Aberrações cromossômicas e infertilidade

Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Instituto de Ciências Biológicas e Naturais (ICBN)
Disciplina de Citogenética
Professoras Roseane Lopes da Silva Grecco e Marly
Aparecida Spadotto Balarin
ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS E
INFERTILIDADE
Juliana de Morais Palmieri da Silva
&
Lais de Melo Valente
Curso de Biomedicina
Uberaba - MG
Novembro/2014

Alterações no cariótipo que podem gerar
infertilidade ou abortamento de repetição
Artigo Original

Introdução
ALTERAÇÕES NO CARIÓTIPO QUE PODEM GERAR
INFERTILIDADE OU ABORTAMENTO DE REPETIÇÃO
O que é
citogenética ?

“Era do Bandamento”
Introdução
Técnica que produz bandas horizontais com diferentes
intensidades de coloração.
O padrão de bandas é individualmente específico do
cromossomo e permitiu a identificação de cada cromossomo.
Tornou-se possível o reconhecimento de anormalidades
estruturais associadas a síndromes genéticas específicas.

 Investigação pré-natal de doenças genéticas
 Detecção de anormalidades cromossômicas em
indivíduos que apresentam alterações clínicas
indicativas de doenças genéticas
 Problemas de fertilidade e aborto habitual
Tumoral
Introdução
Para a realização do estudo citogenético

Fazer uma revisão da literatura
apresentando os aspectos importantes
e controversos da citogenética na
infertilidade.
Objetivo

Metodologia
Revisão bibliográfica a partir dos dados PubMed, Medline e
Ensembl;
 Foram utilizados os seguintes termos: infertilidade,
abortamento de repetição, heterocromatina e cromossomos;
Não existiu um critério relevante para o período em que as
buscas foram realizadas;
 Foram selecionados aqueles que possuíam um título e resumo
relevantes com o contexto do trabalho;
 Foram consultadas as diretrizes da Sociedade Americana de
Medicina Reprodutiva.

Metodologia
Heterocromatina
Heterocromatina constitutiva
Heterocromatina facultativa

Metodologia
Figura 1 – Ideograma dos cromossomos humanos pelo bandamento G.

Infertilidade
É a incapacidade de conseguir uma gravidez
dentro de um determinado período de tempo ou
a falha repetida de levar uma gravidez a termo
Primária
Secundária
Metodologia

Dentre as principais causas de infertilidade
o decréscimo na produção de espermatozoides,
a obstrução ductal;
a incapacidade de depositar o esperma na vagina,
o sêmen anormal;
fatores imunológicos.
Fatores femininos
(cerca de 50%)
a patologia das trompas de Falópio;
amenorreia e anovulação;
distúrbios ovulatórios menores;
fatores uterinos e cervicais;
fatores vaginais;
fatores imunológicos;
fatores metabólicos e nutricionais.
Idiopática ou desconhecida (em menos de 10%).
Metodologia
Fatores masculinos
(cerca de 40%)

Metodologia

Metodologia
Alterações cromossômicas em casais com
 50% translocações equilibradas;
 24% a translocações Robertsonianas;
 12% a mosaicismo de alterações nos cromossomos
sexuais
 E as demais consistiam em inversões e outras alterações
esporádicas.
abortamento habitual

Metodologia

Discussão
 Quando são examinadas grandes amostras de indivíduos da mesma
espécie, é comum observar a presença de variações nos blocos de
heterocromatina constitutiva. Essas variações são consideradas normais e
podem ser observadas em até 30% da população.
 A inversão pericêntrica da região de heterocromatina constitutiva do
cromossomo 9 é considerada uma variação da normalidade dentro da
população, uma vez que raramente produz alterações fenotípicas em seus
portadores.
 As inversões pericêntricas envolvendo o cromossomo 9 são as mais
frequentes, correspondendo a mais de 30% de todas as inversões
cromossômicas encontradas, sendo que apenas aquelas de grandes blocos
desse cromossomo poderiam apresentar efeitos patológicos como
infertilidade, abortos recorrentes e malformações congênitas.
 A inversão do cromossomo 1 corresponde a cerca de 5% das inversões
encontradas e a do cromossomo 16 a 0,5%, sendo esta última patológica
e encontrada em casos de leucemia mieloide aguda.

