversidade de produtos de cervejaria
TIPOS (ESTILOS) DE CERVEJA
CERVEJA ORIGEM COLORAÇÃO TEOR
ALCOÓLICO
FERMENTAÇÃO
Pilsen República Checa Clara Médio Baixa
Dortmunder Alemanha Clara Médio Baixa
Stout Inglaterra Escura Alto Geralmente Baixa
Porter Inglaterra Escura Alto Alta ou Baixa
Weissbier Alemanha Clara Médio Alta
München Alemanha Escura Médio Baixa
Bock Alemanha Escura Alto Baixa
Malzbier Alemanha Escura Alto Baixa
Ale Inglaterra Clara e
Avermelhada
Médio ou Alto Alta
Ice Canadá Clara Alto -

4. brasileira ainda se encontra em um nível
relativamente baixo, se comparado ao o
modelo de outros países, onde se observa
uma vasta gama de variedade de marcas e
tipos de cervejas, com sabores e colorações
distintas (OLIVEIRA., 2011). O
SINDSERV afirma ainda que, o Brasil, só
perde em volume, para a China (35 bilhões
de litros/ano), Estados Unidos (23,6 bilhões
de litros/ano), e Alemanha (10,7
bilhões/ano).
1.4 A Importância das Leveduras
Atualmente, as leveduras têm
grande importância na indústria em vários
seguimentos, dentre eles a produção de
cerveja. As características de sabor, aroma
e textura de qualquer cerveja estão
determinadas de forma preponderante pelo
tipo de levedura utilizada. Embora o etanol
seja o principal produto de excreção
produzido pela levedura durante a
fermentação do mosto, esse álcool primário
tem pequeno impacto no sabor da cerveja.
A levedura é o agente biológico que
transforma o mosto cervejeiro em produto
final. Para cada tipo de cerveja como as
Belgas, Inglesas e outras, são selecionadas
determinadas linhagens de leveduras. Como
a maioria desse material não é produzida no
Brasil, o custo de aquisição acaba sendo
elevado (CEREDA, 1983; MARTINS,
1991; SILVA, 2005; VENTURINI &
CEREDA, 2008; DRAGONE et al., 2010).
O gênero Saccharomyces apresenta
várias linhagens consideradas seguras e
capazes de produzir dois metabolitos
primários importantes, etanol e dióxido de
carbono. Os tipos de cervejas mais
importantes (Lager e Ale) são fermentados
com linhagens de S.uvarum (S.
carlsbergensis) e S. cerevisiae,
respectivamente. Atualmente, taxonomistas
de leveduras têm designado todas as
linhagens empregadas na produção de
cerveja como pertencentes a espécie S.
cerevisiae.
O tipo e a concentração de vários
produtos de excreção formados durante a
fermentação são quem primariamente
determinam o sabor da cerveja. A formação
desses compostos depende do processo
metabólico do cultivo da levedura. Vários
fatores podem afetar esse processo
metabólico e, consequentemente, o sabor da
cerveja, incluindo a linhagem de levedura, a
temperatura e o pH da fermentação, o tipo e
a proporção de adjunto, o modelo de
fermentador e a concentração do mosto
(MORADO, 2017).
1.5 A Busca de Produtos Inovadores
Por todo o exposto, nota-se que o
desenvolvimento tecnológico, com a
introdução de matérias-primas de qualidade
superior no processo produtivo, torna-se
imperativo para a obtenção de produtos de
maior aceitabilidade do consumidor, sem o
qual não se pode alcançar o almejado
crescimento das cervejarias artesanais.
Resta claro pelo discorrido até aqui, que
existe a necessidade de investimentos em
pesquisa, desenvolvimento e inovação,
principalmente no que se refere a linhagens
de leveduras melhoradas e adequadas às
condições brasileiras de produção de
cervejas, visando à produção de cervejas
artesanais que agradem ao paladar do
consumidor local. Trata-se de um desafio,
mas que pode ser alcançado e gerar ganhos
significativos à indústria nacional de
cervejas artesanais, principalmente pela
redução significativa da dependência de
importação de leveduras.
