REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228 Volume 20 - Número 2 - 2º Semestre 2020

1. REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228
Volume 20 - Número 2 - 2º Semestre 2020
ESTUDO DE VIABILIDADE DE LEVEDURAS INDÍGENAS ISOLADAS DE FRUTOS
TROPICAIS DO BRASIL PARA FABRICAÇÃO DE CERVEJA EM NÍVEL ARTESANAL
Flávio Henrique Ferreira Barbosa 1
; Braulio Esteve-Zarzoso2
; Albert Más Baron3
RESUMO
Cerveja pode ser definida como uma bebida fermentada de teor alcoólico entre 3 e 8% (v/v), produzida a partir de água,
malte (geralmente de cevada), lúpulo e leveduras. O sabor e aroma da cerveja é determinado pela matéria prima utilizada,
pelo tipo de processo e pela levedura, além dos compostos produzidos durante a fermentação e maturação, que exercem
forte impacto nas características sensoriais da bebida. Em se tratando de cerveja, as leveduras são um dos ingredientes
fundamentais para a produção desta bebida. Estes microrganismos conferem as características de sabor, aroma e textura
(em alguns casos) de qualquer cerveja, as quais são determinadas de forma preponderante pelo tipo de levedura utilizada.
Neste sentido, o objetivo geral deste trabalho foi o de realizar a análise da adequação das leveduras indígenas isoladas no
Brasil a partir de frutos tropicais regionais como caju, mangaba e jabuticaba para a fabricação de cerveja em nível artesanal
e industrial, buscando introduzir inovações no setor de cervejas especiais que culminem em agregação de valor ao produto
final, fortalecimento da cultura cervejeira local e regionalmente e que possa ajudar, em médio e longo prazo, na
consolidação de uma “escola brasileira” de cerveja com características próprias e singulares frente aos demais mercados
já consolidados no mundo. Pode-se concluir que as leveduras selecionadas apresentaram capacidade de fermentação de
glicose, sacarose e, principalmente a maltose; boa tolerância a no mínimo 5% de etanol e densidade normal do mosto. Os
testes de floculação e crescimento em diferentes temperaturas auxiliam no enquadramento do estilo mais adequado para
cada levedura, porém mais estudos são necessários para avaliar o perfil aromático, molecular e o produto final. A obtenção
de linhagens com fenótipos desejáveis para a produção de cerveja contribuirá para o desenvolvimento científico e
tecnológico do setor, oferecendo um produto biotecnológico nacional como alternativa ao fermento importado e
conferindo mais independência e autonomia ao mercado cervejeiro brasileiro.
Palavras-chave: Cerveja Artesanal, Leveduras, Saccharomyces, Fermentação, Frutos Tropicais.
VIABILITY STUDY OF INDIGENOUS YEASTS ISOLATED FROM TROPICAL FRUITS
IN BRAZIL FOR BEER MANUFACTURING AT ARTISANAL LEVEL
ABSTRACT
Beer can be defined as a fermented drink with an alcohol content between 3 and 8% (v/v), produced from water, malt
(usually barley), hops and yeast. The flavor and aroma of beer is determined by the raw material used, the type of process
and the yeast, in addition to the compounds produced during fermentation and maturation, which have a strong impact on
the sensory characteristics of the drink. In the case of beer, yeasts are one of the fundamental ingredients for the production
of this drink. These microorganisms confer the characteristics of flavor, aroma and texture (in some cases) of any beer,
which are determined predominantly by the type of yeast used. In this sense, the general objective of this work was to
carry out the analysis of the suitability of indigenous yeasts isolated in Brazil from regional tropical fruits such as cashew,
mangaba and jabuticaba for the manufacture of beer at an artisanal and industrial level, seeking to introduce innovations
in the sector of special beers that culminate in adding value to the final product, strengthening the local and regional beer
culture and that can help, in the medium and long term, in the consolidation of a “Brazilian school” of beer with its own
and unique characteristics compared to other markets already consolidated in the world. It can be concluded that the
selected yeasts showed the ability to ferment glucose, sucrose and, mainly, maltose; good tolerance to at least 5% ethanol
and normal wort density. Flocculation and growth tests at different temperatures help to frame the most appropriate style
for each yeast, but more studies are needed to evaluate the aromatic, molecular profile and the final product. Obtaining
lines with desirable phenotypes for beer production will contribute to the scientific and technological development of the
sector, offering a national biotechnological product as an alternative to imported yeast and giving more independence and
autonomy to the Brazilian beer market.
Keywords: Craft Beer, Yeasts, Saccharomyces, Fermentation, Tropical Fruits.
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2. INTRODUÇÃO
Cerveja pode ser definida como uma
bebida fermentada de teor alcoólico entre 3 e 8%
(v/v), produzida a partir de água, malte
(geralmente de cevada), lúpulo e leveduras,
permitindo-se ainda o uso de outras matérias
primas como arroz, trigo, centeio, milho, dentre
outros (OLIVER, 2003, HAMPSON, 2008,
2013; MORADO, 2017).
O sabor e aroma da cerveja é determinado
pela matéria prima utilizada, pelo tipo de
processo e pela levedura, além dos compostos
produzidos durante a fermentação e maturação,
que exercem forte impacto nas características
sensoriais da bebida (BASTOS, 2010;
BORTOLI et al., 2013).
Elas são classificadas basicamente em
dois tipos: Lager (de baixa fermentação) e Ale
(de alta fermentação). Cervejas tipo Lager são
fermentadas à temperatura entre 7 a 14 °C e a
duração da fermentação e da maturação é de 7 a
15 dias. As cervejas tipo Lager, são elaboradas
com linhagens de Saccharomyces pastorianus
sendo mais populares mundialmente. As cervejas
tipo Ale são fermentadas à temperatura de 18 a
24 °C e a duração da fermentação e da maturação
é de 3 a 7 dias, são elaboradas com linhagens de
Saccharomyces cerevisae sendo muito populares
no Reino Unido (OLIVEIRA, 2011; SENAI,
2014; FIGUEIREDO, 2016).