 A heterocromatina constitutiva apresenta o mais notável
heteromorfismo cromossômico devido a variações em seu
comprimento.
 Muitos estudos foram realizados com o intuito de relacionar essas
variações a alterações fenotípicas, ao surgimento de neoplasias, ao
aumento da incidência de aberrações cromossômicas, a malformações
congênitas e aos atrasos no desenvolvimento físico e mental,
produzindo informações contraditórias e mantendo o assunto sem uma
definição precisa.
 O mecanismo de origem da inversão do cromossomo 9 é altamente
complexo28. Sugere-se, então, que tal inversão teria efeito
intercromossômico, ocasionando uma alta incidência de erros mitóticos
e aneuploidias, como, por exemplo, a trissomia 21.
 Com a crescente busca de assistência médica para a identificação e
correção de problemas de fertilidade, muitos são submetidos ao exame
citogenético para a avaliação das alterações cromossômicas, e dados
sobre a relevância dos polimorfismos cromossômicos das regiões de
heterocromatina constitutiva, consideradas variações normais na
população, podem ser decisivos para a determinação causal da
Conclusão

Mosaicismo incomum de isodissomia uniparental
materna do cromossomo X com rearranjo
assimétrico do cromossomo Y

Conceitos Básicos
Isodissomia: é um dos dois tipos de dissomia (heterodissomia ou
isodissomia), na qual o par de cromossomos possui uma mesma
origem, ou seja, é herdado apenas de um dos pais. Na isodissomia ele
é originado de uma duplicação de apenas um dos cromossomos de um
dos pais;
Azoospermia: trata-se da ausência/não detecção de
espermatozoides no sêmen. Pode ser diagnosticada mediante a
realização de um espermograma;
Oligoastenoteratozoospermia: alteração de três variáveis no
sêmen:
 Teratospermia é a presença de menos de 4% de
espermatozoides com morfologia normal;
 Astenospermia é motilidade menor do que 50% de
espermatozoides progressivos;
 Oligospermia trata-se de baixa quantidade de
espermatozoides no sêmen.
MOSAICISMO INCOMUM DE ISODISSOMIA UNIPARENTAL MATERNA DO
CROMOSSOMO X COM REARRANJO ASSIMÉTRICO DO CROMOSSOMO Y

Objetivos do artigo
 Verificar o mosaicismo complexo de cromossomos sexuais;
 Sugerir hipóteses para explicar a ocorrência do cromossomo Y
derivativo e da geração de uma linhagem celular mosaica.
-OBS.: trata-se do primeiro estudo
confirmatório para verificar a
origem de um mosaicismo de
cromossomos sexuais (cromossomos
X isodissômicos), 46,XX e 45,X com
um cromossomo Y rearranjado.
http://hereditas.com..br

Introdução
 Causas genéticas de infertilidade masculina:
 Anormalidades cromossômicas em 6% dos casos;
 Microdeleções no cromossomo Y: responsáveis por falhas na
espermatogênese em 5 a 20% dos homens com azoospermia;
 Anomalias estruturais no cromossomo Y têm sido observadas
em 10 a 20% dos homens com infertilidade por azoospermia não
obstrutiva, sendo as mais comuns:
 Cromossomo Y isodicêntrico (Yidic);
 Isocromossomo Y (duplicações em Yp e deleções em Yq ou
vice-versa);
Homens inférteis com azoospermia comumente apresentam:
 Microdeleções associadas à região do fator de azoospermia
(AZF), localizado no cromossomo Y;
 Mosaicismo dos cromossomos sexuais;
 Rearranjo dos cromossomos sexuais;