1.6 A Possibilidade de Utilização de
Blends na Busca de Produtos Inovadores
As fermentações cervejeiras, de uma
forma geral, foram sempre definidas pelo
uso de uma única espécie ou combinações
dessa mesma espécie. Por exemplo, as
cervejas da família Lager que usam S.
pastorianus ou da família Ale, que utilizam
S. cerevisiae. Mesmo nas “Wild Beers”
disponíveis comercialmente, a fermentação
é baseada em uma combinação de espécies
pertencentes ao mesmo gênero
(Brettanomyces bruxellensis e/ou
Brettanomyces anomalus). Obviamente, as
cervejas fermentadas com estas cepas

5. únicas ou as suas combinações são de alta
qualidade e se adequam aos estilos à que se
propõe. Existem exceções a esta norma e
uma dessas exceções são as cervejas de
fermentação espontânea, onde existe o que
nós conhecemos por “sucessão
populacional microbiana”. Em estilos como
Lambic, diferentes espécies se sucedem na
medida que ocorrem mudanças na
composição química da cerveja. Um tema
complexo, aparentemente, mas não tanto
quando pensamos na cerveja em si e nos
seus constituintes.
Um mosto típico de uma cerveja é
rico em carboidratos mais simples (glicose,
frutose, maltose e sacarose), seguido por
carboidratos mais complexos (maltotriose e
outras dextrinas), lipídeos e ácidos graxos,
peptídeos e aminoácidos, bases
nitrogenadas, óleos essenciais provenientes
do lúpulo, alfa/beta-ácidos isomerizados,
água, macro minerais (cálcio, magnésio),
elementos-traço (cobre, ferro, molibdênio),
entre outros componentes.
E, como é de conhecimento, o
mundo cervejeiro seguiu a tendência, por
muito tempo, apenas fermentações com
linhagens puras de Saccharomyces e nada
mais. Mas vivemos tempos interessantes, e
há um retorno para as chamadas
“fermentações mistas”, não apenas no
mundo dos vinhos, mas também no mundo
cervejeiro. Nas fermentações mistas, as
leveduras convencionais e não-
convencionais atuam em conjunto, onde as
“substâncias” produzidas por um grupo de
leveduras são usadas para a geração de
novas “substâncias” por outras leveduras.
Um exemplo desta interação positiva entre
leveduras é a metabolização de ésteres e
ácidos orgânicos em ésteres de perfil
aromático, comumente observadas entre
Saccharomyces e Brettanomyces. Outro
ponto positivo é a geração de glicerol pelas
leveduras não-convencionais, que dá corpo
para a cerveja, mesmo que esta esteja bem
atenuada. Explorar novas possibilidades,
criar produtos diferenciados e estimular a
revolução microbiana. As leveduras não-
convencionais são uma herança benvinda
do mundo dos vinhos para o mundo das
cervejas.
2 PROBLEMA
Sabendo que as fermentações
cervejeiras, de uma forma geral, foram
sempre definidas pelo uso de uma única
espécie (linhagens puras de Saccharomyces
e nada mais) e que atualmente no mercado
tem-se quase que a totalidade de leveduras
europeias adaptadas à fermentação a
temperaturas relativamente baixas, se
comparadas às temperaturas dos países
tropicais, como é o caso do Brasil, quais as
temperaturas em que as leveduras isoladas
de frutos tropicais fermentam e qual a sua
tolerância em diferentes concentrações de
álcool? Qual o resultado da cerveja
produzida com essas leveduras?
3 JUSTIFICATIVA
As regiões Norte e Nordeste do Brasil
apresentam grande diversidade de frutos
tropicais, com boas perspectivas para
exploração econômica que, até o momento
são pouco utilizadas no processo industrial
e muitas das vezes, desperdiçadas, como
relata o site da Embrapa. Dentre essas
espécies, acerola (Malpighia emarginata) e
caju (Anacardium occidentale) são
amplamente comercializadas
regionalmente, na maioria das vezes na
forma in natura por vendedores ambulantes
nas vias públicas, no entanto carecem de
informações técnico-científicas que
viabilizem seu aproveitamento
agroindustrial, bem como seu cultivo e
caracterização (GARCIA et al., 2012).
As bebidas fermentadas
apresentam-se como alternativa no
desenvolvimento de tecnologias para a
obtenção de produtos derivados com maior
período de vida útil e maior valor agregado
(MUNIZ et al., 2002). Teoricamente,
qualquer fruto ou vegetal que contenha
umidade, açúcar e nutrientes para as
leveduras tem potencial para ser utilizado
como matéria-prima para a produção de

6. bebidas alcoólicas fermentadas, como a
cerveja (ATHAYDE OLIVEIRA et al.,
2012, apud MARTINELLI FILHO, 1983).
Partindo desses pressupostos, fica
evidente a necessidade de se fazer estudos
para encontrar frutos que possam ser
utilizados na fabricação de cerveja, bem
como o isolamento de leveduras extraídas
das mesmas e a produção de bebidas
alcóolicas utilizando as leveduras
encontradas, podendo assim obter
resultados sobre o produto final fabricado.
