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Conclusões

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Proposição de uma Nova Vacina para Brucelose Bovina Usando uma Abordagem Biotecnológica

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Proposição de uma Nova Vacina para Brucelose Bovina Usando uma Abordagem Biotecnológica

  1. 1. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Campus Araraquara Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Fármacos e Medicamentos - Laboratório de Biotecnologia Proposição de uma Nova Vacina para Brucelose Bovina Usando uma Abordagem Biotecnológica Denise Medeiros Selegato Profa. Dra. Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro
  2. 2. Revisão Bibliográfica Sobre a Vacinação Contra Brucelose Bovina Introdução Sumário Objetivos Conclusões Proposição de um Processo Biotecnológico para a Produção de Proteínas Imunogênicas
  3. 3. Introdução Mercado bovino:  1° lugar em exportação de carnes (bovinos, suínos e frangos);  Maior rebanho do mundo comercialmente: desenvolvimento e lucratividade na produção de carne e leite. Mercado veterinário:  Bovinos representam maior porcentagem de participação e a maior lucratividade/espécie na produção de insumos na indústria de produtos veterinários;  3° maior no mercado de produtos veterinários mundial;  Mercado de vacinas:  Mais de 50% do mercado veterinário é voltado para produtos biológicos e antimicrobianos;  Produção de imunobiológicos representa 30% do lucro total das indústrias. GOVERNO BRASILEIRO (2010), IBGE (2011), SINDAN (2012).
  4. 4. Objetivos Propor um processo biotecnológico otimizado de produção de ativos purificados para serem usados em uma vacina contra brucelose bovina. Vacina possua eficácia e segurança superiores às encontradas atualmente no mercado.
  5. 5. Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina Brucelose Bovina  Antropozoonose de distribuição universal e fácil contágio.  Causada pela infecção de Brucella abortus nas células do sistema mononuclear fagocitário (macrófagos).  Bactéria dissemina-se pelos órgãos mais irrigados dos animais (fígado, baço e linfonodos) e no sistema reprodutor feminino, por tropismo. Principais Manifestações:  Aborto (1° gestação), esterilidade, retenção de placenta, baixa produção de leite e natimortalidade de bezerros;  Orquite uni ou bilateral. Lawinsky et al (2010), University of Georgia (2002).
  6. 6. Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina Brucelose Bovina  Alta incidência e prevalência. TRANSMISSÃO  Mundo: no Mediterrâneo, Oriente Médio, África e América.  Transmissão: mucosa oro-faríngeana e mãe-feto.  Mais infectante em animais púberes e vacas prenhas.  Brasil: casos vem diminuindo com programa de vacinação compulsória. Problemas Sanitários e Prejuízos Econômicos MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006).
  7. 7. Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina Brucella abortus  Parasita intracelular facultativo;  Cocobacilo gram-negativo, não capsulado e imóvel;  Dois cromossomos circulares e ausência de plasmídeos e fagos.  LPS: o Principal componente da membrana externa; o Cadeia O é a estrutura mais exposta da célula: • Mais imunogênica: induz produção de IgG2 e IgG3, principais isótopos na defesa imunológica contra a Brucella; • Principal componente para testes de triagem. MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006), Lawinsky et al (2010).
  8. 8. Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina Resposta Imunológica Resposta Imune Inata: o Estágio inicial da infecção; o Diminuir a concentração bacteriana do organismo. Resposta Imune Adaptativa (mediada por células): o É a mais eficaz no curso da infecção, pois produz anticorpos bloqueadores (específico para o antígeno O do LPS). MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006), Rivers et al (2006).
  9. 9. Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina Vacinas Atuais
  10. 10. Características B19 RB51 Animal Alvo Bovinos e Bubalinos Proteção Cerca de 60% contra infecção e 70% contra aborto Inocuidade - Pode provocar aborto em vacas prenhas. - Patogênica para bovinos machos e humanos. Restrição quanto ao Sexo Fêmeas Proteção Cruzada B. abortus B. abortus, B. melitensis, B. suis e B. ovis Cepa B. abortus cepa lisa 19 B. abortus RB51 cepa rugosa Interferências no Diagnóstico Sim Não Recomendação Observações Desvantagens - Uso recomendado em fêmeas com 3 a 8 meses de vida. Uso recomendado somente quando B19 é ineficaz ou - Proteção de até 7 anos após vacinação, segundo em vacas com mais de 8 meses de vida. fabricante. Vacina mais utilizada no Brasil (PNCEBT). Vacina mais utilizada nos Estados Unidos, México e países da América Latina. - Efetividade variável (depende de diversos fatores); - Interferir no diagnóstico tradicional; - Causar o aborto e orquite; - Restrita ao sexo feminino; - Ser possivelmente patogênica para humanos. - Difícil homogeneização devido a estirpe ser mucóide. - Possibilidade de inversão em cepa ativa; - Ser possivelmente patogênica para humanos; - Induzir o aborto e orquite; - Restrita ao sexo feminino. MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006), Lundblad et at (2010).
