Virologia Clínica Parte 4 Diagnóstico Laboratorial [Profa.Zilka]

MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
MICROBIOLÓGICO E SOROLÓGICO
EMPREGADO NO DIAGNÓSTICO DE
INFECÇÕES VIRAIS
Professora Zilka Nanes Lima
Especialização em Microbiologia

Referências
• Aula predominante retirada dos seguintes livros:
 Santos, N.S.de O.; Romanos, M.T.V.; Wigg, M.D. Introdução à Virologia
Humana. 2ª edição. Editora Guanabara Koogan. Rio de Janeiro - RJ, 2008.
 Koneman et al. Diagnóstico Microbiológico. Texto e Atlas Colorido : 6ª
Edição São Paulo, SP. Panamericana, 2008.
 Jawets, Melnick e Adelberg. Microbiologia Médica. 25ª Edição. Ed.
ArtMed. Porto Alegre – RS, 2012.
 Levinson, W. Microbiologia Médica e Imunologia. 13ª Edição. Ed. ArtMed.
Porto Alegre – RS, 2016.
 Declaro que não há conflito de interesses. (Professora Zilka Nanes Lima)
Professora Zilka Nanes / Virologia Clínica 2

HISTÓRICO
A medicina virológica começou em 1898 
Loeffler e Frosh  descobriram que doença
dos pés e boca no gado era causada por vírus.
Em 1892, Guarnieri descreveu inclusões
intranucleares em tecidos com vírus da
varíola.
No final do século XX aumentou o número de
doenças atribuídas ao virus.
Primeiro método utilizado foi o sorológico.
Em 1929 Bedson e Bland  teste de fixação
do complemento detectar anticorpos contra
vírus vacínia e varicela-zoster.
Weller e Enders em 1948  Primeiro
isolamento de patógenos virais humanos
em cultura de células  até hoje é método
gold standard para o diagnóstico.
Em 1970 desenvolveu-se anticorpos
monoclonais  produção reagentes com
alta especificidade na década de 80.
Em 1985 - PCR  introdução de técnicas
moleculares  final de 1990 – PCR em
tempo real.

MÉTODOS USADOS EM VIROLOGIA
1. Isolamento e identificação do vírus
2. Sorologia para detecção de antígenos e/ou
anticorpos
3.Detecção direta da partícula viral
4.Amplificação de ácidos nucléicos virais.
Professora Zilka Nanes / Virologia Clínica Fonte: adaptado de Santos , Romanos, Wigg, 2008. 4
As técnicas utilizadas para o diagnóstico laboratorial de uma virose pode ser
realizada com base em quatro parâmetros:

Tipos de materias para exame virológico
Local da lesão MC* para propagação viral MC* para exame direto
Trato respiratório Lavado de garganta, aspirado de
nasofaringe (crianças)
Aspirado de nasofaringe, lavado de
garganta
Sistema nervoso Central Liquor., sangue (arbovírus), fezes ou
swab retal, lavado de garganta
biópsia cerebral
Biópsia cerebral, liquor, esfregaço de
fragmentos de corno de Ammon no
hipocampo (raiva)
Trato entérico Fezes Fezes
Sistema cardiovascular Fezes Biópsia de tecido cardíaco
Pele Líquido de vesículas ou pústulas,
raspado de úlceras ou crostas, fezes,
swab de garganta
Líquido de vesícula ou pústula,
raspado de úlceras, crostas
Olhos Swab conjuntival Esfregaço conjuntival (clamídias)
Fígado Sangue (isolamento de vírus da febre
amarela)
Soros (HBsAg), fezes (hepatite A e E.
Infecções congênitas Lavado de garganta, placenta
(rubéola e CMV)
Biópsia de tecido do feto (CMV)
Febres de origem desconhecida Sangue heparinizado, lavado de
garganta, fezes e urina recente
Não descrito
Professora Zilka Nanes / Virologia Clínica *Material coletado Fonte: adaptado de Santos;Romanos;Wigg, et al., 2008. 5

ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS
 Isolamento  cultura em sistemas hospedeiros obrigatoriamente
vivos. O primeiro passo é a cultura.
1. Propagação viral em animais de laboratório
(atualmente usado para vírus da raiva e alguns coxsackievírus do
grupo A  camundongos – via intraperitoneal ou intracerebral)
(vírus humanos não-cultiváveis em outros sistemas  chimpazés)
2. Propagação viral em ovos embrionados
(vírus aviários, vírus da influenza, e para produção de alguns tipos
de vacinas).
3. Propagação de viral em cultura de células
Morfologia da células: do tipo epitelial (epitelióides) e células do
tio fibroblástico (fibroblastóides). – poliovírus, e muitos outros.