4 OBJETIVO
4.1 Objetivo geral
O presente trabalho tem como
objetivo, realizar o isolamento de leveduras
extraídas a partir de frutos tropicais
encontrados em Sergipe, bem como avaliar
o resultado da cerveja fabricada a partir da
utilização dessas leveduras na produção de
uma cerveja artesanal.
4.2 Objetivos específicos
 Obtenção das polpas de
diferentes frutos tropicais;
 Isolar leveduras cervejeiras
obtidas a partir de frutos tropicais e fazer a
caracterização a nível molecular
(sequenciamento de DNA) das leveduras
em estudo e teste de PCR;
 Realizar o teste de Fehling A
e B das amostras de suco;
 Verificar a tolerância
alcoólica que essas leveduras suportam;
 Realizar a produção de
cervejas artesanais utilizando as leveduras
isoladas dos frutos;
 Realizar nos produtos finais
(cervejas produzidas) a caracterização
quanto ao pH, acidez titulável, teor
alcoólico e produção de ésteres.
5 METODOLOGIA
5.1 Obtenção dos microrganismos
Cerca de 200 a 400 g de acerola e
caju foram assepticamente coletados em
sacos plásticos, transportados sob
refrigeração e enviados para processamento
em até, no máximo, 48 horas após a coleta
no Laboratório de Alimentos e Bebidas da
Universidade Federal de Sergipe. No
laboratório, as frutas coletadas foram
devidamente sanitizadas com Hipoclorito
de sódio 2,5 %, selecionadas e trituradas
para a extração do suco, e um volume de
500 mL desses sucos foram transferidos
para erlenmeyers esterilizados para que o
processo de fermentação espontânea tivesse
início, à temperatura de 25±2°C. A
fermentação foi acompanhada e quando o
valor dos açúcares totais, medidos em °Brix
por um refratômetro portátil, tornou-se
estável, procedeu-se como isolamento das
leveduras.
O meio utilizado para isolamento
das leveduras foi o agar YM (“yeast extract-
malt extract agar”, glicose 1%, extrato de
malte 0,3%, extrato de levedura 0,3%,
peptona 0,5%, agar 2%), no qual foram
plaqueadas em duplicata. As placas foram
incubadas a 25°C por três a sete dias. Após
esse período, foram purificados 2 isolados
do morfotipo dominante.
5.2 Identificação das leveduras
As características
macromorfológicas como tamanho, forma,
elevação, borda, cor e textura foram
analisadas após o crescimento colonial dos
diferentes morfotipos isolados. Em
seguidas foram preparadas lâminas com
inóculos dessas leveduras e analisadas em
microscópio, afim de se verificar sua
micromorfologia de um ângulo mais
aproximado.

7. 5.3 Produção de cerveja a nível
artesanal
Todos os procedimentos foram
realizados no Laboratório de Alimentos e
Bebidas (LAAB) e Laboratório de
Microbiologia Aplicada (LMA) da
Universidade Federal de Sergipe, com todos
os equipamentos previamente limpos e
devidamente sanitizados.
Para a elaboração da bebida, optou-
se pelo estilo Pale Ale, devido não somente
ao seu sabor peculiar, mas também pela
facilidade de fabricação e por serem claras
e lupuladas, mas que não chegam a ser
extremamente amargas. Elas atingem um
ponto de equilíbrio entre o amargo com um
toque suave ao final da degustação. Para
tanto, foram utilizados os seguintes
ingredientes: Água, Lúpulo Cascade, Malte
Pilsen Agrária e leveduras isoladas do caju.
De início, fez-se a moagem dos
referidos maltes em moinho de rolos,
garantindo, dessa forma, uma quebra
adequada dos maltes, no qual se objetiva
esmagá-lo para que seja exposto o amido
interno, mas sem prejudicar a integridade da
casca que o envolve. Terminada esta etapa,
deu-se início ao processo de mosturação, o
qual tem o propósito de fazer a quebra da
molécula de amido em seus monômeros,
originando uma solução glicosada, a qual
dá-se o nome de mosto. Para tanto, em
panela adequada, aqueceu-se até a
temperatura de 70°C um total de 6 L de água
destilada e foi mergulhado um grain bag,
um sistema usado em brassagens BIAB
(Brew in a Bag), de camada dupla que
funcionou como um filtro, facilitando a
mostura e a limpeza do equipamento, bem
como a não utilização de duas panelas. Em
seguida, adicionaram-se 1,3 Kg do referido
malte. Neste momento, a temperatura
diminuiu para 55ºC, na qual permaneceu
durante 60 minutos sobre constante
movimentação.