 Mosaicismos dos cromossomos sexuais como 45,X, 47,XXY e/ou
46,XY são frequentemente observados em conjunto com anomalias do
cromossomo Y, podendo ser originados:
 Durante a meiose de bivalentes X-Y anormais;
 Ou como resultado de um erro pós-zigótico
- OBS.: o cromossomo Y é estruturalmente instável durante a
divisão celular;
 Assim, fenótipos clinicamente diferentes são observados como:
 Síndrome de Turner;
 Síndrome de Klinefelter;
 Genitália ambígua;
 Reversão sexual;
 Disgenesia gonadal mista;
 Insuficiência espermatogênica;
 Fenótipos masculino ou feminino normais.
Introdução

 Paciente do sexo masculino, de 35 anos de idade, 1,76 m de altura,
76 kg e IMC de 24,5 kg/m², com fenótipo e inteligência normais;
Avaliação hormonal:
 Níveis ⇧ de FSH e LH;
 Níveis séricos de testosterona e estradiol normais;
Avaliação andrológica:
 Volume testicular, em ambos os lados, reduzido para 10 mL
no TE e 12 mL no TD;
O mosaicismo descrito nesse estudo é incomum (mosaicismo
complexo de cromossomos sexuais) e envolve linhagens celulares
46,XX (isodissômica e predominante) e 45,X com um rearranjo raro
do cromossomo Y (duplicação-deleção assimétrica);
O cariótipo (“definitivo”) do paciente estudado foi 46,XX[50]/
45,X[25]/46,X,der(Y)(pter→q11.222::p11.2→pter)[25];
 O rearranjo raro gerou um cromossomo Y derivativo, com uma
deleção na região Yq11.222 e uma duplicação na região Yp11.2
Estudo do caso - paciente

Estudo do caso - paciente
 Cariótipo “inicial” do paciente: 46,XX [15]/ 45,X [3]/ 46,XY [12].
OBS.: o sexo fenotípico e o desenvolvimento sexual dos pacientes
com mosaicismo de cromossomos sexuais dependem da presença do
cromossomo Y.
http://fabiologicamente.blogspot.com.br/

Materiais & Métodos + Resultados
1) ANÁLISE CITOGENÉTICA
 Foram preparados cromossomos de alta resolução (nível de 700
bandas) a partir de culturas de células sanguíneas;
 Foram analisadas 100 metáfases do paciente e 20 metáfases de seus
pais;
 Técnicas-padrão (convencionais) utilizadas:
 Bandamento C;
 Coloração Da/DAPI;
 Técnica de hibridização fluorescente in situ (FISH)
 Utilizada em 20 metáfases mediante sondas específicas para o
cromossomo Y
 CEP Y Sat III Spectrum Green/ CEP Y Alpha Spectrum
Orange
 LSI SRY Spectrum Orange/ CEP X Spectrum Green

Análise Citogenética - RESULTADOS
 Determinação do cariótipo real do paciente (46,XX[50]/45,X [25]/
46,X,der(Y)(pter→q11.222::p11.2→pter)[25]) mediante a utilização
de bandamento GTL;
 Características do cromossomo Y derivativo:
 Monocêntrico;
 Sem a região de heterocromatina Yq12;
 Utilização de sonda de FISH específica para o gene SRY ⇨ sinais
fluorescentes em ambas as extremidades finais do cromossomo Y
derivativo = duplicação do gene SRY.
- OBS.: os cariótipos de ambos os pais do paciente foram normais.