Cultura de células
Alguns vírus e células de escolha para o seu isolamento
Vírus Célula (Nota)
Enterovírus MA-104, GMK
Rotavírus MA-104, Vero
Adenovírus HeLa, H´p-2, A549, KB, MRC-5
Alfavírus Vero, A549, MRC-5
Vírus herpes simples Vero, Hep-2, MRC-5, HeLa, WI-38
Vírus da influenza MDCK, HuH7, IMR-32, GBM8401
Professora Zilka Nanes / Virologia Clínica Fonte: adaptado de Santos; Romanos ; Wigg, 2008. 7
Nota: MA-104 e GMK (rim de macaco verde africano);
Vero (rim de macaco-verde);
HeLa (carcinoma de cérvix uterino humano);
Hep-2 (carcinoma de laringe humana);
A-549 (carcinoma de pulmão humano);
KB (carcinoma epidermóide humano);
MRC-5 E WI-38 (pulmão de embrião
humano);
MDCK (rim de cachorro);
HuH7 (hepatocarcinoma humano);
IMR-32 (neuroblastoma humano);
GBM8401 (glioblastoma humano).

ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE VÍRUS
 Identificação  Após crescimento do vírus
1. Depois de cultura em animais de laboratório
Identificação – verificar desenvolvimento de sintomas em 15 dias
2. Depois de cultura em ovos embrionados
Identificação – técnica de hemaglutinação (HA)/ Reações
sorológicas com soros padrões. / Visualização de pocks (pústulas que
são lesões esbranquiçadas e/ou hemorrágicas na membrana
corioalantóica).
3. Depois da cultura em células
Identificação – efeito citopático (CPE), refere-se a alterações na
morfologia em células individuais ou grupos de células induzidas pela
infecção viral.

Cultura de células

CULTURA DE VÍRUS - IDENTIFICAÇÃO
Identificação após a cultura em ovos
Pocks = pústulas, lesões hemorrágicas
na membrana corioalantóica.
Identificação após
cultura em células
Efeito citopático

Identificação de vírus / Reação de hemaglutinação (HA)
- Não é uma reação sorológica, porque não envolve a ligação antígeno-anticorpo.
- Usado para detectar vírus hemaglutinantes (Fonte: Santos;Romanos;Wigg, 2008)

DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO
Envolve ligação antígeno-anticorpo
 Aglutinação passiva ou pelo látex
 Inibição de Hemaglutinação
 Imunofluorescência (direta e indireta)
 Imunoperoxidade (IP)
 Imunoenzimático (ELISA ou EIA)
 Immunoblotting (Western blotting)

Aglutinação passiva ou pelo látex
- Pesquisa de anticorpos heterofílos da mononucleose.

Aglutinação pelo látex (MONONUCLEOSE)

Hemaglutinação indireta (HI)
- A capacidade de hemaglutinação de um vírus é bloqueada quando esse vírus
reage com o anticorpo específico.
Sem o vírus
Com o vírus: Etapa 1 – Anticorpo + vírus
Etapa 2 – Não tem a reação com o antígeno na hemácia
Etapa 3 – Inibição da aglutinação
 Leitura do teste quando
não se utiliza o vírus.

Imunofluorescência
- Utiliza anticorpos marcados com corantes fluorescentes para revelar a formação de
imunocomplexo vírus-anticorpo.
- Os anticorpos são chamados de conjugados.
- Corante mais usado em virologia é o isotiocianato de fluoresceína (verde-amarelada).
- Leitura em microscópio de fluorescência
Imunofluorescência direta (IFD)
- Conjugado é adicionado a células infectadas por vírus que estão fixadas numa lâmina
de microscópio. Se houver a formação do complexo antígeno-anticorpo, observa-se no
microscópio a fluorescência.
Imunofluorescência indireta (IFI)
- Etapa 1: Anticorpos não-marcados são adicionados a células infectadas fixadas em
lâmina de microscópio.
- Etapa 2: É adicionado anti-imunoglobulina conjugado com fluorescência.

