Mutações no gene NT5E e calcificações arteriais

Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Instituto de Ciências Biológicas e Naturais (ICBN)
Disciplina de Biologia Molecular Aplicada
Professor André Luiz Pedrosa
Mutações no gene NT5E e calcificações
arteriais
Juliana de Morais Palmieri da Silva
Juliana Mendes Junqueira
Lais de Melo Valente
Verônica Nascimento Mendes
Curso de Biomedicina
Uberaba - MG
Novembro/2014

Objetivo/justificativa do artigo
Tentar elucidar as bases genéticas e
moleculares das calcificações
arteriais, as quais estão associadas a
um risco cardiovascular aumentado
MUTAÇÕES NO GENE NT5E & CALCIFICAÇÕES ARTERIAIS

Introdução
MUTAÇÕES NO GENENT5E & CALCIFICAÇÕES ARTERIAIS
A calcificação arterial foi considerada uma doença
desconhecida até pouco tempo;
2008 - NIH (National Institutes of Health) – Programa
para Doenças não diagnosticadas;
 Inicialmente era considerada uma resposta passiva para
eventos degenerativos;
 Em uma família, nenhum dos pais era afetado pela
doença, somente os filhos.

Um depósito de cálcio nas artérias localizadas na metade
inferior do corpo e nas articulações das mãos e dos pés dos
pacientes;
 Acomete a camada íntima ou média de vasos;
Associada a um risco excessivo de eventos
cardiovasculares;
 Calcificação arterial infantil idiopática (calcificação arterial
generalizada da infância).
MUTAÇÕES NO GENE NT5E & CALCIFICAÇÕES
ARTERIAIS
CALCIFICAÇÃO ARTERIAL:
Introdução

Introdução
PARA REALIZAÇÃO DESSE ESTUDO:
 Primeiramente foi realizado esse estudo para avaliar o início da
doença em indivíduos adultos de três famílias;
 Indivíduos das Famílias 1 e 3 – aprovadas do NIH pelo Programa
de doenças não Diagnosticadas;
 Estudos genéticos para Família 2 foram aprovados pelo Comitê
de Ética da universidade Azienda Ospedaliera Universitaria San
Giovanni Battista (Universidade de Torino, na Itália);
Todos informados com consentimento escrito.

Figura 1. Genealogia do estudo dos pacientes.
O painel A mostra a genealogia dos estudos das três famílias (família 1).
Símbolos abertos indicam membros não afetados na família, enquanto que os
símbolos vermelhos mostram membros afetados. Setas indicam os
probandos. □ sexo masculino/ o: sexo feminino/ Símbolos cortados:
falecidos/ Dupla linha horizontal: consanguinidade/◊: número desconhecido
de indivíduos/ △: gravidez perdida
Introdução

Introdução
ITB: Índice pressórico tornozelo-braquial

Manifestações clínicas
Manifestações Clínicas – Família 1
 Extensa oclusão das artérias ilíaca, poplítea e tibiais, com
vasta colateralização;
 Calcificação extensa com áreas de arteriomegalia (aumento
do diâmetro das artérias);
 Revelou calcificação das cápsulas articulares justa-articulares
dos dedos , pulsos, tornozelos e pés.
 Todos os 4 irmãos dessa paciente:
 Diminuição da claudicação intermitente;
 Diminuição hemodinamicamente significante da doença
arterial periférica obstrutiva das extremidades inferiores;
 Oclusão da artéria poplítea;
 Três dos cinco irmãos mostraram que as lesões obstrutivas
eram difusas e intensamente calcificadas;
 Uma das irmãs tinha calcificações vasculares circunferenciais
periféricas proeminentes nas extremidades inferiores;
 Obstrução vascular extensiva com calcificação difusa

Família 3
Paciente II.1
Família 1
Paciente VI.1
Família 2
Paciente II.4 Família 1
Paciente VI.1
Família 1 - Paciente
VI.1

FAMÍLIA 2
Mulher 68 anos
Dor articular intensa nas mãos tratada com
glicocorticóides (tratamento sem efeito)

 Condrocalcinose;
 Níveis séricos de eletrólitos, como cálcio e
colesterol, foram normais;
 Duas irmãs, de 73 e 70 anos de idade, também
tiveram dor nas extremidades inferiores
e tiveram calcificações vasculares que
eram semelhantes àquelas do probando .
Família 2
Paciente II.4