Fig. 1. Cariótipo citogenético parcial, com bandas C, e análise por FISH. A Idiograma
do cromossomo Y normal (à esquerda), cromossomo Y derivativo do paciente com
bandeamento GTL (no meio) e o idiograma reorganizado (à direita) mostrando a região
Yp11.2 duplicada e a deleção abaixo da região Yq11.222. B Bandeamento G e C
bandeamento C, ambos mostrando a localização do centrômero do cromossomo Y
derivativo (der(Y)) e uma deficiência de heterocromatina no braço longo do
cromossomo Y (Yq). D Análise por FISH mostrando que o der(Y) possui um
monocentrômero com sinais vermelhos e uma região Yq12 deletada sem a marcação
pelo sinal verde (CEP Y Alpha Spectrum Orange/CEP Y Sat II Spectrum Green
[sondas]). E O cromossomo derivativo Y apresentou o gene SRY duplicado, mostrado
pelos sinais fluorescentes vermelhos (seta vermelha, LSI SRY Spectrum Orange/CEP X
Spectrum Green).

Bandeamento GTL
O bandeamento GTL é um bandeamento G obtido através de
tratamento com tripsina e coloração com Leishman.

2) ANÁLISE ALÉLICA DOS CROMOSSOMOS X
 Amostras: DNA genômico extraído de sangue periférico do
paciente e de seus pais;
 Foram amplificados produtos de 18 loci dos cromossomos sexuais
e 12 loci dos cromossomos 13, 18 e 21 ⇨ marcadores de pequenas
sequências em repetição (STR: short tandem repeat);
Utilizou-se eletroforese por capilaridade para realizar tal análise.
 Objetivo da técnica: esclarecer a origem da linhagem celular
mosaica 46,XX;
Resultados
 Detectou-se a isodissomia materna dos cromossomos X;
 Dos 18 loci de CS, todos os alelos relacionados ao cromossomo
X do paciente eram concordantes com os alelos maternos;
 Dentre esses, 4 marcadores de sequências STR com certeza
tinham origem materna;

Tab.2. Comparação do tamanho dos alelos (em pares de bases) entre o paciente e seus pais, examinados por QF-PCR
utilizando os produtos de marcadores de microssatélites nos cromossomos 13, 18, 21, X e Y.
Os marcadores STR em negrito mostram alelos isodissômicos que claramente possuem origem materna.

3) ANÁLISE de MICRODELEÇÕES do CROMOSSOMO Y
 Quatro rodadas de PCR-multiplex: DNA do paciente + controle
positivo normal do sexo masculino + controle negativo normal do
sexo feminino;
 Condições de ciclo da PCR:
 Desnaturação inicial a 95ºC, por 10 minutos;
 35 ciclos a 95ºC, por 10 minutos;
 35 ciclos a 62ºC, por 90 segundos;
 35 ciclos a 65ºC, por 90 segundos;
 Extensão final a 65ºC, por 10 minutos
 Eletroforese em gel de agarose NuSieve® a 3% + iluminação UV

Tabela 1. Resumo de informações dos marcadores das sequências STS (sequence-tagged site)
e dos primers utilizados para a análise de microdeleções nas regiões do fator de azoospermia
(AZF).

Análise de Microdeleção do Cromossomo Y - RESULTADOS
 Dos 18 loci de CS: 15 eram marcadores de sequências STR no
cromossomo Y;
 Dessas 15, 12 loci não detectados nas regiões AZFb e AZFc
 Indicação: deleção completa desde Yq11.222 até Yq11.223,
incluindo:
 Oloci para o gene SRY (sY14);
Região do fator a de azoospermia (AZFa) (sY86 e sY84);
 O estabelecimento do real cariótipo do paciente só foi possível
mediante a união de:
 Resultados de citogenética;
 Citogenética molecular;
 Análise de localização dos loci STS deletados

Fig.2. Análise de PCR-multiplex com os marcadores das sequências STR para
microdeleções na região do
fator de azoospermia (AZF).
A amostra do paciente
apresentou a eliminação com-pleta
das regiões dos fatores b
e c de azoospermia (AZFb e
AZFc). A amostra do pai do
paciente não apresentou
microdeleções para nenhum
dos sítios/locus testados. Para
a
localização dos diferentes
marcadores da sequência
STS, consulte a tabela 1.
L: escala de DNA (marcadores); B: branco; Fe: controle negativo feminino ; M:
controle positivo masculino; P: paciente; Fa: pai do paciente; ZFX: motivo
proteico dedo de zinco do cromossomo X.

4) ANÁLISE por HIBRIDIZAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA
BASEADA em ARRANJO (aCGH ou CGHarray)
 Essa técnica permite a identificação de alterações cromossômicas
desbalanceadas por meio da análise de todo o genoma;
 Objetivo da técnica: regiões duplicadas e deletadas no cromossomo
Y derivativo rearranjado.
Resultados
 ⇧ relativo da proporção de cromossomos X (devido à linhagem
46,XX);
 Perda parcial de material do cromossomo Y;
 Conclusões a respeito do Y(der):
 Duplicação a partir da região Yp terminal até Yp11.2 -
~5,65 Mb;
 Deleção a partir de Yq11.222 até Yq terminal - ~41,95Mb

Fig. 3. O perfil de CGH para o paciente apresenta médias de dados
altamente combinados e um
elevado sinal na proporção
log2 (0-1.0) no eixo Y para o
cromossomo X devido à alta
proporção de células da linha-gem
46,XX (50%) (painéis
superior e central,setas verme-lhas).
O perfil para o cromos-somo
Y derivativo mostra um
sinal deletado/excluído, exibi-do
como <0 na trama da pro-porção
log2, localizado abaixo
da região Yq11.222 e contendo aproximadamente 41,95 Mb de tamanho
(41.950 pb) (painéis central e inferior, setas verdes).

Discussão + Conclusão
 Nenhuma doença complexa foi detectada, exceto a azoospermia;
 Cromossomo Y derivativo
 Duplicação parcial da região Yp;
 Duas cópias do gene SRY;
 Deleção das regiões de AZFb e AZFc inteiras
 Três linhagens celulares
 46,XX
 45,X
 46,X,der(Y)
 Mecanismos do cromossomo Y isodicêntrico e isocromossomo Y
 Envolvidos na ativação de cruzamento (crossover)
intracromátides ou intercromátides e em vias de não
cruzamento (não-crossover), sendo a transmissão dessa via por
meio de genes palíndromos

 A repetição de sequências palindrômicas entre cromátides irmãs ou
cromátides do cromossomo Y derivativo poderia causar:
 Sinapses
 Recombinação durante a prófase da meiose I paterna
 Recombinação somática inadequada na mitose pós-zigótica
 A dissomia uniparental (DUP) pode resultar de
 Resgate da trissomia
 Duplicação da monossomia
 Complementação gamética
 Formação do zigoto com isodissomia do cromossomo X
 Quatro conceptos possíveis
 46,XY
 46,X,der(Y)
 47,XXY
 47,XX,der(Y)

Fig.4. Representação esquemática da geração
do cromossomo Y derivativo e da formação de
uma linhagem celular mosaica. Para o gameta
paterno, o cromossomo Y derivativo poderia
ser gerado por meio da sinapse para
recombinação homóloga entre cromátides
irmãs ou pela recombinação intracromátide
durante a prófase da meiose I paterna. A troca
de cromátides desiguais pode resultar no
gameta paterno apresentando a duplicação
segmentar do braço curto do cromossomo Y
(Yp) e deleção no braço longo do cromossomo
Y (Yq) (A) Alternativamente, a recombinação
inadequada pode ocorrer em um zigoto normal
durante a mitose pós-zigótica, durante o
desenvolvimento embrionário precoce (C, D).
Para os gametas maternos, uma não disjunção
na meiose materna pode resultar em gametas
23,X ou 24,XX (com dissomia), e assim
linhagens 46,XX e 45,X podem se originar de
um zigoto 47,XXY durante a divisão celular
pós-zigótica. (B, C). Outro mecanismo
possível é a derivação de um zigoto
46,X,der(Y) a partir das linhagens 45,X e
46,XX, após a fertilização (D).

 Cromossomo X fruto da dissomia uniparental materna ⇨ provável
origem do efeito de imprinting genômico (certos genes são expressos
por apenas um do alelos) em mulheres normais;
 Há possibilidade de alenos menos expressos estarem escondidos
para os marcadores das sequências STR do cromossomo X;
 Mecanismo mais plausível para o cariótipo desse paciente
 Produção do cromossomo Y derivativo na meiose I paterna ou
no início da embriogênese
 Seguida da gerãção de uma linhagem 45,X
 Resultando em uma linhagem 46,XX devido à duplicação
monossômica ou a uma não disjunção mitótica
 A expressão do gene SRY duplicado poderia afetar o
desenvolvimento urológico masculino;
 A linhagem 46,XX teria menos efeito pois foi gerada em divisões
pós-zigóticas tardias (após a determinação do sexo genotípico)

 Correlações possíveis
 Manifestações clínicas ⇨ proporção de células 45,X
 Possibilidade de isodissomia do cromossomo X ⇨ cariótipo
46,XX
- OBS.: a linhagem 45,X deveria elucidar mosaicismo,
quimerismo e dissomia uniparental (DUP) em casos de MCS
46,XX
Proposta
 Técnica de análise dos fragmentos alélicos ⇨ melhorar a
confiabilidade da rotina clínica do diagnóstico citogenético
Conclusão final
 Rotina citogenética + técnicas moleculares ⇨ determinação da
origem desse mosaicismo + rearranjo cromossômico
 Utilidade: reduzir erros diagnósticos durante o
aconselhamento genético

Referências Bibliográficas
 Disponível em
<http://professor.ucg.br/siteDocente/admin/arquivosUpload/3989/material/Ci
togen%C3%A9tica%20PdC.pdf>. Acesso em 20/11/2014, 16h49min;;
 Disponível em
<http://www.medicinenet.com/script/main/art.asp?articlekey=5464>. Acesso
em 20/11/2014, às 17h41min;
 Disponível em
<http://repositorio.utad.pt/bitstream/10348/2917/1/msc_jopinho.pdf>. Acesso
em 20/11/2014, às 18h20min ;
 Disponível em
<http://www.vidafertil.com.br/index.php?mact=Glossary,cntnt01,show,0&cn
tnt01term_count=15&cntnt01start=&cntnt01cat=glossario&cntnt01tid=14&c
ntnt01returnid=57>. Acesso em 22/11/2014, às 18h06min;
 Disponível em <
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/.../DoutoradoAnaCarolinaLaus.pdf
>. Acesso em 22/11/2014, às 18h33min;

Referências Bibliográficas
 Disponível em <
http://books.google.com.br/books?id=tC9VdBFW0wsC&pg=PA137&lpg=P
A137&dq=complementa%C3%A7%C3%A3o+de+gameta&source=bl&ots=
yoyhKr_RcI&sig=LHjjwY_8q20GZ1Kbv3Pi3tbAJ5I&hl=pt-
BR&sa=X&ei=oPNwVMGhIILksAS14oBQ&ved=0CCMQ6AEwAQ#v=on
epage&q=complementa%C3%A7%C3%A3o%20de%20gameta&f=false>.A
cesso em 22/11/2014, às 18h36min;
 Disponível em <http://files.bvs.br/upload/S/0100-
7254/2011/v39n2/a2418.pdf> . Acesso em 23/11/2014, às 15h37min;
 Disponível em < http://books.google.com.br/books?id=w6U-SgjuTH8C&
pg=PT179&lpg=PT179&dq=isodissomia&source=bl&ots=OLn
csNPI51&sig=6AJMcU0xlgJ6kZ0iz-fRRI0W-UY&hl=pt-
BR&sa=X&ei=wUhyVOTAJM7ksASa24HgBw&ved=0CB0Q6AEwAA#v=
onepage&q=isodissomia&f=false>. Acesso em 23/11/2014, às 18h53min;
 Disponível em < http://www.orpha.net/consor/cgi-bin/
OC_Exp.php?Lng=PT&Expert=1772> Acesso em 23/11/2014, às
19h07min

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