Imunofluorescência

Imunoperoxidase
- A reação envolve o uso de anticorpos marcados com a enzima peroxidase.
- Peroxidases são um grupo de enzimas oxirredutases que oxidam substratos
orgânicos, tendo o peróxido de hidrogénio como molécula aceitadora de elétrons.
S= substrato
S reduzido + H2O2 (peroxidase + cofator) -----> S oxidado + H2 O

Imunoenzimático (ELISA ou EIA)
– enzyma lynked imunosobert assay
- Detecção de imunocomplexo fixo em um suporte, usando para isto um anticorpo
conjugado a uma enzima.
- O resultado do teste é determinado por observação (avaliação qualitativa) ou
espectrofotométrica (avaliação quantitiva) da mudança de cor produzida pela ação da
enzima sobre o seu substrato.
(1) Formação do imunocomplexo (Ag-Ac)
(2) Adição do conjugado (Ac + enzima)
(3) Revelação (adiciona o substrato)

(HRP)enzima
horseradish
peroxidase.

Immunoblotting (Western Blotting – WE)
- É um imunoensaio em suporte sólido que utiliza antígenos virais imbilizados
para detectar anticorpos contra proteínas específicas.
-Teste amplamente utilizado para confirmar EIA positivo para HIV.
Procedimento:
(1) Separação das proteínas virais em SDS-page (eletroforese em gel de
poliacrilamida contendo duodecil sulfato de sódio)
(2) As bandas resultantes são transferidas (blotting) para uma membrana de
nitrocelulose.
(3) O soro humano teste (contendo anticorpos para as proteínas virais) é
adicionado
(4) Anticorpo anti-imunoglobulina humana marcado com enzima é adicionado.

Immunobloting (Western Blotting – WE)
-

Immunobloting (Western Blotting – WE)

 Immunobloting (Western Blotting – WE)
-
HIV-2

Western Blotting para HIV

DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Técnicas baseadas na Biologia Molecular  sequências únicas do ácido nucléico viral
Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)
 Polimerase Chain Reaction (PCR)
 Multiplex – PCR
 PCR em tempo real (uma das técnicas utilizadas para quantificar o ácido nucleico viral)
 Hybrid Capture Assay (HCA)

Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)
- Consiste na separação através do tamanho molecular, dos segmentos
genômicos virais em gel de poliacrilamida. - Coloração do gel com nitrato de
prata.
Professora Zilka Nanes /
Virologia Clínica
31

Polimerase Chain Reaction (PCR)
-Técnica de amplificação usada para sintetizar,
in vitro, sequencias específicas de DNA.
Professora Zilka Nanes / Virologia Clínica 32Termociclador

Polimerase Chain Reaction (PCR)
Professora Zilka Nanes / Virologia Clínica 33Termociclador

Polimerase Chain Reaction – Leitura de Gel de
agarose com brometo de etídio em luz UV.
http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0037-86822013000500625
• FIGURE 1 Amplified viral nucleic acids from commercial control dilutions after agarose gel electrophoresis,
ethidium bromide staining and UV transillumination. Lane 1: negative control. Lane 2: negative nucleic
acid amplification (1 copy/µL of HSV). Lanes 3 to 7: samples containing HSV DNA (dilutions of 5, 10, 50, 75
and 100 copies/µL, respectively). Lane 8: 100 to 1,000 bp MWM; Lanes 9 and 10: negative nucleic acid
amplification (1 and 5 copies/µL of VZV, respectively). Lanes 11 to 14: samples containing VZV DNA
(dilutions 10, 50, 75 and 100 copies/µL, respectively). HSV: herpes simplex virus; VZV: varicella zoster
virus; DNA: deoxyribonucleic acid; UV: ultraviolet; MWM: molecular weight marker.

Polimerase Chain Reaction (PCR)
Eletroforese em gel de agarose

Polimerase Chain Reaction (PCR)
Leitura do gel com luz UV

Multiplex – PCR
- Variação da técnica de PCR,
possibilitando a detecção de
múltiplos alvos na mesma reação.
- Existem protocolos para detecção
vírus respiratórios, enterovírus,
herpesvírus.
- Também para detecção simultânea
de vírus e protozoários (Epstein Barr
e Toxoplasma gondii).

Multiplex – PCR
- Variação da técnica de PCR, possibilitando a detecção de múltiplos alvos na mesma reação.

PCR em tempo real
 É possível acompanhar visualmente o progresso da amplificação do produto da PCR.
 Utilização de primers, sondas, ou produtos amplificados marcados com moléculas
fluorescentes.
 Estes produtos marcados produzem um mudança no sinal após interação direta com o
produto amplificado.
Professora Zilka Nanes / Virologia
Clínica
39

Professora Zilka Nanes / Virologia Clínica Fonte: Santos, Romanos, Wigg; 2008 40

 PCR em tempo real
Professora Zilka Nanes / Virologia Clínica Fonte: Santos; Romanos; Wigg,
2008
41
Fase de transição
Fase de platô
Fase linear

Vídeo não carregou
Clínica
42

Hybrid Capture Assay (HCA)
 Disponíveis para quantificação do HCMV e do HBV.
 Sondas de RNA se ligam ao DNA-alvo do vírus, os híbridos RNA-DNA são
capturados por um anticorpo ligado a uma fase sólida . Depois é usado outro
anticorpo marcado com fosfatase alcalina ou quimioluminescêcia.
Clínica
43

•DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Real Time NASBA + Hibridação sondas
Amplifica mRNA a 41ºC com trasncriptase reversa aviária.
NASBA (Nucleic Acid Specific Based Amplification)

Quimioluminescência
 Conceito - é a emissão de luz não acompanhada
da emissão de calor em consequência de uma
reação química.
 Dois produtos químicos reagem para formar um
intermediário excitado (de alta energia), que se
decompõe libertando parte da sua energia como
fotóns de luz. As reações quimioluminescentes
habitualmente não libertam muito calor, uma vez
que a energia é libertada sob a forma de luz.
 O luminol produz uma luz quando reage com um
agente oxidante.

• Exames feitos por quimiolusminência são basicamente
automaitizados.
• Quantificam Ag ou Ac presentes no soro. São muito usados
para dosagem de hormônios, marcadores tumorais e
dosagem de anticorpos séricos.
• A técnica se baseia na ligação Ag-Ac. Como no ELISA, um
dos dois reagentes é conjugado com uma substãncia que
quando ativada, emite luz vísivel. A luz emitida é
proporcional a concentração da molécula pesquisada.
• Os tipos mais usados: competição e sanduiche.

• Figura 1: Movimento entre níveis eletrônicos. Um átomo de hidrogênio no seu estado
fundamental. Um único elétron encontra-se no nível n = 1. Cada nível eletrônico tem a
sua própria energia.
Quando o átomo de hidrogênio absorve um quantum (quantidade definida) de
energia, é promovido para um nível de energia superior (nível n = 2) e passa a estar num
estado excitado (de alta energia). Um asterisco (*) é colocado junto à molécula para
indicar este estado.
Professora Zilka Nanes / Virologia Clínica http://www.scienceinschool.org/pt/2011/issue19/chemiluminescence 47
*

• O elétron regressa à sua posição original no estado fundamental (nível n = 1).
Neste processo, uma quantidade de energia (um fóton) é libertada sob a forma de
radiação eletromagnética. O comprimento de onda depende da quantidade de
energia. Se o comprimento de onda encontra-se dentro da gama da luz visível, a
transição eletrônica será observada como luz de uma cor específica. O
comprimento de onda determina a cor (ver a Figura abaixo)
Professora Zilka Nanes / Virologia Clínica Imagem cortesia de Chemistry Review
48

• Muito utilizada em análises clínicas.
 ELISA sanduíche na quimioluminescência.

Immulite ® 1000

Immulite ® 2000

OBRIGADA
zilkananeslima@gmail.com

Virologia Clínica Parte 4 Diagnóstico Laboratorial [Profa.Zilka]

Recomendados

Recomendados

Mais conteúdo relacionado

Mais procurados

Mais procurados (20)

Semelhante a Virologia Clínica Parte 4 Diagnóstico Laboratorial [Profa.Zilka]

Semelhante a Virologia Clínica Parte 4 Diagnóstico Laboratorial [Profa.Zilka] (20)

Mais de Profª. Zilka Nanes Lima - UEPB - Microbiologia e Imunologia

Mais de Profª. Zilka Nanes Lima - UEPB - Microbiologia e Imunologia (13)

Último

Último (20)

Virologia Clínica Parte 4 Diagnóstico Laboratorial [Profa.Zilka]