O documento resume os principais métodos imunodiagnósticos para detecção de doenças infecciosas, incluindo diagnóstico direto, métodos sorológicos como precipitação, aglutinação, imunofluorescência e testes enzimáticos como ELISA. Limitações dos testes sorológicos e fatores a serem considerados na pesquisa de antígenos também são discutidos.

1. Imunodiagnóstico de doenças
infecciosas
Sandra do Lago Moraes
Pesquisadora Científica
Instituto de Medicina Tropical
Universidade de São Paulo

2. DIAGNÓSTICO DE CERTEZA
DE UMA INFECÇÃO
demonstração direta do patógeno ou
de seus produtos nos tecidos ou fluidos
biológicos dos hospedeiros e/ou
presença de sintomas clínicos definidos

3. MÉTODOS IMUNOLÓGICOS
DIRETOS OU INDIRETOS
Amplamente usados na pesquisa de
antígenos, anticorpos ou imunocomplexos
 Rapidez
 Simplicidade
 Possibilidade de automação
 Baixo custo operacional

4. ANTICORPOS NO DIAGNÓSTICO INDIVIDUAL (#1)
 Elucidar processos patológicos com sintomas e
sinais clínicos confundíveis
 diferenciar a fase da doença
 diagnosticar doença congênita
 selecionar doadores de sangue
 selecionar doadores e receptores de órgãos para
transplantes

5. ANTICORPOS NO DIAGNÓSTICO INDIVIDUAL (#2)
 avaliar o prognóstico da doença
 avaliar a eficácia da terapêutica e
suspensão da terapêutica
 avaliar a imunidade específica naturalmente
adquirida ou artificialmente induzida
 verificar o agravamento da patologia

6. ANTICORPOS EM INQUÉRITOS
SOROEPIDEMIOLÓGICOS
Estabelecer a prevalência da doença
Verificar a erradicação da doença
Verificar a reintrodução de novos casos em
áreas consolidadas

7. PESQUISA DE ANTÍGENOS
Como critério de cura
Na definição da etiologia da doença
Na seleção de doadores de sangue
Em inquéritos epidemiólogicos

8. LIMITAÇÕES DOS TESTES SOROLÓGICOS #1
 Dependem da capacidade de resposta imune
do hospedeiro
 Genética
 Estado de nutrição
 Integridade dos mecanismos de resposta
imunológica

9.  Ubiqüidade dos determinantes antigênicos
 Reação cruzada (anticorpos heterófilos,
antígenos semelhantes, experiência
imunológica do hospedeiro com estímulos
antigênicos variados)
LIMITAÇÕES DOS TESTES SOROLÓGICOS #2

10.  Interferentes não específicos
 Detergentes
 Solventes orgânicos
 pH
 Cromógenos endógenos
 Inibidores enzimáticos
LIMITAÇÕES DOS TESTES SOROLÓGICOS #3

11. FATORES DO ANTÍGENO ALVO QUE
DEVEM SER CONSIDERADOS NA
PESQUISA DE ANTÍGENOS
 não persistência na circulação na ausência do
parasita
 ser abundante
 não apresentar grande diversidade genética
 ser estruturalmente diferente de antígenos
encontrados no sangue

12. MANIFESTAÇÕES DAS REAÇÕES
ANTÍGENO-ANTICORPO
• Reação Primária
ligação dos grupos reativos da molécula
antigênica com um de dois sítios de
combinação da molécula de anticorpo
• Reação Secundária
visibilização direta ou com auxílio de lupas
da precipitação ou da aglutinação
• Reação terciária
expressão biológica da interação Ag-Ac

13. TÉCNICAS SOROLÓGICAS
• Testes de complemento
teste de hemólise
fixação de complemento
• Neutralização
Dependentes da reação terciária

