Universidade de São Paulo
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto

HPLC PREPARATIVA

Letícia Fracarolli
Disc...
SUMÁRIO
1. Introdução
1.1. Principais diferenças entre HPLC
analítico e HPLC preparativo

2. Colunas
2.1. Fase estacionári...
1. INTRODUÇÃO
Cromatografia

Cromatografia
líquida de alta
performance
preparativa

Separação de
misturas por
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1. INTRODUÇÃO

Esquema de um HPLC preparativo
1. INTRODUÇÃO


Parâmetros para otimizar o fator de separação e
resolução de picos:


Fase estacionária apropriada;



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1.1. PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE HPLC
PREPARATIVO E HPLC ANALÍTICO
HPLC
preparativo

Objetivo de isolamento
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1.1. PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE HPLC
PREPARATIVO E HPLC ANALÍTICO

HPLC
preparativo

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2. COLUNAS


O papel da coluna é fundamental no desenvolvimento de
um método;

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2. COLUNAS


Dimensões da coluna: de acordo com a quantidade de
material que se deseja injetar.

Diâmetro interno da colu...
2. COLUNAS

http://www.phenomenex.com/Products/Search/HPLC
2.1. FASE ESTACIONÁRIA


Componentes rígidos e porosos:

Mais
utilizadas:
Sílica –
C8

Sílica –
C18
2.1. FASE ESTACIONÁRIA


Sua escolha deve ser feita de maneira a proporcionar a
melhor seletividade para os componentes d...
2.1. FASE ESTACIONÁRIA


Tamanho de partícula:
HPLC
preparativo
Partículas de 1,8-3,5 µm não são
utilizadas. As partícula...
3. FASE MÓVEL


Podem ser utilizados em modo gradiente ou isocrático.

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Alguns fatores que influenciam na escolha do so...
3. FASE MÓVEL


Volatilidade para facilitar a remoção a partir da fração
isolada;



Viscosidade;



Pureza;



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4. DETECTORES UTILIZADOS EM HPLC
PREPARATIVO


Detectores destrutivos:
Detector Eletroquímico.

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Massas...
4. DETECTORES UTILIZADOS EM HPLC
PREPARATIVO
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Detectores destrutivos: necessitam de um splitter para
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4.1. SPLITTER


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4.1. SPLITTER
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Divisor ativo: tem dois caminhos de fluxo separados e
uma válvula de troca rápida, que transfere o compos...
4.1. SPLITTER
Possibilidade de selecionar
diferentes proporções de
divisão, alterando a
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válvula;

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4.1.1 CALIBRAÇÃO DO TEMPO DE ATRASO


A troca da válvula tem de ser atrasada até que o
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4.1.1 CALIBRAÇÃO DO TEMPO DE ATRASO
Procedimento de
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Usado para determinar o
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5. COLETOR DE FRAÇÕES
HPLC
preparativo

Amostra vai para o
coletor de frações.

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HPLC
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5. COLETOR DE FRAÇÕES


Disponíveis
Exemplos:

em

diferentes

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

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5. COLETOR DE FRAÇÕES


O coletor de frações desvia o fluxo para um recipiente de
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6. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA


A preparação da amostra é de especial atenção ao realizar
HPLC preparativa sobre colunas caras...
7. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS
HPLC
preparativo

Quantidades de amostra
maiores (mg).

1.

2.

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sist...
7.1. SCALE-UP


Scale-up do sistema de análise: colunas de diâmetro
maior, maior vazão e maior volume da amostra com o
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7.1. SCALE-UP


Dois parâmetros devem ser ajustados quando se passa de uma
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7.1. SCALE-UP
Vazão:

Duração do Gradiente:
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Carregamento
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Coluna: Shim-pack PREPODS(H) Kit
A) 250 mm x 4.6 mm D.I., 5 μm
B) 250 mm x 20 mm D.I., 5 μm
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7.2. SOBRECARGA DA COLUNA


Aumento da quantidade de amostra aplicada nas mesmas
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Geralmente é o...
7.2. SOBRECARGA DA COLUNA
Sobrecarga de concentração: a concentração da
amostra é aumentada, mas o volume de amostra injet...
7.2. SOBRECARGA DA COLUNA
8. SISTEMA RECICLANTE

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A reciclagem em circuito fechado é um método de
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8. SISTEMA RECICLANTE


A amostra é reintroduzida na coluna repetidamente, de
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10. APLICAÇÕES