Com a globalização da economia e as
fusões de grandes cervejarias, a indústria da
cerveja consolidou-se em grandes grupos pelo
mundo. Atualmente, existem três grandes
cervejarias (AB-InBev, Heineken e Muller), as
quais produzem mais de 100 milhões de
hectolitros/ano, e detêm quase 50% da produção
mundial de cervejas, possuindo marcas
distribuídas pelos diversos países. No Brasil, essa
tendência pode ser constatada desde 1999, pelas
grandes aquisições e fusões do setor como a AB-
InBev e Heineken (que recentemente adquiriu a
FEMSA e Brasil Kirin, no Brasil) (FERREIRA,
2011; SMIT, 2014; ALWORTH, 2015).
Contrário ao movimento de expansão, de
fusões e formações de grandes conglomerados,
de consumo de bilhões de litros de cerveja do tipo
Lager, que devem ser consumidas de forma
gelada e rápida, surge o movimento do “slow
beer” (BEAUMONT, 2015). A filosofia deste
movimento tem relação com o resgate da história
e da cultura, do prazer de se fazer e beber boas
cervejas, associada à alta gastronomia
(FERREIRA, 2011; SMIT, 2014; ALWORTH,
2015).
Nesse contexto, ressurgiram as
cervejarias artesanais e os cervejeiros caseiros,
também chamados de homebrewers, que têm
como atração a produção da própria cerveja, ao
contrário da maioria das cervejas produzidas
pelas grandes cervejarias que estão disponíveis
ao consumidor comum (COLE, 2011; DREDGE,
2013 e 2014; FERGUSSON, 2016). De acordo
com Morado (2017), o Brasil hoje, possui mais
de 432 cervejarias artesanais com registro e mais
de 1200 rótulos produzidos. O impacto de tudo
isso para a economia nacional pode ser traduzido
assim: 2,7 milhões de empregos diretos gerados;
8 milhões de empregos indiretos gerados, 28
bilhões pagos em salários; 12 mil fornecedores
de bens e serviços; 70 bilhões de faturamento; 17
bilhões de investimento de 2010 a 2014; 21
bilhões pagos em tributos; representam 1,6% de
todo o PIB do Brasil.
Além do ambiente favorável para
produtos diferenciados e exclusivos, de acesso
limitado a pequenos grupos de apreciadores,
outros fatores são importantes no fortalecimento
das cervejas especiais. Dentre eles, cita-se o
perfil do consumidor brasileiro, cada vez mais
exigente, com o paladar mais apurado e
sensibilizado pela invasão das cervejas
importadas no mercado nacional e pela ampla
divulgação da mídia televisiva e pela internet
(PEROZZI, 2012). Com igual importância,
observa-se a concentração e o domínio de
grandes grupos cervejeiros, resultando em um
contingente significativo de mestres-cervejeiros
disponíveis no mercado e aposentados
(MORADO, 2017). Estes profissionais detêm o
capital de conhecimento na produção da cerveja
e, em conjunto com as Acervas (Associações de
Cervejeiros Artesanais), continuam a participar
ativamente desse movimento como consultores
ou instrutores de cursos, ajudando a desenvolver
novas receitas de cerveja baseadas e ajudando
assim a difundir a cultura cervejeira (LAW &
GRIMES, 2012; HUGHES, 2013; HINDY,
2014).

3. 1.1 A Fermentação
O processo de fermentação é iniciado
pela inoculação do mosto, designado de pitching
em gíria cervejeira. A concentração típica do
inóculo varia entre 5x106 e 2x107 células de
levedura por mL de mosto (Eblinger & Narzib,
2012; Eaton, 2006). Nesta etapa do
processamento, a levedura inoculada irá utilizar
os nutrientes presentes no mosto para o seu
crescimento, convertendo concomitantemente o
mosto em cerveja.
A cerveja não deixa de ser um subproduto
da atividade metabólica da levedura. Portanto, é
necessário que as condições de fermentação
sejam tais que possibilitem o seu crescimento
controlado, resultando na formação equilibrada
dos produtos metabólicos de interesse na
quantidade desejada (Boulton & Quain, 2008).
1.1.1 Fermentação Alcoólica
A fermentação alcoólica é via metabólica
preferencial das leveduras cervejeiras para
obtenção de energia (Walker & Stewart, 2016;
White & Zainasheff, 2010). A levedura produz
como principais produtos decorrentes do
catabolismo de açúcares, etanol e dióxido de
carbono (Rodman e Gerogiorgis, 2016. Na
ausência de oxigénio molecular ou na presença
de elevadas concentrações de açúcares
fermentescíveis, nomeadamente glucose, a
levedura irá optar pela via fermentativa, obtendo
energia por fosforilação a nível do substrato
(Kitagaki & Takagi, 2014). Nesta via metabólica
a formação de ATP deriva exclusivamente da
glicólise por fosforilação a nível do substrato
(Briggs et al., 2004). A produção de etanol tem
como principal propósito a regeneração do
potencial redutor NAD+, de modo a manter o
equilíbrio redox, evitando a acumulação de
NADH- e a inevitável interrupção da
fermentação (Briggs et al., 2004).
Apesar de os principais produtos
decorrentes do catabolismo de açúcares serem
etanol e dióxido de carbono, a conversão de
açúcares em etanol é apenas 85% da quantidade
teórica pois parte dos açúcares são metabolizados
para a produção de biomassa e metabolitos
secundários (Briggs et al., 2004).
1.2 A Levedura
A levedura é responsável pela
transformação dos açúcares fermentescíveis
presentes no mosto em etanol e dióxido de
carbono, além de uma extensa gama de outros
compostos que irão influenciar o paladar e aroma
da cerveja (Russell, 2006). Os benefícios da
atividade da levedura estendem-se para além do
perfil sensorial, pois, devido à produção de etanol
e de diversos metabolitos que provocam um
decréscimo do valor de pH da cerveja, esta acaba
por ser um produto microbiologicamente mais
estável (Boulton & Quain, 2008).
A natureza de qualquer bebida alcoólica é
determinada não só pela linhagem de levedura
utilizada no processo fermentativo, mas também
pelo substrato que esta converte (Bamforth,
2003). Assim, a influência da levedura é
determinante na qualidade final da cerveja, sendo
imperativo além da seleção do gênero, espécie e
linhagem adequada ao estilo de cerveja, garantir
a sua viabilidade e inoculação sem contaminação
e propiciar um perfil físico-químico do mosto e
condições de fermentação ideais para o seu
crescimento (Quain, 1986).
Historicamente, a fermentação do mosto
da cerveja é levada a cabo por leveduras do
gênero Saccharomyces, pertencentes à família
Saccharomycetaceae (Eblinger & Narzib, 2012).
A espécie e linhagem de levedura utilizada varia
consoante o estilo de cerveja, mas, de forma
clássica, para estilos de cerveja de baixa
fermentação (cervejas fermentadas a baixa
temperatura, estilos Lager) são utilizadas
leveduras da espécie Saccharomyces
pastorianus, enquanto aquelas de alta
fermentação (cervejas fermentadas a temperatura
superior, estilos Ale) recorrem a estirpes da
espécie Saccharomyces cerevisiae, adotando as
leveduras essa mesma designação, leveduras de
baixa e alta fermentação (Eblinger & Narzib,
2012).
Esta distinção decorre de diversas
características fisiológicas específicas para cada
uma delas, tais como: a capacidade de floculação,
temperatura óptima de crescimento ou até a
capacidade de utilização de certos dissacarídeos
(Vidgren, 2010). Por exemplo, leveduras de
baixa fermentação, têm capacidade de fermentar
melibiose, fermentam mais eficientemente
maltotriose, possuem maior capacidade de
floculação e fermentam a temperaturas mais
baixas (7-15ºC). Já aquelas denominadas de alta
fermentação não conseguem fermentar o
dissacarídeo mencionado além do seu

4. crescimento ser otimizado a temperaturas mais
elevadas (18-22ºC) (Russell, 2006).
1.3 Importância da Levedura no Perfil
Sensorial da Cerveja
Indubitavelmente, o papel que a levedura
desempenha no desenvolvimento sensorial da
cerveja é insubstituível, devendo a cerveja
grande parte da sua complexidade à atividade da
levedura durante a fase fermentativa e de
maturação (Boulton & Quain, 2008).
O papel da levedura estende-se para além
da simples conversão de açúcares
fermentescíveis em etanol e dióxido de carbono.
Como já foi mencionado acima, a levedura atua
em diversos planos para o desenvolvimento
sensorial da cerveja. Não descartando a
influência das outras matérias-primas básicas,
como o malte e o lúpulo, a levedura, a título
individual, é o elemento de maior preponderância
na produção e/ou conversão de compostos
aromáticos e de “flavour”. Centenas de
compostos de “flavour” ou aroma ativo são
extraídos e/ou sintetizados ao longo do processo
de produção de cerveja. Todavia, a grande
maioria dessas substâncias são produzidas
durante a fase fermentativa, como subprodutos
ou produtos intermediários do metabolismo da
levedura (Pires et al., 2014).
Meilgaard e colaboradores (1979)
criaram um documento conhecido como a “roda
dos sabores”, no qual incluíram os compostos e
descritores mais frequentemente associados à
cerveja. Segundo White, (1998), 59% dos
descritores de aroma e 79% dos descritores de
“flavour” podem ser atribuídos diretamente à
atividade da levedura, decorrentes da conversão
de compostos presentes no mosto. Consegue-se
então estabelecer uma relação inegável e direta
entre a atividade da levedura e a produção de
compostos aromáticos e de “flavour”.
Além do extenso leque de produtos
metabólicos que produz, também age como
intermediária na bioconversão de percursores
não-voláteis e inodoros em compostos de aroma
ativo, libertando o potencial organoléptico do
mosto (Basso et al., 2016; Steensels &
Verstrepen, 2014). De igual modo, é importante
a sua função na atenuação de compostos
indesejáveis e em última análise no equilíbrio
final do perfil sensorial da cerveja.
1.4 A Importância das Leveduras na
Inovação
Em se tratando de cerveja, as leveduras
são um dos ingredientes fundamentais para a
produção desta bebida. Estes microrganismos
conferem as características de sabor, aroma e
textura (em alguns casos) de qualquer cerveja, as
quais são determinadas de forma preponderante
pelo tipo de levedura utilizada. Embora o etanol
seja o principal produto de excreção produzido
pelo levedo durante a fermentação do mosto
cervejeiro, esse álcool primário tem pequeno
impacto no sabor da cerveja (SENAI, 2014;
GALLONE, 2016, 2018).
Para cada tipo de cerveja como as Belgas,
Inglesas, Alemãs e outras, são selecionadas
determinadas linhagens de leveduras. Como a
maioria desse material não é produzido no Brasil,
o custo de aquisição é elevado (CECCATO-
ANTONINI, 2010; MOREIRA, 2013).
O gênero Saccharomyces apresenta
várias linhagens consideradas seguras e capazes
de produzir dois metabolitos primários
importantes, etanol e dióxido de carbono.
Atualmente, taxonomistas de leveduras têm
designado todas as linhagens empregadas na
produção de cerveja como pertencentes a espécie
S. cerevisiae (MOREIRA, 2013; GARCIA,
2017).
O tipo e a concentração de vários
produtos de excreção formados durante a
fermentação são quem primariamente
determinam o sabor da cerveja. Mesmo com a
adição de lúpulos durante a produção da cerveja,
o que irá atrelar à bebida amargor e aromas
variados, as leveduras podem, também,
contribuir em menor escala, com a questão
aromática. A formação desses compostos
depende do processo metabólico do cultivo da
levedura. Vários fatores podem afetar esse
processo metabólico e, consequentemente, o
sabor da cerveja, incluindo a linhagem de
levedura, a temperatura e o pH da fermentação, o
tipo e a proporção de adjunto, o modelo de
fermentador e a concentração do mosto
(FIGUEIREDO, 2017).
Por todo o exposto, nota-se que o
desenvolvimento tecnológico, com a introdução
de matérias-primas de qualidade superior no
processo produtivo, torna-se imperativo para a
obtenção de produtos de maior aceitabilidade do
consumidor, sem o qual não se pode alcançar o

5. almejado crescimento das cervejarias artesanais
(SEVERO, 2015). Resta claro, pelo discorrido
até aqui, que existe a necessidade de
investimentos em pesquisa, desenvolvimento e
inovação, principalmente no que se refere a
linhagens de leveduras melhoradas e adequadas
às condições brasileiras de produção de cervejas,
visando à produção de cervejas artesanais que
agradem ao paladar do consumidor local. Trata-
se de um desafio, mas que pode ser alcançado e
gerar ganhos significativos à indústria nacional
de cervejas artesanais, principalmente pela
redução significativa da dependência de
importação de leveduras (OLIVEIRA, 2011;
CAVALHEIRO, 2013, MORADO, 2017).