Logo em seguida, deu-se início a
lavagem dos grãos. O grain bag foi
levantado cuidadosamente para que o
líquido retido escorresse, e foi lavando com
água destilada até que completasse a
medida de 8L com o auxílio de um
escorredor de alumínio devidamente
sanitizado. Essa etapa garante um
aproveitamento maior dos açúcares
presentes no malte. Esse método teve
duração de, aproximadamente, 2 minutos. A
temperatura foi elevada para 65ºC por 45
minutos. Em seguida foi adicionado 13g de
lúpulo Cascade. Esta etapa tem o objetivo
de, através da alta temperatura, extrair os
componentes aromáticos e de amargor que
são inerentes do lúpulo. Para tanto, após o
início do borbulhamento do mosto,
acrescentou-se o lúpulo na quantidade de
16g, aos 10 minutos finais. Faltando 5
minutos para o termino da fervura, que
durou 45 minutos, acrescentou-se 21g do
restante do lúpulo para aroma. Após isso,
iniciou-se o processo de resfriamento do
mosto, para que fosse possível a inoculação
da levedura. Para tanto, foi utilizado uma
caixa de isopor contendo pedras de gelo até
que se atingisse a temperatura de 25ºC.
Com isso, foi realizada sua transferência
para balde de fermentação adequado, feito
de plástico atóxico de 12 L, onde se realizou
a inoculação de aproximadamente 10 mL de
levedura em meio de cultura líquido e o
fermentador acomodado em temperatura
ambiente de 26°C durante o período de 7
dias para que ocorresse o processo
fermentativo e ressaltasse alguns aromas
específicos do estilo que estava sendo
produzido. A fermentação e o pH foi
acompanhado em dias alternados, afim de
que se tivesse o monitoramento e controle
desses parâmetros. Verificada a baixa
fermentação do mosto, foi preparado um
starter com leveduras inoculadas em Caldo
YPD (Yeast extract – Peptone – Dextrose),
que foi deixado em agitação por 24h com o
auxílio de uma barra magnética, conhecida
como “peixinho”, sobre um agitador. Logo
após, foi deixado mais 5 dias à 26°C, afim
de foçar a fermentação.
Passada a etapa de fermentação,
deu-se início a um período longo de
maturação, na qual a cerveja ficou incubada
à temperatura de aproximadamente 4ºC
durante um tempo de 7 dias. Aguardado o

8. tempo de maturação do produto, deu-se
início ao processo de envase da mesma.
Para tanto, utilizou-se garrafas de 600mL e
previamente limpas com detergente neutro,
álcool 70% e, após enxague, deixou-se as
mesmas secarem, garantindo, dessa forma,
eficiente higiene das mesmas. Após esta
etapa, foram utilizadas para o processo de
envasamento. O envase da cerveja tem o
objetivo de fazer uma refermentação (2ª
fermentação) da cerveja para que haja a
formação de gás, com a utilização das
leveduras que ainda estão suspensas.
5.4 Teste controlado de tolerância ao
alcoólica, floculação e fermentação
Afim de sanar as dúvidas
decorrentes da capacidade fermentativa do
mosto cervejeiro e resistência alcoólica e
floculação da levedura em questão, foi feito
inicialmente a reativação das mesmas em
meio YM (Yeast Malt Ágar) em cinco
placas. Aguardou-se o crescimento das
colônias (Figura 2) durante 48 horas em
estufa com temperatura de 25ºC. Em
seguida, foi preparado 1 L de caldo DME
(Dry Malt Extract) e distribuído em 5 Erlen
Meyers, cada um contendo
aproximadamente 150 mL de meio, afim de
que fossem feitos todos os testes descritos
acima. Em seguida, foi iniciada a
inoculação das leveduras nesses recipientes.
Este método possibilita observar como as
leveduras em diferentes concentrações irão
se comportar, como por exemplo, se ocorrer
turbidez do meio é sinal que elas estão se
multiplicando, fermentando o mosto e,
consequentemente, consumindo o açúcar
maltose.
Para que se tivesse conhecimento da
resistência alcoólica pelas leveduras, foi
acrescentado Álcool P.A 99,8% (Álcool
Absoluto) em diferentes concentrações.
Sabendo que uma cerveja ideal tem teor
alcoólico entre 3% - 5%, foi feito o cálculo
nas proporções adequadas e distribuído em
todos os mostos. Estando elas consumindo
os açúcares presentes no meio preparado
incluindo a maltose, podem ser
consideradas leveduras maltófilas e com
grande capacidade de fermentar um mosto
cervejeiro. Os pequenos mostos (Figura 3)
foram colocados em diferentes
temperaturas, o que continha 3% e 3,5% de
álcool foram colocados em estufa com
temperatura a 25 ºC, o que continha 4% foi
colocado em geladeira com temperatura de
aproximadamente 12 ºC, enquanto que os
que continham 4,5% e 5% foram deixados a
temperatura ambiente dentro do laboratório
e o teor alcoólico medidos a cada 24 horas,
bem como a observação da turbidez do
mosto, afim de saber o quanto que a
levedura iria flocular.