Variam de escala para laboratório até escala industrial:
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Brassica oleracea var. Italica:
As cultivares de brócolis
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MATERIAIS E MÉTODOS
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Coluna: Waters Prep Nova-Pak (19 × 300 mm, 60 Å, 6 µm)
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
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Rendimento: para cada pico sulforafano rendeu 3,5 mg
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
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Concluindo: “Existem vários métodos de purificação ou
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
“Além disso, a utilização de sementes de brócolis
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11. REFERÊNCIAS


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Printed in Germany, Apr...
11. REFERÊNCIAS


How Does High Performance Liquid Chromatography Work? Disponível em:
<http://www.waters.com/waters/pt_B...
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Seminário realizado para a disciplina de Atualização em Técnicas de Análise Toxicológica: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e Eletroforese Capilar, pós-graduação da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto. Letícia Fracarolli - Mestranda em Biociências Aplicadas à Farmácia.

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Hplc preparativa seminário letícia fracarolli

  1. 1. Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto HPLC PREPARATIVA Letícia Fracarolli Disciplina: Atualização em Técnicas de Análise Toxicológica: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência e Eletroforese Capilar
  2. 2. SUMÁRIO 1. Introdução 1.1. Principais diferenças entre HPLC analítico e HPLC preparativo 2. Colunas 2.1. Fase estacionária 3. Fase móvel 4. Detectores utilizados em HPLC preparativo 4.1. Splitter 4.1.1. Calibração do tempo de atraso 5. Coletor de frações 6. Preparação da amostra 7. Desenvolvimento de métodos 6.1. Scale-up 6.1.1. Scale-up otimizado 6.2. Sobrecarga da coluna 8. Sistema Reciclante 9. Avaliação do resultado de uma corrida preparativa 10. Aplicações 11. Referências
  3. 3. 1. INTRODUÇÃO Cromatografia Cromatografia líquida de alta performance preparativa Separação de misturas por distribuição em duas fases móveis imiscíveis. É um processo de purificação que usa a cromatografia líquida.
  4. 4. 1. INTRODUÇÃO Esquema de um HPLC preparativo
  5. 5. 1. INTRODUÇÃO  Parâmetros para otimizar o fator de separação e resolução de picos:  Fase estacionária apropriada;  Fase móvel adequada;  Temperatura.
  6. 6. 1.1. PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE HPLC PREPARATIVO E HPLC ANALÍTICO HPLC preparativo Objetivo de isolamento ou purificação de substâncias de alto valor. ≠ HPLC analítico Objetivo limitado a determinação qualitativa e quantitativa de um composto.
  7. 7. 1.1. PRINCIPAIS DIFERENÇAS ENTRE HPLC PREPARATIVO E HPLC ANALÍTICO HPLC preparativo Quantidades de amostra maiores (mg). HPLC analítico ≠ Quantidades de amostra menores (µg). O objetivo de uma purificação preparativa é a produção máxima de produto purificado por injeção.
  8. 8. 2. COLUNAS  O papel da coluna é fundamental no desenvolvimento de um método;  Capacidade do material de embalagem: visando maior rendimento, colunas com maior capacidade podem suportar mais material por injeção.  O custo de colunas preparativas aumenta com o tamanho.
  9. 9. 2. COLUNAS  Dimensões da coluna: de acordo com a quantidade de material que se deseja injetar. Diâmetro interno da coluna (mm) Utilidade 4,6 HPLC preparativo em pequena escala 7,8 HPLC semi-preparativo >21,2 HPLC preparativo em maior escala
  10. 10. 2. COLUNAS http://www.phenomenex.com/Products/Search/HPLC
  11. 11. 2.1. FASE ESTACIONÁRIA  Componentes rígidos e porosos: Mais utilizadas: Sílica – C8 Sílica – C18
  12. 12. 2.1. FASE ESTACIONÁRIA  Sua escolha deve ser feita de maneira a proporcionar a melhor seletividade para os componentes de interesse.