14. TÉCNICAS SOROLÓGICAS
• Precipitação
• Aglutinação
Dependentes da reação secundária

15. TÉCNICAS SOROLÓGICAS
• Imunofluorescência
• Radioimunoensaio
• Enzimaimunoensaios
Dependentes da reação primária
(técnicas com reagentes marcados)

16. PRECIPITAÇÃO
• EM MEIO LÍQUIDO
• EM MEIO SÓLIDO (ÁGAR)
Imunodifusão simples - unidimensional (Oudin)
- radial (Mancini)
Imunodifusão dupla - unidimensional (Oakley)
- radial (Ouchterlony)
Imunoletroforese
Imunoeletrodifusão
- unidimensional simples
- unidimensional dupla

17. AGLUTINAÇÃO
caracteriza-se pela formação de
agregados visíveis como resultado da
interação de anticorpos específicos e
partículas insolúveis que contêm
determinantes antigênicos em sua
superfície

18. AGLUTINAÇÃO
• 1o estágio: ligação dos anticorpos aos
antígenos de superfície, por meio de ligações
não-covalentes
• 2o estágio: resulta das colisões que ocorrem
entre as partículas, de modo que os
anticorpos ligados a uma partícula se ligam a
determinantes antigênicos de outra formam
pontes entre partículas
agregados visíveis a olho nu

19. FATORES QUE INTERFEREM NA FORMAÇÃO
DE AGREGADOS:
tipo do anticorpo (IgM é 750x mais eficiente que
IgG)
eletrólitos
pH (ideal entre 6,0 e 8,0)
macromoléculas hidrofílicas (em baixas
concentrações impedem a autoaglutinação)
enzimas (afastam reações inespecíficas)
tempo
temperatura
A
G
L
U
T
I
N
A
Ç
Ã
O

20. FENÔMENO DE PROZONA
falsos resultados negativos em soros com
elevado título de anticorpos aglutinantes
esse efeito é eliminado empregando-se
diluições seriadas do soro
A
G
L
U
T
I
N
A
Ç
Ã
O

21. AGLUTINAÇÃO DIRETA
ocorre com partículas que apresentam
determinantes antigênicos naturais em
sua superfície (Ex: hemácias, bactérias,
protozoários, fungos)

22. AGLUTINAÇÃO DIRETA
hemácias como antígeno:
tipagem de grupos sangüíneos do sistema ABO e Rh
(antígenos específicos)
reação de Paul-Bunnel-Davidson (antígenos
heterófilos)
antígenos íntegros ou fragmentados de bactérias,
espiroquetas, protozoários:
teste de Widal (salmoneloses)
teste de Wright (brucelose)
teste de Weil-Felix (rickettsiose)
teste de aglutinação para leptospirose, toxoplasmose e
tripanossomíase

23. INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO
DIRETA
baseia-se na capacidade que certos antígenos virais
têm de, espontaneamente, aglutinarem certos
tipos de hemácias. Os anticorpos, se presentes na
amostra, revestem as partículas virais, resultando
na inibição da aglutinação, indicando um teste
positivo para a presença de anticorpos
Exemplos: anticorpos contra os vírus da rubéola,
sarampo, influenza e certos enterovírus

24. AGLUTINAÇÃO PASSIVA OU
INDIRETA
Aglutinação de partículas inertes (látex,
poliestireno, bentonita, sepharose, colódio,
charcoal, etc.) ou células antigenicamente
não relacionadas (hemácias, bactérias,
leveduras) sensibilizadas com antígenos
solúveis

25. HEMAGLUTINAÇÃO PASSIVA
Hemácias possuem uma superfície complexa, o que
facilita a ligação de muitos antígenos
mais usadas: hemácias de carneiro ou humanas do
grupo O, fixadas com formaldeído ou
glutaraldeído(resolve o problema da fragilidade e
permite que sejam estocadas por longos períodos de
tempo)
Ags polissacarídicos aderem prontamente a hemácias
antígenos protéicos requerem pré-tratamento com
ácido tânico ou cloreto de cromo

26. INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO
PASSIVA
baseia-se na competição, pelos sítios de
combinação do anticorpo, entre o antígeno
fixado à hemácia e o antígeno solúvel ou o
hapteno.
O grau de inibição relaciona-se com a
quantidade do antígeno presente na
amostra e, também, com a afinidade pelos
sítios de combinação do anticorpo

27. AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX
Partículas de látex são esferas de
poliestireno que podem ser utilizadas como
suportes na adsorção de proteína solúvel e
antígenos polissacarídicos, funcionando
como sistema indicador da reação antígeno-
anticorpo

28. AGLUTINAÇÃO DO LÁTEX
 fator reumatóide
 antígenos polissacarídicos bacterianos
(Haemaphilus influenzae, Rickettsia sp,
estreptococos do grupo B, Staphylococcus aureus,
Neisseria meningitidis, etc., no soro, urina ou
líquor)
drogas e hormônios (-HCG)
anticorpos na rubéola
proteína C reativa
útil na pesquisa de:

29. AGLUTINAÇÃO DE CRISTAIS DE
COLESTEROL
O teste de VDRL (Venereal Disease Research
Laboratory) emprega cristais de colesterol
que são sensibilizados com lecitina e
cardiolipina, para a pesquisa de anticorpos
antilipídios na sífilis
formação de flóculos ( aglutinação??)

30. IMUNOFLUORESCÊNCIA
Baseia-se na capacidade de anticorpos/antígenos
se ligarem covalentemente a fluorocromos, sem
perder sua reatividade específica com o antígeno
antígeno/anticorpo
Fluorocromos- substâncias que absorvem luz em
comprimento de onda menor e quando excitadas
com luz UV emitem luz em comprimento maior
mais comuns: isotiocianato de fluoresceína,
lisamina-rodamina b

31. IMUNOFLUORESCÊNCIA
DIRETA
empregada na pesquisa e localização de antígenos em
células ou tecidos através de um anticorpo específico
marcado com fluorocromo
Ex.: Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum,
Legionella sp, Escherichia coli
Luz de
excitação
Luz
emitida

32. IMUNOFLUORESCÊNCIA
INDIRETA
Empregada na pesquisa de
anticorpos/antígenos. O antígeno fixado em
lâmina reage com um anticorpo específico e
o complexo Ag/Ac é revelado com conjugado
fluorescente (anti-Ig marcado)
Exemplos:
•pesquisa de antígenos: Plasmodium sp
•pesquisa de anticorpos: T. pallidum, T.cruzi,
CMV, Plasmodium sp, autoanticorpos

33. RADIOIMUNOENSAIO
anticorpo antígeno marcado+
não marcado (amostra)
medir
radioatividade
Método de competição com
antígeno marcado

34. antígeno
fase sólida
anticorpo marcado+
antígeno (amostra)
medir
radioatividade
Método de competição
com anticorpo marcado
RADIOIMUNOENSAIO

35. anticorpo antígeno (amostra) anti-antígeno
marcado
medir
radioatividade
Método de captura
RADIOIMUNOENSAIO

36. TÉCNICAS IMUNOENZIMÁTICAS
Baseadas na utilização de antígenos ou anticorpos
marcados com enzimas e permitem a detecção,
titulação e quantificação de substâncias de
interesse biológico

37. IMUNOPEROXIDASE
Enzima converte o componente cromógeno
(substrato + doador de hidrogênio) em produto
insolúvel, que precipita no sítio da reação
precipitado visível ao microscópio óptico comum
e eletrônico
(por ser eletrodenso)

38. ENZIMAIMUNOENSAIO
Método quantitativo em que a reação Ag-Ac é
monitorada pela medida da atividade enzimática
Homogêneo: não é necessária a separação entre os
complexos Ag-Ac e o Ag e/ou Acs, pois a atividade
da enzima não é alterada pela reação Ag-Ac
Heterogêneo: a atividade da enzima é alterada pela
reação Ag-Ac e a separação se faz necessária