Neste sentido, o objetivo geral deste
trabalho foi o de realizar a análise da adequação
das leveduras indígenas isoladas no Brasil a
partir de frutos tropicais regionais como caju,
mangaba e jabuticaba para a fabricação de
cerveja em nível artesanal e industrial, buscando
introduzir inovações no setor de cervejas
especiais que culminem em agregação de valor
ao produto final, fortalecimento da cultura
cervejeira local e regionalmente e que possa
ajudar, em médio e longo prazo, na consolidação
de uma “escola brasileira” de cerveja com
características próprias e singulares frente aos
demais mercados já consolidados no mundo em
países como Alemanha, Inglaterra, Bélgica,
Estados Unidos, etc.
OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Realizar a análise da viabilidade das
leveduras indígenas isoladas no Brasil a partir de
frutos tropicais regionais, para serem utilizadas
na fabricação de cerveja em nível artesanal e
industrial, buscando introduzir inovações no
setor de cervejas especiais que culminem em
agregação de valor ao produto final.
2.2 Objetivos Específicos
 Caracterizar em nível molecular as
leveduras em estudo (perfil de
fragmentos amplificados do DNA
ribossomal - rDNA);
 Verificar, em todas as linhagens
selecionadas, as seguintes características:
capacidade de crescimento e fermentação
utilizando maltose como fonte de
carbono, Floculação, Temperatura de
fermentação, Atenuação máxima do
mosto cervejeiro, Tolerância alcoólica;
 Verificar a utilização das linhagens
estudadas na produção de cerveja
artesanal em nível laboratorial e
industrial.
 Realizar análise sensorial da cerveja
artesanal produzida com uma das
leveduras caracterizadas.
METODOLOGIA
- Tipo de estudo: experimental, já que
buscou-se verificar o potencial de leveduras
isoladas de frutos brasileiros para serem
utilizadas na produção de cervejas em escala
artesanal.
- Local e período de estudo: este estudo
foi desenvolvido na Unitat d'Enologia do Centro
de Referência em Tecnologia dels Aliments
(CeRTA) da Universidade Rovira i Virgili, em
Tarragona, Catalunha, Espanha, no período de
agosto de 2018 a julho de 2019.
- Material de estudo:
a) neste estudo foram utilizados
microrganismos da Coleção de Leveduras do
“Laboratório de Microbiologia e Tecnologia
Cervejeira – CCBS – UFS”. Esta coleção
consiste em um banco de manutenção de
leveduras para elaboração de cerveja artesanal,
mantidas por meio de criopreservação. Estas
leveduras foram isoladas a partir de frutos
tropicais (caju, mangaba e jabuticaba) coletados
nos Estados de Sergipe e Minas Gerais, no
Nordeste e Sudeste do Brasil respectivamente.
Os microrganismos foram previamente
identificados por técnicas convencionais (testes
bioquímicos e morfológicos) e, passaram por
técnicas de biologia molecular (PCR-RFLP e
fingerprinting baseado nas sequências delta
repetitivas (SCHÜLLER, et al., 2004;
AGUSTINI, 2014).
b) Verificação das características, quanto:
a capacidade de crescimento e fermentação
utilizando maltose como fonte de carbono,
floculação, temperatura de fermentação,
atenuação máxima do mosto cervejeiro e

6. tolerância alcoólica; nas três linhagens
selecionadas e posteriormente identificadas de
acordo com CAVALHEIRO (2013), MOREIRA
(2013) e GARCIA (2017).
c) Produção de cerveja em nível artesanal
(Laboratório de Enologia Universitat Rovira i
Virgili). Na universidade Rovira i Virgili o
laboratório dispunha de toda a estrutura para
trabalhos de Microbiologia e Fermentação além
de equipamentos e insumos necessários à
produção de cerveja artesanal.
3.1 Material e Métodos
3.1.1 Caracterizar em nível molecular as
leveduras em estudo (perfil de fragmentos
amplificados do DNA ribossomal – rDNA e
fingerprinting baseado nas sequências Delta
repetitivas (SCHÜLLER, et al., 2004;
AGUSTINI, 2014).
A identificação e caracterização de
espécies e cepas de leveduras são na maioria das
vezes realizadas por testes morfológicos,
fisiológicos e bioquímicos (Barnett et al., 1990).
Entretanto, este processo resulta em
aproximadamente 90 testes e os resultados
variam dependendo do estado fisiológico do
cultivo ou da variabilidade intraespecífica, além
disso, os testes bioquímicos não são muito
sensíveis, levando à identificação de leveduras
imprecisa (Arias et al., 2002).
Testes moleculares têm sido bastante
utilizados como ferramenta na identificação de
leveduras, principalmente as linhagens que não
possibilitam sua diferenciação através de
características morfológicas essenciais,
impossibilitando-a por métodos convencionais
de identificação. Portanto, para a identificação e
análise filogenética, é muito importante o uso das
ferramentas de caracterização molecular que
utilizam desde proteínas e RNA, até o próprio
DNA como alvo de identificação. O alvo mais
frequente nas pesquisas de identificação
molecular por PCR e suas variações são os DNA
ribossomais. Os genes de DNA ribossomal são
encontrados em todos os microrganismos e são
conhecidos por acumular mutações lentas
(Kurtzman & Fell, 1998).
O gene presente no DNA ribossomal tem
sido bastante utilizado em estudos taxonômicos
pelo fato de ser universal, ou seja, estar presente
em todos os organismos, que evoluíram de um
ancestral em comum; está presente em várias
cópias e também pela presença de regiões
codificantes e não codificantes (Barnett et
al.,1990).
O gene 26S tem sido usado para
diferenciação em nível de gênero e espécies,
enquanto a região ITS é comumente utilizada
para separar espécies próximas e/ou subespécies,
bem como a região IGS que discrimina
subespécies e até estirpes quando combinada
com análises utilizando enzimas de restrição
(Valente et al., 1999).
Em leveduras, os genes ribossomais estão
organizados em clusters, na disposição 5’-3’, da
seguinte forma, segmentos 5S, 5.8S, 18S e 26S,
que estão presentes em várias cópias no genoma.
Os espaços transcritos internos (ITS) se
intercalam entre esses genes e são denominados
ITS1 e ITS2. Estas regiões são menos
conservadas e são utilizadas para discriminar
espécies relacionadas (Barnet et al., 2000).
Kurtzman & Robenett (1998)
demonstraram que a sequência de nucleotídeos
do domínio D1/D2 do gene 26S do RNA
ribossomal possui variação suficiente para
identificar quase todas as espécies conhecidas de
leveduras ascomicéticas e basidiomicéticas,
embora em algumas leveduras basidiomicéticas
seja necessário sequenciar também as regiões
ITS do RNA ribossomal (FELL et al., 2000).
As técnicas moleculares para agrupar
leveduras possuem a vantagem de diferenciar
entre espécies (variabilidade interespecífica) ou
cepas da mesma espécie (variabilidade
intraespecífica) e são aplicadas com o objetivo de
melhorar a eficiência e diminuir o custo da
identificação de leveduras (Fernandez-Espinar et
al., 2006).
3.1.2 Microrganismos e Manutenção
Foram estudadas 03 linhagens de
leveduras isoladas bioprospectados de frutos
obtidos na Região Nordeste e Sudeste do Brasil.
As leveduras denominadas UFSBR1, UFSBR2 e
UFSBR3 foram cultivadas em meio YPD
(extrato de levedura, 10 g/L; peptona, 20 g/L;
glicose, 20 g/L) por 24 h, acrescidas de 15% (v/v)

7. de glicerol estéril e estocadas a 4°C (FONSECA,
2007) e, também, mantidas em ágar YPD (ágar
15 g/L, extrato de levedura, 10 g/L; peptona 20
g/L; glicose, 20 g/L) (STEFANELLO, 2010).
3.1.3 Análises micromorfológica e
macromorfológica
Para a análise micromorfológica, os
isolados foram crescidos e plaqueados por
esgotamento através do estriamento das colônias
em meio YPD a 30°C por 24 horas e em seguida
submetidos à visualização em microscópico
óptico com aumento de 1000 x, onde foram
analisadas suas características externas, como o
formato, a presença de brotamentos e a
comparação do tamanho das células. Para a
análise macromorfológica, os isolados foram
plaqueados por esgotamento em ágar YPD,
incubados a 30°C por 72 h e posteriormente
realizada a análise das colônias, considerando-se
os parâmetros, pigmentação, borda e textura.
3.1.4 Extração de DNA genômico
O protocolo para extração de DNA foi
adaptado de ESTEVE-ZARZOSO (2016).
Quatro colônias de leveduras crescidas em ágar
YPD a 30°C por 24 h, foram transferidas para um
microtubo adicionado 2000 μL de tampão fosfato
salina (PBS) gelado e centrifugado por 6 min. a
13.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e a
amostra ressuspendida em 200 μL de PBS, 50 μL
de Proteinase K (20 mg mL-1) e incubado a 65°C
por 15 min. Os tubos foram removidos e
acrescidos de 200 μL de dodecil sulfato de sódio
(SDS) 20%, homogeneizados e incubados a 65°C
por 6 min. Aos tubos foram adicionados 800 μL
de clorofórmio, sendo então agitados por 30
segundos no vórtex, adicionados de 400 μL da
solução de precipitação proteica (acetato de
potássio 5M, ácido acético glacial) e
centrifugados por 10 min. A fase aquosa foi
transferida para um novo microtubo e adicionada
de 1 mL de etanol absoluto gelado, centrifugada
e o sobrenadante descartado. O pellet foi lavado
com etanol 70% gelado e centrifugado por 2 min.
Após a evaporação do etanol, os precipitados
foram eluídos em 100 μL de água ultrapura,
incubados a 65°C por 5 min. e estocados a -20ºC.
3.1.5 Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR)
O DNA extraído das leveduras foi
utilizado para amplificação por PCR, utilizando-
se os oligonucleotídeos ITS1 (5´
TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3´) e ITS4
(5´TCCTCCGCTTATTGATATGC 3´) que
amplificam zonas variáveis e intergênicas do
gene 5.8S do DNA ribossomal (DNAr) (WHITE
et al., 1990). As reações de amplificação foram
conduzidas em um termociclador MyCyclertm
Thermal Cycler 170-9701 (Biorad). A PCR foi
realizada com volume final de 50 μL contendo
0,5 U de Taq DNA polimerase, 0,5 μM de cada
oligonucleotídeo, 10 mM de DNTP, 5 μL de
tampão magnésio de reação diluído em 10 x, 1,5
mM MgCl2 e 10 ng de DNA genômico (Sigma).
As condições de ciclagem foram: desnaturação
inicial de 95°C por 3 min., seguido pela
desnaturação a 95°C por 1 min., anelamento a
52°C por 45 s, extensão a 72°C por 1 min com 35
ciclos, seguido de uma extensão final a 72°C por
7 min. Os produtos amplificados foram
separados por eletroforese em gel de agarose 1%
em tampão Tris-borato EDTA (TBE), corado
com brometo de etídio (Sigma). Foi utilizado o
marcador molecular de 100 bp DNA Ladder
(Promega®).
3.1.6 Capacidade de assimilação e
fermentação de maltose
As leveduras isoladas foram submetidas à
análise de capacidade de assimilar e/ou fermentar
maltose. De acordo com o método, uma alçada
de células de cada levedura estudada foi
inoculada em tubo de ensaio contendo 10 mL do
caldo YPD e incubada por 24 horas a 12o
C e
25°C. A seguir, 0,1 mL foi retirado e inoculado
em um tubo de ensaio, com 10 mL da seguinte
solução basal em pH 5,0: 0,5% de (NH4)2SO4,
0,1% de NaH2PO4, 0,05% de MgSO4, 2% de
maltose, sendo esta solução esterilizada em
autoclave por 15 min a 121ºC. Em cada tubo de
ensaio foi imerso um tubo de Durham invertido
(ROSSI; ANDRIETTA, 2009). Foi considerado
resultado positivo para a fermentação, as
amostras que continham produção de gás, e
positivo para a assimilação a presença de
turbidez. Os testes foram realizados em
duplicatas e as leituras realizadas a 12o
C e 25°C
em 24 horas. Uma linhagem de S. cerevisiae
comercial Fermentis S-04 foi utilizada como
padrão positivo. Um tubo com solução basal sem

8. a fonte de carbono e/ou nitrogênio foi utilizado
como padrão negativo.
Após a verificação dos resultados
positivos ou negativos para a fermentação de
maltose nos tubos, realizou-se um plaqueamento
direto do conteúdo dos tubos em placas de YPD
visando quantificar as linhagens de leveduras
após 24 horas sob diferentes temperaturas (12 e
25 o
C).
3.1.7 Testes EUROPEAN BREWERY
CONVENTION - EBC: Floculação,
Temperatura de fermentação, Atenuação
máxima do mosto cervejeiro, Tolerância
alcoólica.
Para a verificação da floculação,
temperatura de fermentação, atenuação e
tolerância alcoólica, utilizou-se os protocolos
oficiais do EUROPEAN BREWERY
CONVENTION. Analysis Committee. Analytica
– EBC. London: Elsevier, 1963. Method 8.5.
Revised Oct. 2005.
3.1.8 Preparação de cerveja artesanal
utilizando as leveduras caracterizadas
O processo para elaboração da cerveja
artesanal foi realizado de acordo com o método
tradicional de fabricação de cerveja artesanal tipo
Bock. Foram utilizadas as instalações do
Laboratório de Enologia da Universidade Rovira
i Virgili. Um volume de vinte litros de água
mineral com pH 6,2 foi aquecido a 50o
C e
colocado em um balde fermentador de
polietileno. Utilizou-se para os testes extrato de
malte líquido lupulado da marca Malta Finlândia
– Cerveza Artesana, nome comercial "La Rubia".
As características referenciais são: cor amarelo
palha (16 EBC), cristalina, médio amargor (16
IBU), acabamento seco e médio corpo, ABV 4%,
densidade final 1.006. Temperatura de
fermentação recomendada: 18-22 ºC.
Em seguida, foi realizado o resfriamento
do mosto em câmara fria até a temperatura de
20o
C. Assim que a temperatura desejada foi
atingida, realizou-se a inoculação da levedura a
ser testada para o processo de fermentação. A
levedura escolhida para os testes foi a linhagem
UFSBR1, já que a mesma apresentou os
melhores resultados em análises prévias e melhor
se adequava à produção de uma cerveja no estilo
Bock. A levedura foi adicionada ao mosto, no
qual foi promovida a aeração vigorosa por pelo
menos 8 minutos antes da inoculação do
fermento, com o intuito de chegar a faixa de 8 a
10 ppm (parte por milhão) de oxigênio dissolvido
no mosto. A válvula airlock foi adaptada na saída
superior do balde de fermentação; com
temperatura constante de 20o
C por 240 horas.
Para a retirada do fermento, foi realizada
uma nova trasfega para outro balde fermentador
e o mosto resfriado até 4°C, dando início ao
processo de maturação.
Para o engarrafamento, foi dosada uma
solução de 7 g de açúcar por litro de cerveja crua,
seguido da homogeneização e do arrolhamento.
Para que ocorra a carbonatação secundária, a
cerveja permaneceu por sete dias em temperatura
ambiente em local escuro (média de 20°C). A
cerveja não foi pasteurizada e também não foi
filtrada para o seu envase, como ocorre
usualmente com os produtos artesanais. Foi
desenvolvido um rótulo para a cerveja com as
informações básicas sobre o produto: lote de
fabricação, data de validade, teor alcoólico,
ingredientes, identificação do produtor e frases
de advertência de acordo com a legislação
espanhola.
O acompanhamento do processo de
fabricação foi realizado por meio de análises de
pH em pHmetro de bancada (Hanna – modelo pH
21), densidade e teor alcoólico por densímetro
Gay-Lussac.
3.1.9 Análise Sensorial
A prova sensorial das cervejas foi
conduzida com um painel de 45
cervejeiros/provadores de cerveja experientes e
não-experientes com idades compreendidas entre
os 27-62 anos, dentre professores e estudantes de
mestrado e doutorado em Enologia e Cerveja
Artesanal da Universidade Rovira i Virgili,
Campus Sescelades, Tarragona, Catalunha,
Espanha. Foram analisadas sensorialmente as
cervejas produzidas, a partir do extrato de malte
lupulado descrito acima, variando apenas o local
de produção – laboratório e planta industrial.
Foram servidos cerca de 100 mL de cerveja a
uma temperatura de 10ºC, e numa ordem de
degustação das cervejas (controle e fermentadas)
propositadamente aleatória, de modo a não
influenciar o provador. Os provadores avaliaram
cada cerveja com base no Manual do BJCP (Beer

9. Judge Certification Program) para o estilo Bock
verificando parâmetros básicos de aparência,
aroma, “flavour”, cor, amargor e drinkability.
RESULTADOS
As estirpes de leveduras cervejeiras
clássicas são fungos unicelulares ascomicetos
pertencentes ao género Saccharomyces (Briggs
et al., 2004). O complexo de espécies sensu
stricto do gênero Saccharomyces inclui as
estirpes de leveduras mais relevantes para a
indústria das fermentações (Rainieri et al., 2003).
A utilização (quase) exclusiva de estirpes
Saccharomyces em fermentações controladas ao
longo da história pode ser fundamentada por três
características fenotípicas que este género exibe:
produção eficiente de elevadas quantidades de
etanol; utilização da fermentação como via
metabólica preferencial, combinada com efeito
Crabtree positivo; e elevada tolerância a etanol
e/ou stresses abióticos (Basso et al., 2016).
Em relação aos resultados das linhagens
estudadas temos:
4.1 Caracterização em nível molecular
as leveduras em estudo (perfil de fragmentos
amplificados do DNA ribossomal – rDNA e
fingerprinting baseado nas sequências Delta
repetitivas (SCHÜLLER, et al., 2004;
AGUSTINI, 2014).
Figura 2. Perfil de fragmentos amplificados do DNA
ribossomal – rDNA, em duplicata. Canaletas 2 e 3 –
UFSBR01, 4 e 5 – UFSBR02, 6 e 7 UFSBR03. Canaletas
1 e 9 – Marcador de Peso Molecular Invitrogen™
TrackIt™ 100 bp DNA Ladder 100 applications. Gel de
agarose 1% corado com brometo de etídeo do produto
amplificado por PCR.
Figura 3. Perfil de fragmentos amplificados do
fingerprinting baseado nas sequências Delta repetitivas, em
duplicata. Canaletas 2 e 3 – UFSBR01, 4 e 6 – UFSBR02,
7 e 8 UFSBR03. Canaletas 1 e 10 – Marcador de Peso
Molecular Invitrogen™ TrackIt™ 100 bp DNA Ladder
100 applications. Gel de agarose 1% corado com brometo
de etídeo do produto amplificado por PCR.
4.2 Capacidade de assimilação e
fermentação de maltose
As leveduras isoladas foram submetidas à
análise de capacidade de assimilar e/ou fermentar
maltose.
De acordo com o método, uma alçada de
células de cada levedura estudada foi inoculada
em tubo de ensaio contendo 10 mL do caldo YPD
e incubada por 24 horas a 12o
C e 25°C. A seguir,
0,1 mL foi retirado e inoculado em um tubo de
ensaio, com 10 mL da seguinte solução basal em
pH 5,0: 0,5% de (NH4)2SO4, 0,1% de NaH2PO4,
0,05% de MgSO4, 2% de maltose, sendo esta
solução esterilizada em autoclave por 15 min a
121ºC. Em cada tubo de ensaio foi imerso um
tubo de Durham invertido (ROSSI;
ANDRIETTA, 2009).
Uma linhagem de S. cerevisiae comercial
Fermentis S-04 foi utilizada como padrão
positivo. Um tubo com solução basal sem a fonte
de carbono e/ou nitrogênio foi utilizado como
padrão negativo.
Todos os testes foram considerados como
resultados positivos para a fermentação em meio
contendo maltose. As amostras apresentaram
produção de gás e presença de turbidez.
Os testes foram realizados em duplicatas
e as leituras realizadas a 12 e 25°C em 24 horas
após a inoculação dos tubos testes.
Após a verificação dos resultados
positivos ou negativos para a fermentação de
maltose nos tubos, realizou-se um plaqueamento

10. direto do conteúdo dos tubos em placas de YPD
visando quantificar as linhagens de leveduras
após 24 horas sob diferentes temperaturas (12 e
25o
C).
Gráfico 1. Níveis populacionais das linhagens de
leveduras brasileiras cultivadas em maltose à 12o
C.
Gráfico 2. Níveis populacionais das linhagens de
leveduras brasileiras cultivadas em maltose à 25o
C.
4.3 Testes EUROPEAN BREWERY
CONVENTION - EBC: Floculação,
Temperatura de fermentação, Atenuação
máxima do mosto cervejeiro, Tolerância
alcoólica.
Segue abaixo os resultados encontrados
para as três linhagens estudadas de acordo com
os protocolos oficiais do EUROPEAN
BREWERY CONVENTION. Analysis
Committee. Analytica – EBC. London: Elsevier,
1963. Method 8.5. Revised Oct. 2005.
- LINHAGEM UFSBR01:
Origem: Caju, fruto tropical comum em biomas
de Mata Atlântica e Cerrado na região nordeste
do Brasil
Floculação/Sedimentação: Baixa/Média
Temperatura de Fermentação: 16 a 20 o
C
Atenuação Máxima: 70 - 80%
Tolerância ao Álcool: Média (até 9,5%)
Estilos de Cervejas Indicados Para Produção:
Escola Belga.
Características: cerveja com caráter frutado ou
esterificado.
- LINHAGEM UFSBR02:
ORIGEM: Mangaba, fruto tropical comum em
biomas de Mata Atlântica na região nordeste do
Brasil
Floculação/Sedimentação: Alta/Alta
Temperatura de Fermentação: 18 a 22 o
C
Atenuação Máxima: 70 – 75%
Tolerância ao Álcool: Média (até 9,0%)
Estilos de Cervejas Indicados Para Produção:
Escola Inglesa e Americana.
Características: cerveja limpa, com sabor
“puxando” para o lúpulo ou o malte.
- LINHAGEM UFSBR03:
Origem: Jabuticaba, fruto tropical comum na
vegetação do bioma Cerrado de Minas Gerais.
Floculação/Sedimentação: Média/Média
Temperatura de Fermentação: 18 a 23 o
C
Atenuação Máxima: 70 - 80%
Tolerância ao Álcool: Alta (até 11%)
Estilos de Cervejas Indicados Para Produção:
Escola Belga.
Características: cerveja com caráter frutado ou
esterificação.
4.4 Preparação de cerveja artesanal
utilizando as leveduras caracterizadas
O processo para elaboração da cerveja
artesanal foi realizado de acordo com o método
tradicional de fabricação de cerveja artesanal tipo
Bock. Foram utilizadas as instalações do
Laboratório de Enologia da Universidade Rovira
i Virgili.
No Gráfico 3 abaixo, está apresentado o
acompanhamento das análises de pH, densidade
e atenuação de extrato durante os dez dias de fase
de fermentação. O pH inicial, com o valor de 5,42
está de acordo com o recomendado na literatura
para este estilo de cerveja (MORADO, 2009).
Sua redução até o valor de 4,70 se deve as
reações bioquímicas decorrentes do processo de
fermentação. Segundo Borzani et al (1983), a
redução do valor de pH está correlacionada a
formação de ácidos orgânicos, como o ácido
acético, ácido succínico e lático. Esse valor está
atendendo o parâmetro para a bebida (ANVISA,
1994).

11. O valor de 9,30 °Brix indica a
concentração de açúcares disponíveis na solução
do mosto para o fermento realizar as devidas
conversões em álcool, calor e dióxido de carbono
até consumir todo o substrato dito
fermentescível. Conforme avança o tempo de
fermentação é natural que ocorra a queda no
valor de extrato (MORADO, 2009).
A densidade inicial é um importante
parâmetro para se estimar o valor de álcool que
será atingido no produto final, conforme cálculo
específico (SILVA, 2016).
Gráfico 3. Escala de pH, Brix e densidade ao longo dos
dias de fermentação.
Seguem abaixo as fotos do processo de
produção em nível laboratorial (Figura 4):
Figura 4. Fotografias dos trabalhos realizados na Universidade Rovira i Virgili nos experimentos de elaboração de cerveja
artesanal em nível laboratorial com as leveduras isoladas no Brasil.
4.5 Análise Sensorial
A Figura 5 ilustra a cerveja da maneira
como foi apresentada para o teste sensorial aos
julgadores, num volume aproximado de 100 mL
em taça de cristal a temperatura de 5°C nas
dependências do laboratório de análise sensorial
da Universidade Rovira i Virgili, Campus
Sescelades, Tarragona, Espanha, em cabines
individuais, sob luz branca.

12. Figura 5. Fotografia da cerveja produzida artesanalmente
da maneira como foi apresentada para o teste sensorial aos
julgadores.
A distribuição dos provadores por gênero,
na qual se verifica a maior participação do sexo
feminino (53%) contra 47% do masculino.
Com relação à pergunta contida no
formulário de triagem se o candidato se considera
um conhecedor de cerveja, o índice da resposta
positiva foi de 69%.
Em relação à prioridade para a escolha do
produto a ser consumido, quanto à qualidade ou
quantidade, a grande maioria dos participantes se
declarou preocupado com a qualidade,
apresentando o índice de 86%.
A pergunta que caracterizou o intervalo
de tempo de consumo de cerveja por parte do
provador resultou em um índice de zero % nos
dois extremos: o não consumo de cerveja e
consumo diário do produto. O índice de 7% entre
os participantes registrou o consumo poucas
vezes ao ano. A escala intermediária foi a que
apresentou o maior acúmulo de indicações, sendo
34% para o consumo de poucas vezes ao mês e
48% para o consumo de ao menos uma vez por
semana. O índice de 11% foi registrado para a
frequência do consumo de mais de uma vez por
semana.
As médias das notas obtidas na análise
sensorial da cerveja estão apresentadas no
Gráfico 4. A nota média para aceitação global foi
de 8,1; o que significa que a equipe classificou
sensorialmente as cervejas entre “gostei muito” a
“gostei muitíssimo”.
Gráfico 4. Médias das notas obtidas na análise sensorial da cerveja.
A hipótese proposta foi de que a cerveja
produzida com levedura brasileira apresentaria
um índice de aceitabilidade acima de 70%. Os
resultados indicaram os valores de Índice de
Aceitabilidade do produto (IA) para cor acima de
90%, sabor acima de 90%, aroma acima de 90%,
amargor acima de 80%, aparência acima de 90%
e aceitação global de acima de 90%. Faz-se
importante ressaltar que a equipe de
degustadores foi composta por um grupo de
pessoas não treinadas, apesar de que cerca de
metade dessa população considerou-se
conhecedora de cerveja. A cerveja produzida
com levedura brasileira apresentou de um modo
geral, boa aceitação sensorial de aspectos visuais
como cor e aparência, além do sabor e aroma. No
entanto, a sensação de amargor resultou em um
menor índice de aceitabilidade (próximo de 80%)
comparada aos outros atributos. A média dos
valores para esse atributo, nesse experimento
(Gráfico 3) foi de 7,13.
No Gráfico 5, pode ser observada a
distribuição dos conceitos atribuídos na escala
hedônica para cada atributo. A aparência e a cor
apresentaram maior frequência para “Gostei
muitíssimo”. Apenas o atributo amargor foi
mencionado com notas na faixa negativa da
escala hedônica.
Gráfico 5. Distribuição dos conceitos atribuídos na escala hedônica para cada atributo.

13. Por meio da análise físico-química, a
cerveja produzida neste trabalho foi classificada
como cerveja clara, uma característica relevante.
A utilização da linhagem brasileira UFSBR01
parece ter sido o mais impactante no sabor e
aroma, uma vez que esse é justamente o forte
diferencial do produto elaborado, quando
comparada com outra cerveja produzida
artesanalmente com uma levedura comercial
conhecida.
O amargor recebeu a nota mais baixa
dentre todos os atributos avaliados. A aparência
é o primeiro contato que o degustador tem com o
produto, logo quando olha para a taça, antes
mesmo de levar o líquido até a boca. O motivo
pelo qual os provadores atribuíram notas acima
de 90% para o atributo aparência pode ser devido
à similaridade da cerveja produzida ao padrão de
referência que existe em suas mentes, ou seja, as
cervejas industriais do tipo Bock.
Quanto ao resultado da intenção de
compra, a grande maioria dos provadores indicou
que provavelmente compraria (44%) ou
certamente compraria (37%). Quase todos os
quarenta e cinco provadores envolvidos no
certame expressaram a intenção em adquirir o
produto e ninguém expressou que certamente não
compraria o produto.
CONCLUSÕES
Embora todas as linhagens de
Saccharomyces cerevisiae façam basicamente o
mesmo trabalho de transformar carboidratos em
etanol e gás carbônico, o sabor do produto obtido
difere de uma linhagem para outra, em função de
pequenas diferenças bioquímicas de
metabolismo e consequente formação de
substâncias capazes de conferir aroma e sabor,
mesmo estando presentes em quantidades muito
pequenas.
Assim, pode-se concluir que o amplo
espectro de conhecimentos derivados do uso de
leveduras, não só como sistemas bioquímicos e
genéticos, estabelecendo as regras da ciência da
hereditariedade, mas também os estudos
clássicos sobre as leveduras e as fermentações,
contribuíram e contribuem para a consolidação
da biotecnologia como um todo. Esta integração
da biotecnologia “velha” e moderna estabelece
parâmetros desafiadores e aplicáveis do
conhecimento das leveduras na busca da
melhoria do processo fermentativo cervejeiro.
As leveduras selecionadas apresentaram
capacidade de fermentação de glicose, sacarose
e, principalmente a maltose; boa tolerância a no
mínimo 5% de etanol e densidade normal do
mosto. Os testes de floculação e crescimento em
diferentes temperaturas auxiliam no
enquadramento do estilo mais adequado para
cada levedura, porém mais estudos são
necessários para avaliar o perfil aromático,
molecular e o produto final.

14. A obtenção de linhagens com fenótipos
desejáveis para a produção de cerveja contribuirá
para o desenvolvimento científico e tecnológico
do setor, oferecendo um produto biotecnológico
nacional como alternativa ao fermento importado
e conferindo mais independência e autonomia ao
mercado cervejeiro brasileiro.
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Universidade Federal de Sergipe - UFS.
E-mail: flaviobarbosaufs@gmail.com
2- Biólogo. Doutor em Microbiologia. Técnico
de Nível Superior do Departamento de
Bioquímica e Biotecnologia – Universidade
Rovira i Virgili, Tarragona, Catalunha, Espanha.
3- Doutor em Bioquímica e Metabolismo.
Professor Titular do Departamento de
Bioquímica e Biotecnologia – Universidade
Rovira i Virgili, Tarragona, Catalunha, Espanha.
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