FAMÍLIA 3
Mulher, 44 anos
Com 42 anos teve parestesia nas pernas, avaliações
reumatológicas negativas e isquemia na perna direita –
procedimento cirúrgicobypass

 Extensas calcificações nas artérias distais, com preservação
das artérias carótidas, aorta e das
artérias coronárias;
 Isquemia na perna direita, tendo
sido solicitado um desvio (bypass)
femoro-poplíteo;
 Os níveis séricos de proteína
C-reativa, colesterol, lipídios,
cálcio, fosfato e vitamina D
estavam dentro da normalidade.
Família 3
Paciente II.1

Conceitos básicos:
 Pontuação LOD : uma estimativa estatística para saber se dois
genes, ou um gene qualquer e um gene da doença, são susceptíveis
de serem localizados perto um do outro em um cromossomo e,
portanto, são susceptíveis de serem herdados juntos. Uma
pontuação LOD de 3 ou superior a 3 é geralmente entendida como
significando que dois genes estão localizados perto um do outro no
cromossomo.
Touchdown-PCR: pré ciclos de amplificações, onde há variação
na temperatura de anelamento que reduz o número de bandas
inespecíficas da reação.

Materiais & Métodos + Resultados
1) CULTURA DE FIBROBASTOS
 Foram preparadas a partir de uma biópsia por punção contendo 4
mm de amostra de pele;
 Obtidas de cada paciente e cultivadas em meio Eagle modificado
por Dulbecco (DMEM);
Contendo 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina;
As células foram alimentadas a cada dois dias e divididas 1:2 até a
confluência.

2) ANÁLISE de POLIMORFISMOS de NUCLEOTÍDEO
ÚNICO (SNPs)
 DNA genômico na Família 1 foi isolado a partir de leucócitos
periféricos e genotipados por genotipagem array;
 Amostras de alelos homozigotos foram geradas com a utilização
de Software GenomeStudio;
 Regiões anômalas de homozigose foram identificadas visualmente
e confirmadas por meio de imputação de haplótipo (ENT programa);
Uma pontuação LOD foi estabelecida mediante o uso de análise
paramétrica de ligação múltipla.

3) ANÁLISE de MUTAÇÕES da CD73
 Éxons codificantes e junções íntrons-éxons do gene NT5E foram
amplificados por PCR-touchdown
• 50 ng de DNA genômico
• 3 μM de oligonucleotiótidos senso e antissenso
• 5 μL de HotStart Master Mix
• Em um volume final de 10 μL
 Os produtos de PCR foram sequênciados em ambas as direções
com o uso do Kit Big Dye terminator e um sequenciador capilar
automatizado;
 Compararam as sequências derivadas de eletroferograma com
sequências de referência para o gene NT5E;
 Screening de 200 amostras de DNA de indivíduos-controles da
raça branca foi realizado por meio de análise de discriminação alélica
5’-nuclease(TaqMan)

SNPs - RESULTADOS
 Foram identificadas mutações bialélicas do tipo nonsense, do tipo
missense e mutações com mudança de fase;
 Devido a inserções de um único nucleotídeo na região da ecto-
5'nucleotidase do gene NT5E;
 Gene que codifica a enzima CD73, a qual gera adenosina
extracelular, imediatamente a downstream ao gene da ENPP1 na via
extracelular de degradação do ATP.

 A linhagem consanguínea da família 1, com uma doença
confinada a uma geração, sugeriu herança autossômica recessiva;
 Procuraram por uma região do genoma na qual todos os cinco
irmãos afetados eram homozigotos e idênticos por meio da
descendência, mas da qual ambos os pais eram heterozigotos;
 Havia apenas uma dessas regiões em todo o genoma: uma região
de 22,4 Mb no cromossomo 6q14, contendo 7977 SNPs genotipados e
92 genes;
A pontuação na escala LOD para essa região nesta família, foi de
4,81.