  11. 11. Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina Tendências – Vacinas Subcelulares Elimina as desvantagens presentes em vacinas de bactérias mortas ou atenuadas: Não existe o risco de infecção do manipulador; Mostram eficácia inferior as vacinas vivas atenuadas, necessitando de:  Maior número de aplicações; Não ocorre interferência no diagnóstico;  Fusão de duas proteínas imunodominantes; Não é restrita ao sexo feminino;  Uso de mediadores de entrega; Diminui as chances de orquite ou aborto.  Uso de adjuvantes imunogênicos. MAPA - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal (2006), Yang et at (2013).
  12. 12. Revisão bibliográfica sobre a vacinação contra a brucelose bovina Tendências – Vacinas DNA e RNA Vacinas DNA Uso de plasmídeo bacteriano com promotor viral forte. Características Vacinas RNA Uso de vírus Semliki Forest (SFV). Não ocorre expressão e purificação da proteína. Plasmídeo é fabricado sem Ori. Possuem partículas virais suicidas formadas por RNA autoreplicável. Mesmas vantagens que as vacinas subcelulares. Rivers et al (2006).
  13. 13. Proposição de um Processo Biotecnológico Processo de Upstream Processo de Downstream
  14. 14. Processo de Upstream Ribossomal L7/L12 o Induz importante resposta imune celular; o Gene rplL (cromossomo I): 375 pb. Pakzad et al (2009), Mallick et al (2009), Luo et al (2006). Identificação do Alvo Lumazina Sintetase o o o Induz importante resposta imune celular e humoral; Apresenta estabilidade termodinâmica e arranjo decamérico estável, facilitando sua manipulação no processo industrial; Gene ribH (cromossomo I): 474 pb. Velikovsky et al (2003), Zhao et al (2009). Escolha do Vetor de Clonagem o DNA dupla fita com 2686 pb. o Marcadores de seleção: ampR e lac Z inserido no MCS. Lundblad et al (2010).
  15. 15. E. coli o Amplo conhecimento de sua genética e fisiologia; Escolha do Sistema Vivo de Expressão o Facilidade do controle do crescimento e expressão gênica; o BL21 (DE3); o DH5; o M15. o Elevada multiplicação plasmidial. Velikovsky et al (2002), Mallick (2007 a), Mallick (2007 b), Velikovsky et al (2003), Zhao et al (2009), Luo et al (2006). Formação do Gene de Fusão Gene ribH 1. Amplificação dos gene ribH. 2. Amplificação do gene rplL com a remoção do códon de terminação; 3. Fusão dos genes das proteínas recombinantes; 4. Inserção do gene de fusão no vetor de clonagem. Sequência de Primer Enzima de Restrição FO 5’-GGATCCATCGAGTTTCTC-3’ BamHI RO-1 3’-GGGCCCCTAGTATCAGTT-5’ Xmal Gene rplL Sequência de Primer Enzima de Restrição FL RL-2 5’- AAGCTTATGGCTGATCTCG-3’ 3’-CCTAGGCTTGAGTTC-5’ HindIII BamHI Luo et al (2006), Zhao et al (2009), NCBI.
  16. 16. Formação de Células Competentes Transformação Seleção de Recombinantes Fermentação Extração do Gene de Fusão Tratamento com CaCl2. Choque térmico (mudança de temperatura de 37 para 42°C). Crescimento em meio de cultura com ampicilina. Crescimento em meio ágar contendo IPTG e x-gal. Crescimento em meio LB de 1-2 dias, à 37°C, com agitação. o Kits comerciais de extração de plasmídeos: agentes quelantes, detergentes, etc. o Liberação do gene de fusão por digestão com enzimas de restrição. Maranhão et al (2003), Nascimento (1999).
  17. 17. Escolha do Vetor de Expressão Transformação Seleção de Recombinantes o Meio LB com kanamicina; Eletroporação o Sequenciamento de clones; o Hibridização in situ. o Marcadores de seleção (gene kan); o Sistema de repressão de indução (gene lac); o Promotor T7; o Sequência de ligação do ribossomo (Shine Dalgarno); o Ori FL e Ori ColE1; MAPA (2003), Davidson College (2003).
  18. 18. Processo de Downstream Cultivo das Células Clarificação e Rompimento Celular Expressão da Proteína de Fusão Formação do Corpúsculo de Inclusão: alto grau de pureza, pouca contaminação e proteção física contra proteases. Purificação e Solubilização das Proteínas Recombinantes Fonte: Adaptado de Luo et al (2006). Caracterização das Proteínas Merck (2008).
  19. 19. Testes de Atividade Imunização Determinação de Ac Específicos Determinação da Proliferação de IFNgama Determinação da Produção de Citocinas Determinação da Proliferação de Linfócitos Fonte: Mallick et al (2007).
  20. 20. Conclusões ¡ ¡ ¡ Novas estratégias são necessárias para prevenir a brucelose bovina, bem como diminuir as desvantagens nas vacinas de bactéria atenuada atualmente comercializadas. Apesar das proteínas isoladas não conferirem uma imunização suficientemente forte para substituição das vacinas de bactérias atenuadas, novos métodos de entrega dos antígenos ganham destaque, como (a) utilização de vacinas de DNA; (b) vacinas de RNA; (c) vacinas com mais de uma proteína imunogênica; (d) ou o acoplamento de proteínas antigênicas a lipossomas e outros carregadores. A combinação da proteína ribossomal L7/L12 (forte indutora de resposta celular) com a lumazina sintetase (proteína estável com importante resposta celular e humoral) mostrase promissora no desenvolvimento de vacinas subcelulares, seja na sua forma livre, ou por sistema de entrega.
  21. 21. Agradecimentos

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