39. Ensaios heterogêneos
peroxidase glicose oxidase
fosfatase alcalina anidrase carbônica
-galactosidase acetilcolinesterase
Ensaios homogêneos
lisozima ribonuclease A
malato desidrogenase  -galactosidase
glicose-6-desidrogenase
ENZIMAS MAIS UTILIZADAS
EM ENZIMAIMUNOENSAIOS:

40. EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay
(ELISA)
Princípio básico:
imobilização de um dos reagentes numa fase
sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado
a uma enzima, com preservação tanto da
atividade enzimática como da atividade
imunológica do Ac

41. ELISA
para pesquisa de anticorpos
antígeno
lavagem
anticorpo
(amostra)
E E
anti-imunoglobulina
marcada
lavagem
lavagem
E E
substrato
cromogênico
Método indireto

42. Método de Captura de IgM
lavagem
lavagem
lavagem
lavagem
anti-IgM IgM (amostra) antígeno anti-antígeno
marcado
E E
Substrato
cromogênico
E E
ELISA
para pesquisa de anticorpos

43. ELISA
para pesquisa de antígenos
Método de captura
anticorpo antígeno
(amostra)
E
E
anti-antígeno
marcado
E
E
substrato
cromogênico
lavagem
lavagem
lavagem

44. ELISA
para pesquisa de antígenos
Método de competição com anticorpo marcado
antígeno
E
E
E
antígeno (amostra) +
anticorpo marcado
E
substrato
cromogênico
lavagem
lavagem

45. ELISA
para pesquisa de antígenos
Método de competição com antígeno marcado
anticorpo
E
E
E
E
E
antígeno marcado
e não marcado (amostra)
E E
substrato
cromogênicolavagem
lavagem

46. Immunodot
(ou dot-ELISA, dot-immunobinding assay,
dot-blotting assay, dot-blot ELISA)
pequenas quantidades do imuno-reagente são
aplicadas como gotas em membrana de nitrocelulose
(fase sólida)
membranas de nitrocelulose adsorvem proteínas
com grande eficiência (praticamente 100%) (volumes
de 0,1 a 1 ml, contendo de 100 a 400 pg de imuno-
reagente, são suficientes)
simplicidade
rapidez
sensibilidade

47. Immunodot
enzimas mais utilizadas:
 peroxidase
 fosfatase alcalina
 glicose oxidase
substratos devem sob ação da enzima, originar um
precipitado colorido
para peroxidase: diaminobenzidina/H2O2 e 4-cloro-
1-naftol/H2O2)
outros sistemas de detecção: substratos fluorescentes
ou luminescentes, radioisótopos

48. Western blotting (Immunoblotting)
1a etapa: proteínas são separadas, de acordo com seu
tamanho, por eletroforese em gel de poliacrilamida,
contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
2a etapa: as proteínas separadas são transferidas
eletroforeticamente, do gel para uma membrana de
nitrocelulose, onde ficam imobilizadas, como uma
réplica do padrão de bandas do gel
3a etapa: a reação imunoenzimática é então processada
na membrana para identificação das proteínas
separadas e transferidas

49. Western blotting
pode ser empregado para:
determinar se há antígeno ou anticorpo em uma
amostra e qual é a sua especificidade
determinar se o preparado é puro ou não
determinar quais proteínas estão sendo reconhecidas
por um anticorpo
distinguir diferentes perfis de anticorpos, de acordo
com a fase da doença ou infecção, ou de acordo com a
presença ou não da infecção
diferenciar entre cepas patogênicas e não-
patogênicas, etc.