  13. 13. 2.1. FASE ESTACIONÁRIA  Tamanho de partícula: HPLC preparativo Partículas de 1,8-3,5 µm não são utilizadas. As partículas de 5 µm são as mais utilizadas. Para as amostras bem resolvidas, são escolhidas partículas de 7-10 µm. ≠ HPLC analítico Quanto menor o tamanho da partícula maior será a eficiência.
  14. 14. 3. FASE MÓVEL  Podem ser utilizados em modo gradiente ou isocrático.  Alguns fatores que influenciam na escolha do solvente são os seguintes:  Fase estacionária e condições de fase móvel com melhor seletividade para compostos de interesse;  Características espectroscópicas do solvente da fase móvel;
  15. 15. 3. FASE MÓVEL  Volatilidade para facilitar a remoção a partir da fração isolada;  Viscosidade;  Pureza;  Boas propriedades de solubilidade para cargas máximas de amostra;  Custo dos solventes utilizados.
  16. 16. 4. DETECTORES UTILIZADOS EM HPLC PREPARATIVO  Detectores destrutivos: Detector Eletroquímico. Espectrômetro de Massas,  Detectores não destrutivos: Detectores UV VIS, DAD, Detector de Índice de Refração, Detector de Espalhamento de Luz, Detector de Fluorescência.
  17. 17. 4. DETECTORES UTILIZADOS EM HPLC PREPARATIVO  Detectores destrutivos: necessitam de um splitter para desviar uma pequena parte da amostra para o detector e o restante para o coletor de frações.
  18. 18. 4.1. SPLITTER  Divisor de fluxo tradicional: divisor passivo.
  19. 19. 4.1. SPLITTER  Divisor ativo: tem dois caminhos de fluxo separados e uma válvula de troca rápida, que transfere o composto a partir do fluxo principal para o fluxo de make-up.
  20. 20. 4.1. SPLITTER Possibilidade de selecionar diferentes proporções de divisão, alterando a frequência de troca da válvula; Proporções exatas e constantes, divisão não é afetada pela viscosidade, temperatura e comprimento da tubulação; Vantagens do divisor ativo Dois caminhos de fluxo independentes, permitem o uso de diferentes modificadores; Contra-pressão mínima, não há o perigo de danificar a célula detectora.
  21. 21. 4.1.1 CALIBRAÇÃO DO TEMPO DE ATRASO  A troca da válvula tem de ser atrasada até que o composto passe da célula detectora para a entrada da válvula de desvio. Este tempo é chamado de tempo de delay (tempo de atraso) (TD1) e deve ser determinada de antemão: Procedimento de calibração de atraso
  22. 22. 4.1.1 CALIBRAÇÃO DO TEMPO DE ATRASO Procedimento de calibração de atraso Usado para determinar o tempo de atraso entre o detector e o coletor de frações. Injetar um corante concentrado sobre o sistema e controlar o sinal do detector no visor online do software de controle. Começar com um volume de atraso estimado ou calculado.
  23. 23. 5. COLETOR DE FRAÇÕES HPLC preparativo Amostra vai para o coletor de frações. ≠ HPLC analítico Amostra vai direto para o descarte.
  24. 24. 5. COLETOR DE FRAÇÕES  Disponíveis Exemplos: em diferentes tamanhos e modelos.  Coletor de micro fração: é projetado para vazões abaixo de 100 µL / min;  Coletor de fração em escala analítica: é projetado para vazões abaixo de 10 mL / min;  Coletor de fração em escala preparativa: é projetado para vazões de até 100 mL / min.
  25. 25. 5. COLETOR DE FRAÇÕES  O coletor de frações desvia o fluxo para um recipiente de fração através da agulha de coleta de fração.  Utilizando uma válvula de desvio que pode ser ligada, por exemplo, através de programação de tempo, ou em função de um sinal do detector.
  26. 26. 6. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA  A preparação da amostra é de especial atenção ao realizar HPLC preparativa sobre colunas caras e, embora os objetivos não são necessariamente os mesmos, muitos dos procedimentos utilizados são idênticos aos encontrados em HPLC analítica. Correta dissolução;  Filtração de amostra, etc. 
  27. 27. 7. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODOS HPLC preparativo Quantidades de amostra maiores (mg). 1. 2. Scale-up (ampliação) do sistema de análise; Sobrecarga da coluna. ≠ HPLC analítico Quantidades de amostra menores (µg).