A grau de floculação foi
acompanhada diariamente. De acordo com
a literatura científica, floculação é a
capacidade que as leveduras têm de se
aglutinar, separando-se do mosto depois de
certo tempo em contato com ele. Assim
como a atenuação, ela pode ser alta, média
ou baixa. Esse teste possibilita saber se
essas condições auxiliam no resultado final
de uma cerveja mais clara ou mais escura.
Figura 2: Reativação das leveduras em meio YM (Yeast Malt Ágar).
Fonte: autor

9. Figura 3: Mostos com diferentes teores alcoólicos
Fonte: autor
5.5 Determinação de açúcares
redutores – Método de Enyon-Lane
A qualidade das polpas de fruta foi
avaliada quanto aos teores de pH, acidez
titulável, sólidos solúveis e açúcares
redutores. As determinações foram feitas
em triplicata de modo a obter um resultado
mais significativo.
No Brasil a qualidade de polpas de
fruta comercializadas é regulamentada pela
Instrução Normativa de Nº 1 de 07 de
janeiro de 2000 que determina os Padrões
de Identidade e Qualidade (PQI’s). Esta
legislação define Polpa de fruta como sendo
o produto não fermentado, não concentrado,
não diluído, obtida de frutos polposos,
através de processo tecnológico adequado,
com um teor mínimo de sólidos totais,
proveniente da parte comestível do fruto
(BRASIL, 2000) . Outro fator é o controle
de qualidade os parâmetros como acidez
titulável, sólidos solúveis, açúcares
redutores e totais, vitamina C e pH são
importantes para a padronização do produto
e análise de alterações ocorridas durante
processamento e armazenamento
(DANTAS, 2010).
No preparo da solução de Fehgling
A, foi dissolvido 6,9 g de sulfato de cobre
pentahidratado em água e adicionado 0,1
mL de ácido sulfúrico concentrado o o
volume completado em um balão
volumétrico de 100 mL.
No preparo da solução de Fehling B,
foi dissolvido 34 g de tartarato de sódio e 10
g de hidróxido de sódio em água até
completar o volume do balão volumétrico
de 100 mL. Foi utilizado também no teste,
solução de glicose a 1%, solução de Azul de
metileno 0,2 %, ácido clorídrico
concentrado e hidróxido de sódio 10%.
5.5.1 Padronização da Solução de
Fehling A + Solução de Fehling B
Para a titulação das amostras, foi
pipetado em um erlenmeyer, 15 mL da
solução A e 15 mL da solução B, 30 mL de
água destilada e adicionado 3 a 4 gotas da
solução de azul de metileno. O recipiente
foi aquecido até a fervura e iniciada a
titulação com a solução de glicose 1%
através da bureta, mantendo a solução
fervendo. O ponto de titulação é dado
quando a solução sobrenadante estiver
incolor, ou seja, quando a cor azul
desaparece. A titulação ocorreu no máximo
3 minutos, até que o precipitado formado
ficasse na cor vermelha tijolo e repetiu-se a
titulação
5.5.2 Preparação das amostras –
açúcares redutores
Nesta etapa, foi pipetado 25 mL da
amostra e transferida para um béquer de 100
mL. O pH foi ajustado até que ficasse
próximo de 7. Em seguida, a amostra do

10. suco de caju, foi transferida,
quantitativamente, para um balão
volumétrico de 250 mL, e o de acerola para
um balão volumétrico de 500 mL e
completados os volumes com água
destilada.
Para a titulação das amostras, foi
pipetado em um erlenmeyer, 5 mL da
solução A e 5 mL da solução B, 30 mL de
água destilada e adicionado 3 a 4 gotas da
solução de azul de metileno. O recipiente
foi aquecido até a fervura e iniciada a
titulação com as amostras através da bureta,
mantendo a solução fervendo. O ponto de
titulação é dado quando a solução
sobrenadante estiver incolor, ou seja,
quando a cor azul desaparece. A titulação
ocorreu no máximo 3 minutos, até que o
precipitado formado ficasse na cor
vermelha tijolo e repetiu-se a titulação.
