O documento discute o preparo de amostras para cromatografia por extração em fase sólida (SPE). A SPE é uma técnica que permite isolar e concentrar analitos de uma matriz complexa, removendo interferências. Ela requer menos solventes do que métodos tradicionais como extração líquido-líquido. O documento descreve os principais parâmetros e etapas da SPE como condicionamento, percolação, lavagem e eluição para separar analitos dos interferentes e concentra-los antes da análise cromatográfica.

1. Universidade do Estado do Rio de JaneiroUniversidade do Estado do Rio de Janeiro
PREPARO DE AMOSTRAS PARAPREPARO DE AMOSTRAS PARA
CROMATOGRAFIA POR SPE (SOLIDCROMATOGRAFIA POR SPE (SOLID
PHASE EXTRACTION)PHASE EXTRACTION)
Fernanda de Oliveira CordeiroFernanda de Oliveira Cordeiro
Gabriela Werneck RöheGabriela Werneck Röhe
Luiz Antonio Moreira de FariaLuiz Antonio Moreira de Faria
Professor: AlexsandroProfessor: Alexsandro Araújo da silvaAraújo da silva

2. IntroduçãoIntrodução
A matriz, tal qual se encontra ou é produzida
pode interferir na análise cromatográfica de
várias e a fim de evitar ou mesmo eliminar os
problemas, uma parte extremamente
importante é o preparo da mesma, antes da
análise. Os problemas mais comuns são:
• Amostra muito “suja” – contém outros
componentes na matriz que interferem com a
análise.
• Amostra muito diluída – os analitos não estão
concentrados suficientemente para permitir a

3. Principais fontes de erro em cromatografiaPrincipais fontes de erro em cromatografia

4. Tempo gasto para análiseTempo gasto para análise
O preparo da amostra é uma das partes mais
importantes do processo analítico, uma vez
que, se bem executado minimiza os erros,
melhorando a resolução no cromatograma.
Portanto, uma gasto maior de tempo no preparo
da amostra pode economizar muito tempo em
todas as outras etapas.

5. Benefícios do preparo da amostra antesBenefícios do preparo da amostra antes
da cromatografiada cromatografia
- Tornar a matriz compatível com a fase móvel e o detector;
- Proteger o sistema e coluna cromatográfica de contaminação por
partículas e material de elevado peso molecular;
- Remover interferências simplificando a extração;
- Diminuir o tempo de análise;
- Aumentar o limite de carga/ sensibilidade;
- Aumentar o tempo de vida útil da coluna;
- Diminuir os gastos com manutenção do equipamento;
- Minimizar problemas operacionais;
- Concentrar componentes de interesse;
- Aumentar a sensibilidade da análise;
- Aumentar a reprodutibilidade.

6. Cartuchos para SPECartuchos para SPE
CARTUCHO PARA SPE: seringa de polipropileno ou de vidro,
contendo uma pequena quantidade de material sorvente ou
adsorvente finamente granulado

8. Condicionamento:
Passagem de pequeno
volume de solvente
apropriado para umedecer o
sorvente (grupos funcionais
ligados) e garantir interação
consistente
Percolação e lavagem:
Esta etapa tem como
objetivo trazer os analitos
para uma concentração
adequada para a detecção e
desta forma, algumas
técnicas de preparo de
amostras tipicamente
incluem o enriquecimento do
analito

9. Método ideal para preparo de amostraMétodo ideal para preparo de amostra
(SPE)(SPE)
Volume Vam
da amostra
contendo n gramas de
analito e concentração =
Cam
Separar analitos quantitativamente
dos interferentes da matriz
Cromatografar a porção concentrada
e limpa de analito – CG / CLAE
nn g de analito concentrados em um
volume Vam
Vfinal
<< Vam
Cfinal
>> Cam

10. Em condições ideais, a partir de uma matriz complexa e com
interferentes, separa-se quantitativamente os interferentes,
concentra-se o analito e em seguida realiza-se a análise.
Na teoria, este processo poderia parecer simples, porém
devido à complexidade de algumas amostras, a separação desses
interferentes e/ou a concentração do analito pode requerer
técnicas precisas e há a necessidade de realizá-las com bastante
atenção.
Um exemplo disso é a determinação de resíduos de agrotóxicos
em diferentes matrizes, que é tradicionalmente realizada
utilizando-se técnicas cromatográficas, em função de sua
capacidade de separação, identificação e quantificação dos
compostos através de detectores apropriados.

