O documento descreve uma pesquisa que investigou se o óleo essencial de melaleuca (CMA) tem efeito antiviral contra o vírus da gripe. Os resultados mostraram que: 1) O CMA não é citotóxico em baixas concentrações; 2) O CMA inibe a entrada do vírus da gripe em células hospedeiras, mas não sua replicação dentro das células; 3) Simulações de dinâmica molecular sugerem que o CMA interage com a proteína hemaglutinina viral, impedindo a ligação

1. [Tea Tree 009]
Óleo Essencial: Melaleuca alternifolia
Composto: terpinen-4-ol, γ-terpineno e α-terpineno
Título: Melaleuca alternifolia concentrate inhibits in vitro entry of influenza virus into
host cells.
"O concentrado de Melaleuca alternifolia inibe a entrada in vitro do vírus da influenza
nas células hospedeiras".
Autor: Xinghua Li, Songwei Duan, Cordia Chu, Jun Xu, Gucheng Zeng, Alfred King-Yin
Lam, Junmei Zhou, Yue Yin, Danyun Fang, Maxwell John Reynolds, Huaiyu Gu and
Lifang Jiang
Journal: Molecules
Vol/Issue: 18
Ano: 2013
DOI: 0.3390/molecules18089550
TAGs: tea tree; melaleuca; Melaleuca alternifolia; influenza vírus; terpinen-4-ol; γ-
terpineno; α-terpineno; gripe; H1N1; in vitro; infecção; vírus; anti-inflamatório; atividade
virucida; baixa citotoxicidade; inflamação; doença infecciosa; anti-influenza;
imunomodulador; atividade virucida; sistema imunológico; in silico; hemaglutinina viral;
membrana viral; viabilidade celular; efeito citotóxico; replicação do vírus; célula
hospedeira; ensaio de imunofluorescência;
Sobre o artigo:
A gripe é uma doença infecciosa causada pelo vírus influenza, que se espalha pelo
mundo causando epidemias sazonais, com uma estimativa de três a cinco milhões de
casos de doenças graves e 250.000 a 500.000 mortes por ano.

2. Portanto, medicamentos e vacinas contra a infecção pelo vírus H1N1 são
urgentemente necessários. No entanto, o vírus normalmente desenvolve resistência
aos medicamentos anti-influenza disponíveis no mercado devido às mutações dos seus
genótipos.
Por outro lado, embora as vacinas contra as infecções virais sejam desenvolvidas e
usadas na prática clínica, a segurança biológica continua sendo uma das principais
preocupações públicas na maioria dos países, assim como mortes e efeitos colaterais
graves.
Estudos anteriores relatam que os extratos de ervas têm um papel importante no
controle de infecções virais, servindo como imunomoduladores, ou bloqueando a
interação do vírus com as células-alvo, ou tendo atividade virucida por meio da
interação direta com o vírus; até mesmo a redução de contaminação por eficiência no
sistema imunológico.
O concentrado de Melaleuca alternifolia (CMA) é um óleo essencial derivado das folhas
ou ramos terminais do Tea Tree, uma árvore nativa australiana, considerada uma
mistura heterogênea de aproximadamente 100 componentes quimicamente definidos,
contendo principalmente: terpinen-4-ol (58%), γ-terpineno (20%) e α-terpineno (10%).
A capacidade do CMA de induzir efeito anti-inflamatório e inibir a infecção de várias
espécies microbianas, como bactérias, vírus e fungos, faz com que candidato
promissor ao desenvolvimento de terapêutica contra a infecção pelo vírus H1N1.
Portanto, o objetivo desse estudo foi investigar se o CMA tem algum efeito inibitório in
vitro na infecção pelo vírus influenza e qual mecanismo o CMA usa para combater a
infecção pelo vírus.
Neste estudo, a atividade antiviral do CMA foi examinada por sua inibição dos efeitos
citopáticos, qualquer mudança detectável na célula hospedeira devido à infecção.