5.6 Caracterização Molecular
5.6.1 Obtenção do DNA total
Para a extração de DNA total, as
leveduras foram reativadas em meio ágar
YM (Yeast Malt Ágar) e aguardado o
crescimento de 24 a 48h numa estufa com
temperatura de 25°C. Posteriormente, após
o crescimento das colônias, deu-se início a
extração do DNA seguindo o Protocolo de
extração kit Wizard Genomic A1125. Foi
feita a raspagem de algumas colônias na
cultura com uma alça de platina flambada.
Foi adicionado 300 µL de solução de Lisina
e em seguida as células foram suspensas em
293 µL de EDTA a 50 mM e centrifugadas
a 3000 rpm por 5 minutos em temperatura
ambiente. Em seguida, o pellet foi
macerado por 2 minutos com pistilo
autoclavado e depois a amostra foi incubada
a 65 ºC por 30 minutos. Após decorrido esse
tempo, foi adicionado 5 µL de proteinase K
e 1,5 µL de solução de RNase A e misturado
por inversão 10 vezes. Logo após, a amostra
foi incubada a 37 ºC por 30 minutos em
Banho Maria para a liberação dos
protoplastos.
Decorrido o tempo de incubação, a
amostra foi levada cuidadosamente para o
banho de gelo por 5 minutos e adicionado
300 µL de Proteinase e centrifugada a
13.000 rpm por 8 minutos. Após a etapa
anterior, a amostra fora colocada no gelo
por 5 minutos e o sobrenadante transferido,
cuidadosamente, para outro tubo
esterilizado, ao qual foram adicionados 600
μL de isopropanol. Após essa incubação, a
amostra fora misturada por inversão e
centrifugadas a 13.000 rpm por 3 minutos,
o sobrenadante descartado cuidadosamente,
e ao pellet de DNA formado acrescentados
500 μL de etanol 70%. Os tubos foram
centrifugados por 3 minutos a 13.000 rpm.
Após a lavagem com etanol, o sobrenadante
foi descartado e o tubo contendo o DNA foi
deixado, por 15 minutos, invertido sobre um
papel toalha para a saída de todo o etanol.
Após esse procedimento, a reidratação foi
realizada com 50 μL de água ultrapura
esterilizada, e o tubo foi preservado à
temperatura de -20ºC.
Após a extração do DNA nuclear
foram realizadas reações de PCR
utilizando-se o termociclador Mastercycler
(Eppendorf) e ajustando a temperatura para
53,5 ºC para o anelamento dos marcadores,
ITS 1 e ITS 2, que foram utilizados nas
amostras. No final de cada ciclo fez-se uma
extensão de 10 minutos a 72 ºC. A reação
de PCR foi realizada em um volume final de
25 μL e a amostra 2,5 μL. Sendo que, o
volume do Mix usado foi de 2,5 μL e o de
água 8 μL. Os primers ficaram à 1 ng/L. Os
produtos de PCR foram analisados por meio
de eletroforese em gel de agarose 1,5%. Os
perfis de banda foram visualizados com
auxílio de luz ultravioleta e fotografados.
7. RESULTADOS E DISCUSSÃO
7.1 Parâmetros e características físico-
químicas da polpa da acerola e do caju
Após o preparo dos sucos, foi
medido a OG (Original Gravity), através do
refratômetro ºBrix que possui uma escala
numérica que mede a quantidade de sólidos
solúveis em uma solução de sacarose.

11. Açúcares solúveis presentes nos frutos na
forma combinada são responsáveis pela
doçura, sabor e cor atrativa como derivado
das antocianinas e pela textura, quando
combinados adequadamente
polissacarídeos estruturais. Os principais
açúcares em frutos são: glicose, frutose e
sacarose em proporções variadas, de acordo
com a espécie. O teor de açúcares aumenta
com a maturação dos frutos (GOMES et al.,
2002). O aparelho indicou 3,0±20ºC para o
suco de acerola e de aproximadamente
4,0±20ºC para o suco de caju, estes valores
mostraram-se compatíveis com os de
(OLIVEIRA, 1999). Após passado quatro
dias de fermentação à temperatura
ambiente, foi medido novamente a OG dos
fermentados, marcando aproximadamente
2,5±20ºC para o suco de acerola e 3,5±20ºC
para o suco de caju. A partir dessa
observação, notou-se que houve uma
pequena diminuição da quantidade de
açúcares, comprovando assim, o consumo
dos mesmos pelas leveduras presentes.
Foi medido também o pH inicial e
final dos sucos com um pHmetro de
bancada, marcando inicialmente 3,3 para o
de acerola e 4,2 para o de caju, confirmando
o que já se esperava do grau de acidez das
frutas em questão. Após ter aguardado 4
dias de fermentação dos sucos, foi medido
novamente o pH, marcando 3,1 para o
fermentado de acerola e de 3,7 para o
fermentado de caju como mostra a (Tabela
2).