11. A determinação de agrotóxicos em água geralmente requer um
pré-tratamento da amostra, pois caso as interferências não sejam
removidas poderão afetar a identificação e a quantificação. O pré-
tratamento inclui o isolamento e a pré-concentração dos analitos.
Métodos tradicionais de preparo da amostra, tal como a
extração líquido-líquido (LLE - Liquid-Liquid Extraction), requerem
grandes volumes de solventes orgânicos, apresentam custo
elevado, são de difícil automação e trabalhosos.
Nesse sentido, novas técnicas que consomem menos tempo
são efetivas e requerem uma menor quantidade de solventes vêm
sendo desenvolvidas e aplicadas para extração de agrotóxicos em
amostras aquosas. Dentre estas técnicas, destacam-se aDentre estas técnicas, destacam-se a
extração em fase sólida (SPE -extração em fase sólida (SPE - Solid Phase ExtractionSolid Phase Extraction).).

12. Métodos tradicionais de preparo da amostra, tal como a
extração líquido-líquido (LLE - Liquid-Liquid Extraction),
necessitam de grandes volumes de solventes, apresentam alto
custo, são trabalhosos e de difícil manipulação.
As novas técnicas consomem menos tempo, requerem uma
menor quantidade de solventes, são mais efetivas e vêm sendo
desenvolvidas e aplicadas para extração de vários analitos, dentre
eles, os agrotóxicos em amostras aquosas. Uma técnica que se
destaca é a extração em fase sólida (SPE - Solid Phase
Extraction).
A SPE foi foi desenvolvida no início dos anos 70 e foi
disponibilizada comercialmente em 1978, na forma de cartuchos
descartáveis.

13. Essa técnica para separação líquido-sólido é baseada nos mecanismos
de separação da cromatografia líquida de baixa pressão e é empregada
com a finalidade de isolar analitos presentes em uma matriz complexa.
Como exemplo, podemos isolar e pré concentrar agrotóxicos em uma
amostra aquosa, que é percolada através de um cartucho contendo o
sorvente, de forma que os analitos sejam retidos (extração exaustiva) e
em seguida há a eluição do analito com uma quantidade pequena de um
solvente orgânico adequado. É possível também utilizar discos
impregnados com sorventes, para realizar a separação.
A SPE apresenta uma instrumentação muito simples, como identificada
no esquema abaixo, podendo porém, ser sofisticada, dependendo do
problema a ser resolvido e do grau de automação desejado. As etapas do
processo são, inicialmente a ativação da substância utilizada como
sorvente percolação da amostra/sorção dos analitos no sorvente,
eliminação dos interferentes da matriz (clean up), eluição dos analitos
seguido da concentração do composto de interesse.

14. Alguns parâmetros importantes a serem considerados, são volume de
amostra, tipo e volume de solvente de ativação do sorvente e de eluição
do analito e a escolha do sorvente.
É necessário um conhecimento dos interferentes a serem eliminados e
os analitos que se quer concentrar para a escolha dos solventes,
normalmente por diferenças de polaridade. Os sorventes mais utilizados
em cartuchos ou discos de SPE são, em fase sólida, C8, C18, carbono
grafitizado, resina trocadora iônica e materiais poliméricos, tal como
estireno divinilbenzeno.
Nas análises ambientais, especialmente nas análises de agrotóxicos
em meio aquoso, o mais comum é a utilização de sorventes hidrofóbicos
não seletivos. Eles são capazes de diferenciar e isolar analitos de
interesse dos interferentes presentes na matriz, antes da análise
cromatográfica.

15. Sorventes poliméricos são muito utilizados para separação de
agrotóxicos da classe das sulfunilureias, enquanto a C18 é utilizado
na separação de herbicida e inseticidas organoclorados. Massa de
sorvente varia entre 25 mg e 10 g.
Durante o acondicionamento do cartucho é feito com a ativação
do sorvente e a escolha do solvente depende do tipo de sorvente
escolhido (C8, C18, ciano, sílica, amino, entre outros). Nesta
etapa, também é feita a eliminação de possíveis impurezas
presentes no sorvente dentro do cartucho.
No processo de concentração do analito, o principal objetivo é
reter este material do cartucho, utilizando grande volume de
amostra, de modo a permitir a eliminação dos interferentes

16. O ajuste do pH se faz importante, uma vez que ele pode estabilizar os
agrotóxicos e aumentar sua interação com o sorvente.
A velocidade de eluição da amostra é outro parâmetro que deve ser
ajustado, controlando-se o vácuo ou a pressão utilizada no processo. Num
volume reduzido de amostra, pode ser utilizada a ação da gravidade para
a etapa de eluição.
Os compostos presentes originalmente na matriz que pode funcionar
como interferentes devem ser retirados numa etapa conhecida como clean
up, utilizando solventes de força intermediária de forma que apenas eles
sofram eluição, enquanto o analito de interesse ainda fique retido na fase
estacionária (sorvente), tendo pouca ou nenhuma interação com os
solventes utilizados nessa etapa.
Esses solventes de lavagem recebem o nome de wash solvent -
“solventes de lavagem”. No exemplo da extração dos agrotóxicos, o mais
comum é a utilização de água ultrapura ou uma mistura dessa mesma
água com metanol de alta pureza.