  28. 28. 7.1. SCALE-UP  Scale-up do sistema de análise: colunas de diâmetro maior, maior vazão e maior volume da amostra com o comprimento da coluna e concentração da amostra permanecendo constante. Os picos permanecem nítidos e simétricos. Uso de colunas grandes e volumes elevados de solventes, portanto, o método não seria econômico.
  29. 29. 7.1. SCALE-UP  Dois parâmetros devem ser ajustados quando se passa de uma coluna com D.I menor para uma coluna com D.I maior: Quantidade de amostra aplicada à coluna; 2. Vazão. 1. Considere uma ampliação de uma coluna de 4,6 × 150 mm para uma de 19 × 150 mm: Sendo assim, podemos dizer que pode ser aplicado aproximadamente 17-135 mg de amostra nesta coluna preparativa.
  30. 30. 7.1. SCALE-UP Vazão: Duração do Gradiente:
  31. 31. 7.1. SCALE-UP  Carregamento (massa) razoável para colunas preparativas de acordo com o tamanho, no modo gradiente:
  32. 32. 7.2. SCALE-UP OTIMIZADO  Otimização e scale-up de uma análise de um método preparativo é feito em três passos: Desenvolver e otimizar a separação inicial sobre uma coluna de tamanho analítica • Como otimizar? Sobrecarregar a coluna, mantendo a separação adequada de componentes de interesse Aumentar a escala de acordo com uma coluna preparativa com base na quantidade de composto necessária para purificar.
  33. 33. Coluna: Shim-pack PREPODS(H) Kit A) 250 mm x 4.6 mm D.I., 5 μm B) 250 mm x 20 mm D.I., 5 μm Fase móvel: 0.1% ácido fórmico/ metanol = 1/9 (v/v) Vazão: A) 0.8 mL/min B) 15 mL/min Temperatura ambiente Detecção em 254 nm Picos: 1: Ácido Benzóico 2: 2-naftol 3: Benzeno 4: Naftaleno 5: Bifenilo 6: Fenantreno 7: Antraceno 8: Fluoranteno Shimadzu Catalogue
  34. 34. 7.2. SOBRECARGA DA COLUNA  Aumento da quantidade de amostra aplicada nas mesmas condições de análise;  Geralmente é o método de escolha;  Permite separar amostras na gama de mg mesmo em colunas analíticas.  Pode ser feito de duas maneiras:   Sobrecarga de concentração; Sobrecarga de volume.
  35. 35. 7.2. SOBRECARGA DA COLUNA Sobrecarga de concentração: a concentração da amostra é aumentada, mas o volume de amostra injetada permanece o mesmo;  Sobrecarga de volume: quando o composto tem baixa solubilidade.  Ambas as técnicas de sobrecarga são usadas ​em combinação.
  36. 36. 7.2. SOBRECARGA DA COLUNA
  37. 37. 8. SISTEMA RECICLANTE  A reciclagem em circuito fechado é um método de purificação que melhora a separação;  Reduzir os custos comprimentos. com colunas de grandes
  38. 38. 8. SISTEMA RECICLANTE  A amostra é reintroduzida na coluna repetidamente, de modo que é possível acomodar a separação e purificação de compostos que são normalmente difíceis de separar;  Não há necessidade de ligar um número de colunas em série, de modo que é possível controlar o custo das colunas, e reduzir o consumo de solvente utilizado como fase móvel.
  39. 39. 8. SISTEMA RECICLANTE
  40. 40. 9. AVALIAÇÃO DO RESULTADO DE UMA CORRIDA PREPARATIVA: Três parâmetros importantes: pureza do produto, o rendimento e produtividade;  São dependentes uns dos outros, não sendo possível otimizar um método de HPLC preparativa com respeito a todos os três parâmetros. 
  41. 41. 10. APLICAÇÕES  Variam de escala para laboratório até escala industrial: Separações quirais;  Purificação de misturas sintéticas complexas;  Isolamento extrato natural;  Purificação de peptídeos. 
  42. 42.  “Estudos epidemiológicos têm mostrado que o aumento do consumo de vegetais, como brócolis e couve, pode reduzir o risco de desenvolvimento de câncer no pâncreas, pulmão, colo-retal e próstata”.
  43. 43. Brassica oleracea var. Italica: As cultivares de brócolis brigadeiro foram cultivadas até a maturidade de colheita Sementes foram selecionadas devido ao alto teor de glicorafanina Foi injetado 2 mL da amostra filtrada. A fase aquosa foi filtrada em um filtro de membrana de 0,22 µm, e preparada para a injeção em HPLC. O resíduo resultante foi dissolvido em 120 mL de acetonitrila 5% em água (v /v) e lavado 3 x com hexano para remover o excesso de contaminantes apolares. MATERIAIS E MÉTODOS A pasta formada foi extraída 3 x com iguais volumes de cloreto de metileno em excesso, a qual foi combinada e secou-se a 32 ° C sob vácuo num evaporador rotativo. Foram moídas com água da torneira. Desengorduradas 3 x com excesso de hexano e deixadas a secar durante a noite numa coifa. Os glicosinolatos foram hidrolisados por adição de água (03:01 de água/semente desengordurada), e a mistura foi deixada em autólise durante 8 h à temperatura ambiente. Foram misturados cloreto de sódio, a farinha molhada e sulfato de sódio (1:1:0,75).
  44. 44. MATERIAIS E MÉTODOS     Coluna: Waters Prep Nova-Pak (19 × 300 mm, 60 Å, 6 µm) HR C-18 reversed-phase HPLC column (Waters, Milford, MA); Vazão: 9 mL/min; FM: 10 % de acetonitrila em água durante 3 min; mudou linearmente durante 2 min a 25 % de acetonitrila, e mantidas isocráticamente durante 15 min. A porcentagem de acetonitrila foi aumentada para 100% mais de 2 min e seguiu assim, isocraticamente por 2 min para purgar a coluna. Detectores: Detector por índice de refração para detectar o sulforafano nitrila, e a absorvância a 254 nm foi utilizada para detectar o sulforafano.
  45. 45. RESULTADOS E DISCUSSÃO
  46. 46. RESULTADOS E DISCUSSÃO  Rendimento: para cada pico sulforafano rendeu 3,5 mg de sulforafano purificada, e a fração de eluato correspondente a cada pico de sulforafano nitrila rendeu 3,3 mg de sulforafano nitrila purificada. Com base nestes resultados, cada quilograma de semente extraída pode produzir 4,8 g de sulforafano e 3,8 g de sulforafano nitrila.
  47. 47. RESULTADOS E DISCUSSÃO  Concluindo: “Existem vários métodos de purificação ou de síntese. Porém, estes métodos são concebidos apenas para a produção de quantidades de mg destes compostos, e não se prevê a produção de larga escala necessária para estudos extensivos in vivo. Sulforafano está comercialmente disponível, mas é muito caro, e Sulforafano nitrila não está comercialmente disponível no momento. As sementes de vegetais crucíferos possuem níveis relativamente elevados de glucosinolatos por grama, reduzindo a quantidade de material de partida necessário para se obter um extrato aquoso concentrado adequado para a separação por HPLC.”
  48. 48. RESULTADOS E DISCUSSÃO “Além disso, a utilização de sementes de brócolis brigadeiro facilitou a extração de grandes quantidades de sulforafano e sulforafano nitrila, porque verificou-se que contém níveis elevados de glicorafanina em comparação com outros cultivares.”  “Embora não testado no artigo em questão, é provável que as sementes de outras variedades de brócolis tendo níveis elevados glicorafanina também proporcionarão uma boa fonte para purificação de sulforafano e sulforafano nitrila com o mesmo método.” 
  49. 49. 11. REFERÊNCIAS  AGILENT TECHNOLOGIES. Principles in preparative HPLC. Agilent Technologies Inc, Printed in Germany, April 2007.  WELLINGS, D. A. A Practical Handbook of Preparative HPLC. Elsevier, 2006.  KAZAKEVICH, Y.; LOBRUTTO, R. HPLC for pharmaceutical scientists. Wiley, 2007.  MEYER, V. R. Practical High-Performance Liquid Chromatography, fourth edition. Wiley, 2004.  SHIMADZU CATALOGUE. Prominence Preparative HPLC System.  WATERS CATALOGUE. Preparative LC Columns and Consumables.  MATUSHESKI, N. V.; WALLIG M. A.; JUVIK, J. A.; KLEIN, B. P.; KUSHAD, M. M.; JEFFERY, E. H. Preparative HPLC Method for the Purification of Sulforaphane and Sulforaphane Nitrile from Brassica oleracea. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 1867-1872.
  50. 50. 11. REFERÊNCIAS  How Does High Performance Liquid Chromatography Work? Disponível em: <http://www.waters.com/waters/pt_BR/How-Does-High-Performance-LiquidChromatography-Work%3F/nav.htm?cid=10049055&locale=pt_BR> Acessado em: 10/10/2013.  Scaling Up. Disponível em: <http://www.shimadzu.com/an/hplc/support/prep/prep3.html> Acessado em: 10/10/2013.  Recycling Preparative HPLC Instrument. Disponível em: <http://www.columnex.com/chromatography/instruments/prep-hplc-recycling/> Acessado em: 17/10/2013.  HPLC preparativo. Disponível <https://pt.vwr.com/app/Header?tmpl=/chromatography/preparative_hplc.htm> em: 17/10/2013.  Phenomenex Preparative Columns: Disponível <http://www.phenomenex.com/Products/Search/HPLC> Acessado em 24/10/2013. em: Acessado em:

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