3. A previsão in silico (simulação computacional em áreas correlatas) foi realizada para
avaliar a interação entre CMA e a hemaglutinina viral, uma molécula importante da
membrana viral presente na superfície das partículas do vírus influenza.
Como uma etapa inicial para determinar o efeito virucida do CMA, primeiro é
necessário determinar se este tem algum efeito na viabilidade celular (ensaios
frequentemente usados para triar moléculas tóxicas ou que proporcionam proliferação
celular conduzindo-as à morte).
Portanto o ensaio de viabilidade celular contou com a participação de células MDCK,
modelos de linhas celulares de mamíferos e com função para realização de testes
biológicos, que foram cocultivadas com CMA em várias concentrações por cerca de
72h.
Resultados:
1. Teste Citotóxico de CMA
Como uma etapa inicial para determinar o efeito antivírus do CMA, primeiro precisou-se
determinar se o CMA tem algum efeito na viabilidade celular. Para isso, as células
MDCK (modelo de linhagem de mamíferos) foram cocultivadas em várias
concentrações de CMA por cerca de 72 h.
A viabilidade celular do CMA foi determinada por um ensaio MTT, que é um ensaio
colorimétrico para avaliar a viabilidade das células.
Os pesquisadores observaram que embora o CMA em concentração superior a 0,05%
possa induzir morte celular significativa, ele não teve nenhum efeito citotóxico nas
células MDCK quando a concentração foi inferior a 0,025%.

4. Esses dados sugerem que o CMA em concentrações adequadas não tem qualquer
citotoxicidade e, uma vez que o CMA em concentrações inferiores a 0,025% não teve
nenhum efeito citotóxico nas células MDCK, os pesquisadores escolheram uma
concentração de 0,02% como concentração máxima do estudo para determinar os
melhores efeitos antivirais do CMA.
2. Ensaio de efeito antiviral de CMA in vitro
Para determinar o efeito antiviral do CMA, primeiro os cientistas se perguntaram se o
CMA poderia conferir às células capacidade de proteção contra o vírus da influenza.
Para responder a esta pergunta, as células MDCK foram tratadas primeiro com 0,02%
CMA por 1, 2 e 4 h, respectivamente.
Portanto, nenhum aumento significativo da viabilidade celular de células MDCK foi
observado quando as células MDCK foram pré-tratadas com CMA por uma hora, duas
horas e quatro horas (A1, A2 e A3), respectivamente – em comparação com o controle
de vírus e significativamente inferior ao controle de células e o controle da ribavirina
(ribo).
Vale a pena notar que a sobrevivência celular nas condições A1, A2 e A3 permaneceu
a mesma. Ou seja, não houve tendência de aumento da sobrevivência celular com o
prolongamento do tempo de tratamento com CMA. Esses dados, portanto, indicaram
que o pré-tratamento de células MDCK com CMA não poderia conferir qualquer
proteção de viabilidade celular.
Como o pré-tratamento com CMA não poderia fazer as células MDCK produzirem
quaisquer mudanças para proteção contra a infecção do vírus influenza, os
pesquisadores examinaram então se o tratamento do vírus, mas não das células
MDCK com CMA, poderia conferir qualquer proteção de viabilidade celular.