Análise de mutações da CD73 - RESULTADOS
 Dos 92 genes desta região, apenas três foram avaliados:
• Os genes ATG5 e CASP8AP2, porque estavam envolvidos em
processos celulares degenerativos que podem levar à calcificação;
• O gene NT5E, porque o seu substrato enzimático é o produto da
ENPP1, e que mutações nesse gene geram calcificações arteriais em
crianças.
O sequenciamento direto identificou uma mutação nonsense
homozigota (c.662C →A, resultando em p.S221X) no éxon 3 do gene
NT5E em todos os irmãos da família 1 e a mesma mutação nonsense
foi encontrada no estado heterozigoto em ambos os pais

Região de homozigose
idêntica entre os pacientes
Figura 2. Resultados de estudos genéticos e enzimáticos na família
1.
O painel A mostra ensaios de polimorfismos de nucleotídeo único
(SNPs) das amostras homozigotas dos cinco irmãos afetados da
família 1 e também das amostras dos seus pais.

1.
O painel B mostra sequências cromatográficas de um controle, um dos
pais de um membro afetado da família 1 e de um membro afetado; a
mutação sem sentido (p.S221X) é indicada

4) ESTUDOS de EXPRESSÃO
 RNA isolado  culturas de fibroblastos (RNeasy kit ® - Qiagen);
 cDNA  gerado de amostras de 1μg de RNA (SuperScript ® II
Reverse Transcriptase – Invitrogen);
Ensaio de qPCR + tecnologia SYBR Green ®  expressão do gene
NT5E
 Método 2-ΔCt =2-(Ct de CD73 – Ct de 18S)
 Primers

4) Estudos de expressão - RESULTADOS
 ⇩ da expressão do mRNA do geneNT5E ⇨ pacientes VI.1 e VI.4
(família 1);
 Afetados da família 2 ⇨ homozigotos para mutação missense
c.1073G→A (p.C358Y) no éxon 5 do geneNT5E;
 Mãe dos afetados da família 2 ⇨ heterozigota para esta
variante do aminoácido (conservado em 16 espécies);
 Membro afetado da família 3 ⇨ heterozigoto para a mutação
c.662C→ A (família 1) + mutação nonsense c.1609dupA
(V537fsX7) no éxon 9 do geneNT5E
- OBS.: 400 alelos-controle pareados etnicamente ⇨ nenhuma das
mutações relacionadas.

1.
O painel C mostra a expressão do mRNA (DNA complementar
[cDNA]) do gene NT5E nos pacientes VI.4 e VI.1 e a sua comparação
com os respectivos controles.

Fig.1. (Apêndice Complementar) Mutações no gene NT5E nas
famílias 2 e 3
A. Sequência cromatográfica dos membros afetados da família 2,
mostrando a mutação missense (p.C358Y). Ao lado do cromatograma
está a comparação do aminoácido na posição 358 entre as espécies.

Fig.1. (Apêndice Complementar) Mutações no gene NT5E nas
famílias 2 e 3
B. Sequências cromatográficas da família 3, mostrando a mutação
p.S221X e uma inserção de nucleotídeo único (p.V537fsX7)7,
respectivamente, ao nível dos nucleotídeos.

5) TÉCNICA de WESTERN BLOTTING para CD73
 Células cultivadas até a confluência
 Tripsinizadas + sedimentadas + lisadas
 Solução
 50 mM de Tris-HCl a pH 7,4;
 150 mM de NaCl;
 2 mM de EDTA;
 1% NP-40;
 1% de SDS (tampão de RIPA)
 Suplementação:
 0,5% Triton-x
 1x Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail ® - Roche
10 minutos no gelo ⇨ vórtice a 4ºC (5 minutos) + centrifugação
a 15.000 xg ⇨ quantificar a proteína sobrenadante

5) TÉCNICA de WESTERN BLOTTING para CD73
 30 mg de proteína + solução SDS para corrida em gel
 Gel de poliacrilamida (PAGE) de 4 a 20% + eletroforese (1,5 hora)
 Transferência das proteínas ⇨ anticorpos anti-CD73 + actina
Resultados
 ⇩⇩⇩ expressão da proteína CD73
Actina
Afetados Controles
Fig.2. (Apêndice Complementar) Western blot de fibroblastos
mostrando a proteína CD73 ausente nos pacientes VI.4 e VI.1,
comparados com controles. A actina foi utilizada como um controle
para garantir uma carga proteica igual.

6) ENSAIO ENZIMÁTICO da CD73
 Fibroblastos ⇨ lavados com solução de:
 2 mM de MgCl2
 120 mM de NaCl
 5mM de KCl
 10 mM de glicose
 20 mM de HEPES
 Tampão de incubação: solução de lavagem + 2mM de AMP
Células encubadas a 37ºC, por 10 minutos
 Medição de fosfato inorgânico (Pi) ⇨ SensoLyte MG Phosphate ®
- AnaSpec
- OBS.: medições do Pi ⇨ normalizadas para mg de proteína

6) Ensaio enzimático da CD73 - RESULTADOS
 Atividade da proteína CD73 quase ausente
Pais dos pacientes ⇨ ~72% do nível do controle
Figura 2. Resultados de
estudos genéticos e
enzimáticos na família 1.
O painel D mostra uma
deficiência na atividade
enzimática da CD73
(representada pela produção
de fosfato inorgânico
dependentemente de AMP)
em culturas de fibroblastos
dos pacientes VI.4 e VI.1 da
família 1

Fosfato inorgânico (μg/μgde proteína)
Controles Pais Afetados
Fig. 3. Atividade enzimática da CD73 em fibroblastos dos controles, dos
pais heterozigotos da família 1 e dos indivíduos afetados. Os dados
representam as médias ± os desvios padrões (standard deviations – SD) e
foram analizados utilizando-se do One-way ANOVA com o teste t de
comparação múltipla de Dunnett. Controles X pais dos afetados e controles X
afetados (***), com p<0,0001. Duas amostras coletadas em triplicata foram
descritas nos grupos dos controles e dos pais; três amostras coletadas em
triplicada foram descritas no grupo dos afetados.

7) CLONAGEM de MUTAÇÕES e PRODUÇÃO de LENTIVÍRUS
 Foram utilizadas sequências de primers em ambas as direções
 Para a transdução:
 Meio de crescimento contendo 6μg/mL de polibreno
 Adicionado ao meio de blasticidina 4 dias depois

8) TRANSFECÇÃO em CÉLULAS HEK293
 A célula HEK293 cultivados em meio Eagle suplementado com
10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina.
1μg de pCMV-Sport 6 + cDNA mutado
para o gene NT5E
proteína verde fluorescente
Transfectados em células HEK293
 Analise para a atividade de CD73 3 dias após a transecção

9) ENSAIOS IN VITRO de FOSFATASE ALCALINA e CÁLCIO
 Os fibroblastos dos pacientes coloração tripisinização
As culturas foram tratadas com
 0,1μM de dexametazona
 50μM de acido ascórbico-2-fosfato
 10mM de β-glycerol fosfato
 Meio com 10% de soro bovino fetal e 1% penicilina-estreptomicina
 21ͦ dia
 Lavadas com tampão salino fosfato
 Fixados com formalina a 10% por 10 minutos
 Cristais fosfato de cálcio corados com alizarina vermelha S
a 2%; pH4,2
 Fosfatase alcalina foi quantificada pela medição de p-nitrofenol
produzida, medida por absorção a 405nm

Estudos Celulares - RESULTADOS
Fig.3. Estudos dos fibroblastos obtidos do paciente VI.4 da
família 1. O painel A mostra os resultados do aumento da
concentração da fosfatase alcalina tecido não-específica (TNAP) em
fibroblastos de um controle e do paciente VI.4 após a incubação por 3
dias em meio calcificante. O aumento exacerbado nas células do
paciente (imagem central) foi reduzido pela adição diária de 30 μM de
adenosina ao meio de incubação (imagem à direita).

Fig.3. Estudos dos fibroblastos obtidos do paciente VI.4 da família 1.
O painel B mostra a atividade da TNAP em fibroblastos de um controle e do
paciente VI.4 após a incubação por 3 dias em meio calcificante. A transdução
com um vetor-controle expressando a β-galactosidase apresentou um efeito
discreto na atividade da fosfatase alcalina, enquanto que a transdução com
um vetor que codifica a CD73 reduziu significativamente a atividade dessa
enzima; a incubação com 30μM de adenosina resultou em níveis da TNAP
similares aos vistos nos controles. Os dados apresentados correspondem a
três experimentos que foram analisados pelo método de análise da variância
mediante comparação com o teste hoc do múltiplo de Dunnett’s. Os valores
de p foram apresentados para permitir a comparação com a ausência de
tratamento. As barras I indicam os desvios padrão.

Fig.3. Estudos dos fibroblastos obtidos do paciente VI.4 da família 1.
O painel C mostra os efeitos das intervenções na formação dos cristais de
fosfato em fibroblastos de um controle e do paciente VI.4. A coloração para o
cálcio com vermelho de alizarina S mostrou uma cristalização abundante nas
células do paciente, como é visível na comparação com a coloração das
células controle, após 21 dias em meio calcificante. A formação de cristais de
cálcio foi evitada/prevenida pela transdução com um vetor lentiviral que
codifica a CD73, mas não por um vetor-controle expressando a β-
galactosidase, e pelo tratamento a cada 4dias com 1 mM de levamisol; o
tratamento diário com 30 μM de adenosina extinguiu parcialmente o
processo de calcificação.

 Bisfosfanato análogo ao pirofosfato, inibidor da
calcificação tecidual
 Dipiridamol fármaco antitrombotico, poderia promover o
salvamento da adenosina por inibir a recaptação celular da
mesma, onde seria degradada.
Outras possibilidades terapeêticas uso de antagonistas
dos receptores de adenosina ou um inibidor direto da fosfatase
alcalina, como o Lanzoprazol

Discussão + Conclusão
Fizeram várias revisões de literatura pra mostrar como essa
doença já vinha sendo estudada e sem muito sucesso no
resultado.
A calcificação arterial medial das extremidades inferiores com
calcificação periarticular foi descrita primeiramente por
Magnus-Levy em 1914 e novamente por Levitin em 1945.
Sharp em 1954 fez um relato de dois irmãos que foram
afetados e depois registrou na base de dados OMIM(Banco de
dados Online sobre Herança Mendeliana em Humanos – número
OMIM, 211800)
Nosaka e More com colaboradores descreveram casos isolados
ficando um total de sete casos publicados até 2001.
Este trabalho descreveu as bases moleculares e enzimáticas
dessa desordem em nove pacientes com três diferentes

 Evidencias consideráveis apoiam a associação da doença vascular
dessas famílias com mutações no gene NT5E;
 Os resultados das análises de segregação foram consistentes com os
observados nas famílias estudas, e a mutação nonsense (p.S221X) e a
inserção de um único nucleotídeo (p.V537fsX7) prevê proteínas CD73
truncadas;
 A mutação missense (p.C358Y), prediz uma modificação patológica
em um aminoácido conservado ao longo da evolução e é localizada no
domínio crítico da nucleotidase da proteína CD73;
 A mutação nonsense resultou em uma redução significativa nos
níveis de RNAm da CD73 e da própria proteína CD73 em células
cultivadas;
 Cada uma das três diferentes mutações nas três famílias estudadas
produziu essencialmente a proteína CD73 não funcional.

ENPP1
ATP AMP
Adenosina
CD73
PPi Pi
TNAP
Calcificação

Panorama atual
Nesse estudo foram identificadas mutações no gene NT5E em
membros de três famílias com calcificações sintomáticas, tanto
arteriais quanto articulares (cápsulas articulares);
 O gene NT5E codifica a nucleotidase CD73, a qual atua na
conversão do AMP em adenosina;
ENPP1
CD73
 Os resultados apresentados apresentam papel importante
para essas vias metabólicas, permitindo a inibição da calcificação
tissular ectópica.

2009 = 23
2010 = 322
2011 = 360
2012 = 424
2013 = 526
2014 = 335

Referências Bibliográficas
Disponível em:
<http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAsgEAK/tecido-osseo>.
Acesso em 16/11/2014, às 13h04min
Disponível em: <
http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/12713/000633516.p
df?sequence=1>. Acesso em 23/11/2014, às 10h45min
Disponível em: <
http://meriva.pucrs.br/dspace/handle/10923/1439>. Acesso em
23/11/2014, às 12h02min
Disponível em <http://www.biotec-zone.
net/?do=vernoticia&id=941 Acesso em 17/11/2014, 16h49min;
 Disponível em
<http://gazetaweb.globo.com/noticia.php?c=227129&e=7 >Acesso
em 17/11/2014, 17h13min;
SKINNER, H.B; MCMAHON, P.J. CURRENT ortopedia:
diagnóstico e tratamento. 5 ed. Porto Alegre: Artmed-Mc Graw Hill,
2015. 672p. ISBN: 978-85-8055-436-6

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