Este relatório descreve o uso da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) para quantificar a quantidade de cafeína em um comprimido de Dorflex®. Amostras padrão de cafeína foram usadas para gerar uma curva de calibração, que permitiu determinar que o teor de cafeína no comprimido era de aproximadamente 49 mg, próximo ao valor declarado de 50 mg. O método HPLC mostrou-se eficaz para a análise quantitativa da cafeína.

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
Escola de Engenharia
Departamento de Engenharia Química
Análise Instrumental
Relatório 3:
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC)
Bárbara de Sousa Pinto
Letícia Miranda Nogueira
Patrícia Carvalho Ribeiro
Pedro Henrique Silva
Pedro Ivo de Oliveira Filho
Raquel Sousa Ramos
Grupo 2
Belo Horizonte – MG
02 de abril de 2014

2. 2
1- RESUMO
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) é uma técnica de separação,
identificação e quantificação cujo princípio físico-químico explorado são as diferentes
interações intermoleculares que ocorrem entre a amostra e a fase estacionária. Tais interações
proporcionarão tempos de retenção diferentes para compostos ou classes de compostos da
amostra na coluna cromatográfica. O equipamento utilizado para a realização dessa técnica é
dito cromatógrafo e o resultado gráfico (cromatograma) fornece-nos informações do tempo de
retenção e, indiretamente, quantidade dos compostos. Neste experimento, utilizou-se a HPCL
e determinou-se a quantidade de cafeína num comprimido de Dorflex®.
2- INTRODUÇÃO
A cromatografia pode ser definida, de maneira geral, como uma técnica físico-química
de separação, identificação e quantificação de substâncias. Ela consiste, basicamente, em
forçar um fluido (fase móvel), transportando a amostra, através de uma fase estacionária
sólida e imiscível com o fluido. Nisso, as susbstâncias presentes na amostra poderão interagir
com a fase estacionária. Quanto mais uma substância interage com a fase estacionária, mais
ela ficará retida nessa fase, e terá, portanto, um deslocamento mais lento no fluxo da fase
móvel. Analogamente, uma substância que pouco interage com a fase estacionária terá um
deslocamento mais rápido no fluxo da fase móvel. Como cada substância presente na amostra
interage de maneira diferente com a fase estacionária, elas apresentarão diferenças na sua
mobilidade. Estas diferenças fazem com que se dividam em bandas discretas durante a análise
cromatográfica, as quais podem ser separadas e analisadas qualitativa ou quantitativamente.
Os métodos cromatográficos podem ser classificados de duas maneiras: quanto ao
estado físico do fluido da fase móvel e quanto ao meio físico utilizado como suporte para a
fase estacionária. Na classificação em relação ao estado do fluido, há três diferentes grupos:
cromatografia líquida, quando o fluido da fase móvel está no estado líquido; cromatografia
gasosa, quando o fluido da fase móvel é um gás; cromatografia com fluido supercrítico,
quando a fase móvel é constituída de fluido supercrítico. Já na clasificação quanto ao meio
físico utilizado, podem ser distiguidos dois grupos: cromatografia em coluna, quando a fase
estacionária está empacotada em uma coluna cromatográfica; e cromatografia planar, quando
a fase estacionária se apoia em um placa plana.

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Inserida no grupo de cromatografia líquida em coluna, há uma técnica que se destaca
pela sua sofisticação, denominada cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Neste
tipo de cromatografia, há uma grande diminuição do tamanho das partículas da fase
estacionária – são empregadas partículas com diâmetro de 3 a 10 μm, enquanto nas técnicas
mais antigas o diâmetro varia de 150 a 200 μm. Isso garante maior superfície disponível para
interação da fase estacionária com a amostra, gerando um grande aumento na eficiência da
técnica de análise. Além disso, o cromatógrafo HPLC opera a altas pressões, visando ao
aumento da eficiência e da velocidade da análise cromatográfica. Dessa maneira, a técnica de
HPLC permite realizar análises cromatográficas com quantidades muito reduzidas de amostra
(da ordem de microlitros).
Neste experimento, a técnica de HPLC foi empregada para determinar o teor de
cafeína presente em um comprimido de Dorflex®. O teor de cafeína informado pelo
fabricante é de 50 mg/comprimido. É esperado que valor encontrado na análise seja próximo
ao descrito pelo fabricante, visto que, em medicamentos, o controle de qualidade deve ser
rigoroso.
3- OBJETIVOS
 Quantificar o teor de cafeína presente em um comprimido de Dorflex® por meio da
técnica de HPLC;
 Familiarizar-se com a técnica de análise utilizada.
4- MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais
 Cromatógrafo Dionex UltiMate 3000- Coluna.
 Coluna HPLC Acclaim® Polar Advantage II (C18 – 5µm – 4,6 x 250mm).
 Soluções padrão de cafeína preparada a partir de uma cápsula de cafeína com teor de
cafeína declarado de 300mg/cápsula, dissolvido em 1000mL de água (q.s.p.).
 Solução de cafeína preparada a partir de um comprimido de Dorflex®, com teor de
cafeína declarado de 50mg/comprimido, dissolvido em 1000mL de água (q.s.p.).
Métodos
Inicialmente, configurou-se o cromatógrafo com os seguintes parâmetros:

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 Vazão: 0,7mL/min
 Volume de injeção: 10µL
 Tempo de retenção: 6-7 minutos
 Temperatura do forno da coluna: 35°C
 Comprimento de onda: 273nm
Observa-se que o comprimento de onda utilizado está na região ótima de absorção da
cafeína. A fase móvel utilizada foi uma solução 40% metanol e 60% água. A próxima tarefa
foi a calibração do cromatógrafo, para posterior determinação do teor de cafeína de um
comprimido de Dorflex®. Fez-se a calibração utilizando-se uma solução mãe elaborada a
partir de uma cápsula de cafeína, com teor de cafeína declarado de 300mg/cápsula (valor que
se assumiu estar correto), dissolvido em água (q.s.p.). Fez-se quatro padrões, utilizando-se as
seguintes concentrações de cafeína:
 Padrão 1: diluição da solução mãe em água (100 µg/mL).
 Padrão 2: diluição da solução mãe em água (75 µg/mL).
 Padrão 3: diluição da solução mãe em água (50 µg/mL).
 Padrão 4: diluição da solução mãe em água (25 µg/mL).
As soluções acima foram utilizadas para gerar as curvas de calibração, sendo que cada
amostra gerava um pico de absorbância característico de sua concentração. Dessa forma, ao se
obter a curva de absorbância da amostra, poderia-se determinar sua concentração com base na
comparação com as curvas dos padrões. Pode-se observar que a área sob o pico e sua altura
são proporcionais à concentração da amostra.
Finalmente, fez-se a análise da amostra. Preparou-se a amostra a partir de um
comprimido de Dorflex®, com teor de cafeína declarado de 50mg/comprimido, dissolvido em
1000mL de água (q.s.p.). É fácil verificar que a concentração esperada é de 50 µg/mL. A
curva de absorbância obtida foi salva para posterior comparação com as curvas das amostras
padrão, objetivando determinar a concentração amostral de cafeína.
5- RESULTADOS E DISCUSSÃO
Obtiveram-se os seguintes resultados para os padrões e as amostras, com respectivas
alturas dos picos e áreas sob estes:

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Gráfico 1 – Padrão 1 de cafeína
Altura: 649,643 mUA Área: 78,362 mUA x min Concentração: 92,5582 µg/mL
Gráfico 2 – Padrão 2 de cafeína
Altura: 528,495 mUA Área: 63,651 mUA*min Concentração: 75,1821 µg/mL

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Gráfico 3 – Padrão 3 de cafeína
Altura: 404,408 mUA Área: 48,793 mUA*min Concentração: 57,6323 µg/mL
Gráfico 4 – Padrão 4 de cafeína
Altura: 272,954 mUA Área: 32,981 mUA*min Concentração: 38,9559 µg/mL

7. 7
Gráfico 5 – Solução de Dorflex com concentração teórica de cafeína de 50 µg/mL
No gráfico da amostra, registrou-se um segundo pico, de menor intensidade e tempo
de retenção (5,81 minutos) menor que o da cafeína (6,82 minutos, conforme os gráficos das
soluções padrões). Portanto, será considerado apenas o maior pico, para o qual:
Altura: 332,271 mUA Área: 41,487 mUA*min
De modo a obter uma curva de calibração para a concentração de cafeína, realizou-
se a regressão linear (Gráfico 6) a partir das alturas de cada pico obtido para as soluções
padrões.
Gráfico 6 – Curva de calibração

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A equação obtida a partir da regressão linear foi:
Y = 0,00010 + 1,18116 * X
sendo Y = concentração de cafeína em µg/mL e X = Área em mUA*min.
Subtituindo-se o valor da altura do pico da amostra em estudo, tem se que a
concentração de cafeína na solução é Y = 49,00288 µg/mL. A partir deste resultado, conclui-
se que o teor de cafeína no comprimido de Dorflex® analisado é de aproximadamente
49 mg/comprimido.
Como a concentração téorica da cafeína na solução da amostra era de 50 µg/mL, o
resultado mostrou experimentalmente que a concentração real de cafeína se aproximou muito
deste valor.
6- CONCLUSÃO
O método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência estudado mostrou-se eficaz na
quantificação da cafeína no comprimido de Dorflex®, uma vez que o resultado obtido para o
teor de cafeína (49 mg/comprimido) foi muito próximo do valor declarado pelo fabricante do
produto (50 mg/comprimido). Dessa forma, constata-se também que as curvas de calibração
são uma ferramenta eficaz e segura para se tratar os dados fornecidos pela cromatografia.
A partir desse experimento foi possível, então, compreender o funcionamento de um
cromatógrafo, aprofundar os conhecimentos sobre a técnica de cromatografia e os
fundamentos físicos-químicos envolvidos. E ainda, aplicar os métodos adequados de análise
dos cromatogramas de forma a alcançar o objetivo proposto.
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SKOOG, D. G.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A. Princípios de Análise Instrumental. 5 ed.
Porto Alegre: Bookman, 2002.