5. Para determinar isso, o vírus H1N1 foi primeiro tratado com CMA em uma
concentração de 0,01% por 0,5 e 1 h, respectivamente. As misturas foram adicionadas
a uma monocamada de células MDCK e, em seguida, lavadas após 1 h de incubação
inicial e substituídas por meio de manutenção contendo TPCK-tripsina (1 μg/mL).
Embora a infectividade do vírus influenza tratado com CMA por 0,5 h ainda tenha
permanecido, o vírus tratado com CMA por 1 h apresentou infecção pobre das células
hospedeiras.
Portanto, esses dados indicaram que o vírus da gripe tratado com CMA perderia
dramaticamente sua capacidade infecciosa para as células hospedeiras.
Posteriormente, o efeito do CMA no vírus da gripe que entrou nas células MDCK foi
investigado. O vírus da gripe foi inoculado em uma monocamada de células MDCK
durante 1 h para fazer o vírus entrar nas células hospedeiras.
O CMA não pode induzir qualquer aumento apreciável da viabilidade celular da célula
MDCK em comparação com o controle de vírus. Isso indicou que o CMA não poderia
prevenir a replicação do vírus influenza e a biossíntese na célula hospedeira. A nova
geração de vírus produzida na célula hospedeira pode completar o ciclo de vida e
exportar da célula hospedeira.
Para observar a proliferação do vírus influenza na célula hospedeira intuitivamente, um
ensaio de imunofluorescência foi realizado. Os vírus influenza foram tratados com CMA
a uma concentração final de 0,01% por 0,5 e 1 h, respectivamente, e um controle de
vírus e um controle de célula foram estabelecidos.
O anticorpo primário e o anticorpo secundário marcado com fluorocromo produziram
padrões de coloração de citoplasma em células MDCK infectadas pelo vírus influenza
tratados com CMA por 0,5 h e o vírus sem tratamento, enquanto apenas a coloração

6. nuclear robusta foi detectada por DAPI em células MDCK infectadas pelo vírus
influenza tratado com CMA por 1 h e o controle celular (Figura 3).
Figura 3: O tratamento com CMA evita que o vírus influenza entre na célula hospedeira.
0,010% de CMA na incubação da suspensão de vírus por 0,5 h e 1 h, o vírus da gripe não
tratado foi inoculado respectivamente em uma monocamada de células MDCK em uma placa
de 96 poços por 5 h, ao mesmo tempo momento em que um controle de célula foi configurado.
O vírus foi corado intracelularmente com anticorpo Influenza A M1 e Alexa Fluor ® 488 Goat
Anti-Mouse IgG.
Os gráficos de dupla coloração por imunofluorescência indicaram que a localização do
vírus estava no citoplasma. Observe que na segunda linha da esquerda, que mostrou o
vírus tratado com CMA por 1 h, não houve imunofluorescência verde. Isso serviu como
controle negativo e em contraste com o controle do vírus mostrando
imunofluorescência verde.
Além disso, a integridade da partícula do vírus após a incubação com CMA foi
visualizada por microscopia eletrônica. Não importa se o vírus da gripe foi tratado com

7. CMA ou não, numerosas partículas inteiras de vírus podiam ser facilmente visualizadas
nas imagens.
Além disso, nenhuma mudança na estrutura geral do vírion pode ser observada (Figura
4).
Figura 4: O papel do MAC na destruição da integridade estrutural do vírion. O vírus influenza foi
tratado com CMA de 0,01% de concentração final por 1 h (esquerda) e o controle do vírus
(direita) foi instalado. Numerosos vírions intactos podem ser facilmente visualizados com
densidade próxima de vírions em ambos os grupos. As imagens mostradas aqui são vistas
representativas de 10 réplicas.
Este resultado demonstrou que o CMA não conseguiu lisar o vírion.
3. Estudos de Modelagem Molecular e Simulação de Dinâmica Molecular
Dado o resultado de que o CMA pode inibir a infecção do vírus H1N1 quando o CMA foi
aplicado antes de o vírus entrar nas células MDCK, mas não conseguiu evitar a
replicação e biossíntese do vírus na célula hospedeira, o CMA parece inibir a entrada
do vírus da gripe na célula hospedeira.