Afim de evitar possíveis
contaminações, foi aplicado em cada
fermentado aproximadamente 5 g de
cloranfenicol 0,01% que é um antibiótico de
amplo espectro, sendo eficaz contra
bactérias gram-negativas, gram-positivas e
Rickettsia.
Tabela 2: Valores médios de sólidos solúveis (°Brix) e acidez titulável das polpas
Frutas pH (inicial) pH (final) Brix (inicial) Brix (final)
Acerola 3,3 3,1 3 2,5
Caju 4,2 3,7 4 3,5
7.2 Teste de açúcares redutores
utilizando o Método de Enyon-Lane
Realizado o teste de Fehling A e B
com as amostras, chegou-se aos respectivos
valores: 1,48 para acerola e 3,16 para caju.
Os valores obtidos mostraram-se
compatíveis com os de (BRASIL;
SIGARINI, 2016; OLIVEIRA, 1999). A
Portaria nº 58, mostra diversos parâmetros
de regulamento técnico para fixação dos
padrões de identidade e qualidade para
polpas de frutas incluindo acerola e caju,
porém não descreve o valor de açúcares
redutores de cada uma delas. Nessa mesma
legislação, mostra os valores para açúcares
totais, porém não se aplica ao resultado
obtido por conta da não adição de açúcar
comum nos preparados.
7.3 Resultado final da cerveja
Após ter sido feita todas análises
descritas no decorrer do trabalho, foi
calculado o teor alcoólico final da cerveja
aplicando a seguinte fórmula (Densidade
Inicial (DI) – Densidade Final (DF) * 131),
no qual obteve-se o valor de 1,1 % de teor
alcoólico. Como já visto anteriormente, o
teor alcoólico ideal de uma cerveja fina na
faixa de 3% - 5%, e o resultado obtido para
a cerveja em estudo ficou muito abaixo do
esperado, evidenciando a baixa
fermentação pelas leveduras nas condições
em que o mosto foi submetido. Por conta
disso não foi realizado o teste de
sensibilidade com o público. Contudo, estes
resultados são úteis para trabalhos futuros.

12. 7.4 Análise da reação de PCR
Na análise da reação de PCR,
obteve-se como resultado a presença bandas
de tamanho próximo a de 200 pb. Egli &
Henick-kling (2001) obtiveram
amplificação de fragmentos da mesma
região do DNA com tamanho entre 450 e
550 bp para leveduras do gênero
Brettanomyces sp, enquanto para Candida
sp, Pichia sp e Saccharomyces cerevisiae o
tamanho dos fragmentos variaram entre 600
e 900 bp. Fernández-Espinar et al. (2010)
obtiveram fragmentos, também da região
ITS do DNA, com o tamanho de cerca de
850 bp para espécies Saccharomyces
cerevisiae. Fatos que invalidaram o
resultado obtido nesta parte do trabalho por
estarem não condizentes com os obtidos por
outros pesquisadores.
Figura 4. Perfil de bandas dos amplicons obtidos utilizando-se o iniciador ITS 1 e ITS 2 com os
isolados de leveduras Saccharomyces do mosto fermentado do Vale do São Francisco, mais
precisamente em Sergipe. M: Marcador molecular com até 2kb ladder.
7.5 Tolerância alcoólica
Após ter acompanhado os mostos
durante sete dias, fazendo a aferição da
produção de álcool com o auxílio do
refratômetro ºBrix, observou-se que não
houve considerável variação entre as
amostras, pois o valor inicial de todas elas
foram 11 ºBrix, permanecendo assim
durante seis dias e no último dia houve uma
pequena mudança nas amostras contendo
3,5%, 4%, 4,5% e 5% como mostra a
(Tabela 3).

13. Tabela 3. Variação de teores alcoólicos.
Em contrapartida, a amostra a amostra
contendo 3% de álcool permaneceu no
mesmo estado, significando que
possivelmente essas leveduras não
conseguem fermentar estando nessa faixa
de concentração alcoólica ou a temperatura
em que este mosto permaneceu durante os
dias de teste não favoreceu a ação da
fermentação. Por outro lado, observou-se
que a amostra contendo 3,5% de álcool foi
a que mais teve um valor mais abaixo se
comparada às outras amostras. Ficando
evidente uma possível faixa ideal de
temperatura e concentração alcóolica que
essas leveduras fermentam a maltose
presente no mosto.
7.6 Crescimento de colônias das
diferentes concentrações alcoólicas
Terminada a etapa da análise
anteriormente citada, deu-se início à análise
do crescimento das leveduras e a formação
de colônias em meio de cultura contendo
Ágar YPD. Esse resultado mostrou que as
amostras contendo 3,5% e 4,5% de teor
alcoólico tiveram crescimento considerável,
com colônias globosas, se comparadas as
amostras de 3% e 4%, com crescimento
reduzido e colônias pequenas. Com isso,
percebe-se que, essas leveduras são
resistentes em concentrações alcoólicas na
faixa de 3,5% - 4,5%. Podendo, futuramente
serem utilizadas em bebidas fermentadas
com esses teores alcoólicos.
8. CONCLUSÃO
Neste trabalho uma levedura isolada
da poupa do caju foi investigada, a fim de
avaliar seu uso potencial na produção de
cerveja artesanal. A levedura não fermentou
bem o mosto cervejeiro de maneira rápida e
mostrou um baixo desempenho na faixa de
temperaturas estudadas, consequentemente,
esse tipo de comportamento é característico
de leveduras não-maltófilas ou de leveduras
da espécie Saccharomyces uvarum pelo fato
da baixa fermentação. O microrganismo
apresentou um melhor crescimento a uma
temperatura mais baixa, podendo vir a ser
classificada como uma levedura do tipo
Lager. Além disso, o teste de tolerância
alcoólica mostrou-se eficiente, pois a partir
desse teste foi possível saber qual a
concentração de álcool esse tipo de levedura
fermenta e melhor se multiplicam.
Diante das dificuldades de se
estudar sistemas biológicos, devido a sua
complexidade, algumas sugestões para
trabalhos futuros são apresentadas:
 Analisar outras cepas de leveduras isoladas
de frutos tropicais para a produção de
cervejas artesanais e verificar se o que foi
estudado neste trabalho pode ser aplicado a
outros microrganismos;
 Em relação às leveduras da acerola e do caju
utilizadas neste trabalho, um estudo mais
detalhado da viabilidade celular pode ser
realizado. Fermentações em série podem ser
realizadas, utilizando as leveduras
Amostras
(%) Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7
3,0% 11° 11° 11° 11° 11° 11° 11°
3,5% 11° 11° 11° 11° 11° 11° 10°
4,0% 11° 11° 11° 11° 11° 11° 10,5°
4,5% 11° 11° 11° 11° 11° 11° 10,5°
5,0% 11° 11° 11° 11° 11° 11° 10,5°

14. ressuspensas de um ensaio como inóculo do
ensaio a seguir, avaliando até que ponto a
viabilidade da levedura é alta o suficiente
para não afetar a qualidade final da cerveja;
 Um estudo dos açúcares não fermentáveis,
muito complexos para serem quebrados
pela levedura e utilizados no processo de
fermentação. Esse estudo também ser
realizado com finalidade de entender o
limite de densidade final atingido pela
levedura ao fim da fermentação;
 Desenvolver um estilo de cerveja que seja
característico do Brasil e que se adeque às
condições climáticas deste país, utilizando a
própria microbiota brasileira e
disponibilizando-as para uso comercial.
Sanando assim, a crise de identidade
cervejeira que o país enfrenta atualmente.
 Realizar um estudo de melhoramento
genético com leveduras não-maltófilas para
uso na produção de cerveja artesanal.
Pesquisas na área de cervejas artesanais
é de fundamental importância para
impulsionar avanços tecnológicos, pois o
mercado de cervejas artesanais tem crescido
muito no Brasil e o número de fábricas tem
saltado exponencialmente. Fazendo isso,
colocará o Brasil como um forte
concorrente na produção de cervejas de
qualidade a partir de produtos provenientes
da imensa variedade de frutos tropicais,
valorizando a própria microbiota brasileira.
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__________________________________
1. Estudante de Iniciação Científica –
Curso de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Sergipe –
UFS;
2. Estudante de Iniciação Científica –
Curso de Farmácia da Universidade
Federal de Sergipe – UFS;
3. Técnico Laboratório/Área do
Departamento de Morfologia da
Universidade Federal de Sergipe –
UFS;
4. Co-orientador: Prof. Dr. Flávio
Henrique Ferreira Barbosa.
Laboratório de Microbiologia e
Tecnologia Cervejeira –
LMTC/UFS, Departamento de
Morfologia da Universidade Federal
de Sergipe – UFS;
5. Orientador: Prof. Dr. Tiago
Branquinho Oliveira. Laboratório
de Alimentos e Bebidas –
LAAB/UFS – Departamento de
Farmácia da Universidade Federal
de Sergipe – UFS.
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