50. anodo
mistura de
antígenos
protéicos
catodo
migração
eletroforética
Western blotting
catodo
anodo
papel de filtro
membrana
gel
tampão de
transferência

51. Western blotting
reação antígeno-
anticorpo
Y Y
YY
Y
Y
Y
YY
Y
A B
reação com
conjugado
revelação com
substrato
cromogênico
Substrato
cromogênico
Y Y
YY
Y
Y
Y
YY
Y
YE
YE
YE
YE
YE
YE
YE
YE
YE
YE
A B
conjugado
A B
visualização dos
complexos
antígeno-anticorpo
formados

52. ENSAIOS QUIMIOLUMINESCENTES
Quimioluminescência: fenômeno em que se obtém
energia luminosa a partir de uma reação química gerada
como resultado da dissociação de ligações fracas (são
produzidos compostos intermediários em um estado
eletronicamente excitado que, quando retornam ao
estado de energia inicial, emitem luz
Imunofluorescência
A fonte de energia que
promove a excitação das
moléculas é uma
radiação incidente
Bioluminescência
A energia provém de uma reação
biológica, sendo a emissão de luz
facilitada por uma enzima (luciferase)
ou uma fotoproteína

53. VANTAGENS DA
QUIMIOLUMINESCÊNCIA
• Elevada sensibilidade de detecção: de atomol até
zeptomol (10-18 até 10-21 M)
• Linearidade da curva dose-resposta
• Rapidez (sinal é gerado em segundos)
• Custo (uso de pequenas quantidades de reagentes)
• Reagentes não perigosos e procedimentos simples
• Possibilidade de aumento da sensibilidade
(amplificadores)
• Possibilidade de aplicação em sistema
automatizados

54. ENZIMAIMUNOENSAIO
QUIMIOLUMINESCENTE
• Consiste na detecção da reação antígeno-
anticorpo utilizando uma enzima e uma
molécula sintetizada ou uma mistura de
moléculas que atuará como substrato para a
enzima e como emissor de luz
• Substratos quimioluminescentes da peroxidase:
luminol, isoluminol, polifenóis, ácido gálico,
umbiliferone

55. ENZIMAIMUNOENSAIO
QUIMIOLUMINESCENTE COM
NANOPARTÍCULAS
• Nanopartículas são mais estáveis, mais baratas e
de mais fácil purificação
• Ex. de ouro coloidal, que podem ser facilmente
preparadas em uma gama de tamanhos, de 2 a
100 nm

56. WESTERN BLOTTING
ENZIMAIMUNOENSAIO
QUIMIOLUMINESCENTE
• A emissão de luz é detectada com um filme
fotográfico ou de raios X
IMMUNODOT QUIMIOLUMINESCENTE

57. ENSAIOS IMUNOCROMATOGRÁFICOS
Podem ser encontrados em quatro formatos
B. “dipstick”
C.cartão
D.híbrido
A1 A2
C2C1
S ST
A.cassete

58. TÉCNICAS EMPREGADA NA
AUTOMAÇÃO
• Nefelometria
• Turbidimetria
• Enzimaimunoensaio
• Imunoensaio quimioluminescente
• Imunoensaio fluorescente (heterogêneo/
homogêneo)
• Imunoensaio de polarização de fluorescência
• Imunoensaio fluorescente de tempo controlado
• Enzimaimunoensaio fluorescente

59. ENSAIOS MULTIPARAMÉTRICOS
• Possibilitam a realização de múltiplos ensaios
em um único tubo, com a mesma amostra e ao
mesmo tempo
• Duas plataformas principais
• Microarranjos com proteínas ligadas (chips)
• Microarranjos com micropartículas (suspensão)

60. SINAL
Expressão de um teste sorológico que resulta
da integração de um número variável de
impulsos elementares, cada um destes
correspondendo à reação de uma molécula de
anticorpos com o determinante antigênico para
o qual mostra afinidade

61. RUÍDO
impulsos resultantes de reatividade
inespecífica e que interferem na capacidade
discriminativa do teste
Ideal:
SINAL>>>> RUÍDO

62. LIMIAR DE DETECÇÃO
número de impulsos necessários para
desencadear o sinal. Varia entre as
diferentes técnicas imunológicas