8. Isso envolve duas etapas principais: a primeira é a fixação do vírus à superfície celular
através do local do receptor na proteína hemaglutinina (HA) – que é uma glicoproteína,
que tem como principal função ligar o vírus ao receptor da célula hospedeira.
E, em seguida, a internalização nos endossomos; a próxima etapa envolve a fusão
entre o envelope viral e a membrana endossomal – mediada pela alteração
conformacional da proteína HA, desencadeando o desencapsulamento.
Os nucleocapsídeos virais são então liberados no citoplasma celular para transcrição e
tradução. Uma vez que as duas etapas são mediadas por HA, a atividade observada
aqui pode ser explicada pelo fato de que o CMA pode impedir que o vírus influenza ou
o genoma viral entrem nas células hospedeiras por meio da interação com a proteína
hemaglutinina viral.
Para verificar se a explicação era viável, a interação entre o CMA e a hemaglutinina
viral foi avaliada por meio da dinâmica molecular (DM).
O CMA foi quimicamente definido e foi demonstrado que sua atividade antimicrobiana
pode ser atribuída principalmente ao terpinen-4-ol, o principal componente ativo. Na
verdade, o terpinen-4-ol é o principal componente antimicrobiano bioativo de óleos
essenciais derivados de várias plantas aromáticas.
Por conta disso, a interação de terpinen-4-ol e a proteína hemaglutinina do vírus
influenza foi prevista in silico para confirmar o alvo exato e suas características ativas.
A partir das análises de docking, o terpinen-4-ol foi sugerido para se ligar a uma
cavidade perto do peptídeo de fusão (Figura 5).

9. Figura 5 A e B: As estruturas do complexo obtidas a partir de cálculos de encaixe. (B) RMSDs
do complexo terpinen-4-ol-HA em comparação com suas conformações originais em função do
tempo.
A Figura 5A representa a estrutura inicial de terpinen-4-ol-HA nas simulações de MD.
É importante obter uma trajetória de DM estável para análise subsequente. Portanto,
os valores de desvio quadrático médio (RMSD) foram usados para medir a estabilidade
conformacional do complexo terpinen-4-ol-HA durante as simulações MD.
A partir das curvas RMSD em Figura 5B, sugere-se que os complexos terpinen-4-ol-HA
obtidos a partir de simulações de MD são relativamente estáveis. Existem três RMSDs
repetidos do complexo durante a simulação MD e todos eles estão abaixo de 0,3 nm e
as variações estão dentro de 0,1 nm.
Em resumo, a simulação MD foi aplicada para esclarecer a estrutura tridimensional do
terpinen-4-ol ligado ao sítio ativo. A simulação MD revelou uma conformação ideal do
complexo terpinen-4-ol-HA, no qual o inibidor forma duas ligações H estáveis com os
resíduos I-56 e N-60 de HA2 no bolso de ligação.
Além disso, a simulação MD mostrou que este modo de ligação pode estabilizar a
conformação de pH neutro do HA. Portanto, os pesquisadores acreditam que esta
propriedade seja importante para a atividade antiviral do terpinen-4-ol.

10. Compreender como HA estabilizado com terpinen-4-ol pode fornecer uma pista para o
desenvolvimento de novos inibidores de fusão da gripe. Os insights estruturais e
mecanísticos do presente estudo fornecem uma base valiosa para o projeto baseado
na estrutura de inibidores de fusão mais potentes da gripe.
Na prática:
Comprovou-se que um extrato de ervas, oriundo de Tea Tree, tem efeito significativo
contra a infecção pelo vírus influenza impedindo-o de penetrar nas células hospedeiras
e perturbando seu procedimento padrão de invasão. Também, mesmo após ter
penetrado, o OE demonstrou tornar os vírus inoperantes após a lise da célula
hospedeira, mostrando forte ação virucida intra e extracelular.
A principal possível causa de sua atividade virucida é devido ao composto bioativo
terpinen-4-ol, responsável por prejudicar a infecção viral ligando-se à principal molécula
da estrutura na superfície do vírus.
Que tal inalar 1 gotas do OE para garantir melhora na imunidade contra o vírus da gripe
ou recomendar o uso de 2-3 gotas associadas a cítricos para manter o ambiente livre
de possíveis viroses?