17. Numa nova etapa, um novo solvente deve ser escolhido de modo
que faça uma eluição eficiente do analito, porém não ocorra a eluição
dos interferente que, por ventura tenham ficado retidos no sorvente.
Essa escolha está diretamente ligada à polaridade do analito, nesse
exemplo, os agrotóxicos de interesse.
Os solventes mais comuns utilizados para os analitos citados como
exemplo, são acetona, acetato de etila, hexano e as misturas de
metanol-acetonitrila, acetato de etila-diclorometano, metanol-acetona, e
metanol-metil terbutil éter.
Uma outra utilização para a técnica SPE é quando a análise é feita
distante do local de coleta da amostra. Neste caso, pode ser feita a
separação e a pré-concentração da amostra no local da coleta e os
cartuchos então são transportados contendo o analito, sendo
armazenado em temperatura controlada, normalmente baixa, até que se
possa proceder a análise do composto, propriamente dita.

18. Os cartuchos comerciais de SPE são encontrados com
diferentes tipos de sorvente, com diferentes quantidades e
granulação dos mesmos. O tamanho do cartucho também pode
levar em conta o volume de amostra a ser tratado.
As propriedades fisico-químicas dos compostos de interesse
na matriz assim como seus interferentes também devem ser
levados em conta na hora de escolher o cartucho mais adequado.
Entre os mais usados estão cartuchos contendo 200 e 500 mg de
sorvente.
Existe a possibilidade de fazer a SPE on line, acoplada a
técnicas analíticas, de forma a não ter que se transferir
manualmente o cartucho para o cromatógrafo, e desta forma
minimizar uma fonte de erro.

19. Quando se faz opção pela configuração on-line, a SPE faz parte
de um sistema cromatográfico, conectado em conjunto, numa técnica
de comutação de colunas, onde o eluente de uma coluna é desviado
para outra coluna de modo que a primeira apresente uma baixa
eficiência, fazendo um enriquecimento ou pré-concentração do
analito na amostra, seguida de uma coluna de alta eficiência, na qual
a análise ocorre de forma efetiva.
Hoje se pode optar pelo uso de cartuchos ou discos, cujas
vantagens e desvantagens se relacionam com o número, a natureza
e o volume de amostra a ser processada. Os cartuchos ainda são os
mais utilizados, mas desde meados dos anos 90, os discos
começaram a ser introduzidos para a preparação de amostras pela
SPE.

20. Os discos apresentam tamanho de partículas entre 5 e 10 μm e 6
nm de diâmetro do poro, entremeadas com politetrafluoretileno
(PTFE) ou vidro, cuja espessura está em torno de 0,5 mm e diâmetro
entre 47 e 90 mm contendo cerca de 500 mg de sorvente.
São colocados em um sistema semelhante ao de filtração de
solventes, de modo que um vácuo é aplicado forçando a amostra a
percolar todo o sistema.
Por apresentarem pequena espessura e grande área, os discos
apresentam uma maior velocidade na extração e uma manutenção da
eficiência.
Por terem leito mais homogêneo, uma outra vantagem é a utilização
de menores pressões durante aplicação da amostra.

21. No caso dos cartuchos empacotados, há uma eluição não
homogênea, com um fluxo que varia ao longo do mesmo reduzindo
a capacidade de sorção da fase estacionária, reduzindo a precisão e
a exatidão nos resultados.
Atualmente, polímeros de estireno divinil benzeno, utilizados nos
discos para SPE, estão sendo utilizados na extração de compostos
orgânicos em amostras de água.
Depois de concentrados, a eluição do analito pode ser feita com
pequenos volumes de solvente, entre 30 a 100 μL, o que possibilita
a uma injeção direta no sistema cromatográfico.
Como o tamanho das partículas é menor, melhora a transferência
de massa, tornando o processo ainda mais rápido.

22. Como desvantagem, vazões elevadas demais podem diminuir a
recuperação do analito de interesse.
Também pode se levar em conta a variação entre os diferentes
fabricantes e mesmo as diferenças entre os lotes, podem
impossibilitar tratamento de grandes volumes de amostra, mantendo
uma boa reprodutibilidade.
Outro problema é a possibilidade de obstrução, tanto dos discos,
quanto dos cartuchos, por macromoléculas oi ainda de material
particulado.
Uma forma de minimizar este problema é uma prévia filtração da
amostra.
No caso dos discos, há ainda uma forma de aumentar a
seletividade ou capacidade dos discos, fazendo uma associação de
discos com diferentes sorventes ou até com mesmos sorventes.

23. Comparação entre os sistemas on-line e off-lineComparação entre os sistemas on-line e off-line

24. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICASREFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS