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AULA 5:
CRESCIMENTO MICROBIANO
Microbiologia Geral
Prof°. Thiago Corrêa de Souza
Universidade Federal de Alfenas
Instituto de Ciências da Natureza
(ICN)
• Crescimento microbiano: aumento do número
de Microrganismos (MO) e não do tamanho das
células;
• Colônias: grupo de células que podem ser
visualizadas sem o microscópio;
Porque estudar?
• Controlar o crescimento de microrganismos
patogênicos ou daqueles que degradam os
alimentos;
• Entender como estimular o crescimento de MO
que estamos interessados em estudar.
Fatores necessários ao
crescimento
 Fatores físicos: pH, temperatura, pressão
hidrostática e pressão osmótica.
 Fatores químicos: fontes de carbono, nitrogênio,
fósforo, enxofre, oligoelementos, oxigênio e
fatores orgânicos de crescimento.
Fatores físicos : TEMPERATURA
 Maioria dos MO: crescem em temperaturas ideais para o
homem
 Temperatura mínima de crescimento: menor
temperatura em que a espécie é capaz de crescer
 Temperatura ótima: é aquela em que a espécie
apresenta melhor crescimento
 Temperatura máxima de crescimento: é a temperatura
mais alta em que ainda pode haver crescimento.
Temperatura ótima: temperatura na qual o MO cresce
mais rapidamente. Fica geralmente apenas alguns graus
abaixo da temperatura máxima.
 Termófilos:
- MO que crescem em temperaturas altas.
- Crescem em T acima de 50ºC.
 Termófilos facultativos: Conseguem crescer
abaixo de 37ºC (Solo).
 Estenotermófilos: Não conseguem crescer
abaixo de 37ºC. Compostagem.
 Termófilos extremos: Crescem acima de
80ºC. Hidrotermais. Pyrolobus fumarii pode
crescer a 113ºC.
 Mesófilos:
- MO que crescem em temperaturas
moderadas.
- Crescem em T próximas a 37ºC, temperatura
do corpo humano
Ambiente típico: animais.
Escherichia coli, assim como a maioria das
bactérias causadoras de doenças, são
mesófilas.
 Psicrófilos:
- MO que crescem em temperaturas baixas.
- Crescem a taxas apreciáveis abaixo de 5ºC.
Psicrófilos estritos: Não conseguem crescer
acima de 20ºC (Água fria do oceano).
Psicrófilos facultativos: Conseguem crescer
acima de 20ºC (Solo e água).
O que determina a temperatura máxima ou
mínima na qual um microrganimo pode
crescer???
Termoestabilidade das proteínas do microrganismo
Proteínas: são as macromoléculas mais sensíveis
ao calor em uma célula, e o crescimento não pode
acontecer em temperaturas que desnaturam as
proteínas.
Refrigeração: método mais comum na preservação
de alimentos – a velocidade de reprodução diminui em
baixas temperaturas
MO podem sobreviver em temperaturas próximas ao
congelamento – forma dormente – e podem diminuir o
número
Em refrigeradores, MO patogênicos não crescem
Binômio: TEMPO X TEMPERATURA
Grandes quantidades de alimentos refrigerados:
considerar que são refrigerados a uma velocidade
bastante lenta
Fatores físicos: pH
Bactérias: crescem melhor em
uma faixa estreita de pH perto
da neutralidade, entre 6,5 e 7,5
(ligeiramente básico)
Fungos: crescem melhor em pH
ligeiramente ácido
Protozoários e algas: crescem
melhor em pH neutro
Acidez: utilizada na conservação de alimentos:
chucrute, picles, queijos, conservas....
-Acidófilas: crescem em ambientes com pH
extremamente baixos. Lixiviações de ácido dos
resíduos de minas – pH: 1,0;
- Basófilas: prosperam em ambientes com pH
extremamente alto. Lagos salgados alcalinos, comuns
nos desertos do oeste norte-americano – pH:12;
- Escherichia coli: pode crescer entre pH 5,0 até 8,0.
pH interno mantido próximo a 7,6 (valor ótimo para
seu metabolismo) = mecanismos que bombeiam íons
hidrogênio para fora ou para dentro da célula.
Fatores Físicos: PRESSÃO HIDROSTÁTICA
- É a pressão aplicada a um líquido. Comumente
medida em atmosferas;
-Escherichia coli: crescem em pressões de até 300
atm.
- Procariontes encontrados no fundo do oceano:
toleram até 1500 atm (o suficiente para esmagar
tudo, menos as embarações de aço mais resistentes)
- Pressão elevada não esmaga uma célula microbiana:
a água passa imediatamente pela membrana da célula,
igualando a pressão de fora e de dentro.
Fatores físicos: PRESSÃO OSMÓTICA
-A força osmótica é uma medida de quanto a água está disponível.
-MO necessitam de água para o seu crescimento
-A célula contém de 80 a 90% de água
-Pressão osmótica elevada têm o efeito de remover água da
célula
Solução HipotônicaSolução Hipertônica
plasmólise
Importância:
Inibição do crescimento no momento em que a
membrana plasmática se separa da parede celular
(célula murcha, meio hipertônico)
Adição de sais em uma solução (aumento da pressão
osmótica): preserva alimentos
EX: mel, peixe, leite condensado – alta concentração de
sal ou açúcar remove a água do interior da célula do
MO, impedindo o crescimento
Fatores químicos (nutricionais)
-Escherichia coli cresce até dez vezes mais rápido em
um meio rico. O meio pobre satisfaz todas as
necessidades essenciais dela, mas a célula deve
sintetizar mais moléculas pequenas. Resultado:
crescimento mais lento.
-Taxa de crescimento: depende da qualidade do meio
- Produto do crescimento (biomassa): quantidade de
nutrientes no meio.
Elementos principais:
Carbono: carbono, lipídeos, proteínas e CO2
Oxigênio: parte de muitos compostos orgânicos
Hidrogênio: parte de muitos compostos orgânicos
Nitrogênio: aminoácidos, nitrato, nitrito, sais de amônia
Enxofre: biossíntese de aa cisteína, cistina, metionina
Fósforo: síntese de ácidos nucléicos e ATP
Oligoelementos
• Ferro, cobre, molibdênio, zinco, potássio, magnésio,
cálcio, manganês, cobalto.
• Elementos necessários em quantidades pequenas
• São requeridos para ativar enzimas – cofatores –
íons que uma enzima precisa para ser ativa
• São componentes de coenzimas – moléculas
orgânicas que uma enzima precisa para ser ativa.
• Presentes na água, constituintes do meio de cultura
ou adicionados ao mesmo
Fatores de crescimento
Compostos essenciais que os microrganismos não
conseguem sintetizar, devendo obtê-los do ambiente.
-Leuconostoc citrovorum: precisa dos 20 aa.
Se os fatores de crescimento estiverem presentes no
meio, até as bactérias que não precisam os utilizam =
crescimento acelerado.
Meio Composição T duplicação (min) Nº ribossomos por
célula
Lisina mínima Aa + sais 97 7.000
Glicose mínima Glicose + sais 50 17.000
20 aa 20 aa + sais 32 42.000
Cérebro-coração Extrato 21 83.000
1. Aeróbico obrigatório: Utilizam oxigênio
molecular para produzir energia.
2. Anaeróbicos obrigatórios: não há
crescimento na presença de oxigênio.
3. Anaeróbicos facultativos: crescimento
aeróbico e anaeróbico. Cresce mais na
presença de oxigênio.
4. Microaerófilo: crescimento somente
aeróbico, mas o oxigênio é requerido em
baixa concentração
5. Anaeróbicos aerotolerantes: crescimento
somente anaeróbico, mas continua na
presença de oxigênio
Oxigênio
Oxigênio
-Anaeróbicos são sensíveis ao oxigênio.
-Normalmente não produzem enzimas
antioxidantes para combater as Espécies
reativas de oxigênio (EROs)
As EROs incluem:
 ânion superóxido (O2
•–)
 oxigênio singleto (1O2)
 peróxido de hidrogênio (H2O2)
 radical hidroxila (OH•)
Biofilmes
• Falhas no processo de higienização: resíduos aderidos em
equipamentos e superfícies – potencial fonte de
contaminação.
• Os MO se aderem, interagem com as superfícies e iniciam
crescimento celular. Multiplicação: origem das colônias.
• Quando a massa celular é suficiente para agregar
nutrientes, resíduos e outros microrganismos - biofilme
• Contém partículas de proteínas, lipídeos, fosfolipídeos,
carboidratos, sais minerais e vitaminas - formam uma
crosta, debaixo da qual, os MO continuam a crescer.
• No biofilme: os MO estão mais resistentes à ação de
agentes químicos e físicos.
• Três etapas: fixação (adesão), colonização e crescimento.
• MO envolvidos no processo de fixação:
- Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fragi,
Pseudomonas fluorescens, Micrococcus sp e Enterococcus
faecium.
- Patogênicos: Listeria monocytogenes, Yersinia
enterocolitica, Salmonella thyphimurium, Escherichia coli
O157:H7, Staphylococcus aureus e Bacillus cereus
MEIOS DE CULTURA: Material nutriente preparado
em laboratório para o crescimento de MO
- Inóculo: quando MO são colocados em um meio de
cultura para início do crescimento.
- Cultura: crescimento e multiplicação dos MOs em um
meio de cultura
Critérios utilizados para crescimento de
MO em meio de cultura
1. Conter nutrientes corretos para que o MO possa crescer;
2. Conter quantidade de água necessária;
3. Ter o pH ajustado;
4. Conter quantidade específica de oxigênio;
5. Ser estéril;
6. Ser incubado na temperatura ideal de crescimento da
cultura.
Meios utilizados para o cultivo de
microrganismos
Quanto à consistência ou estado físico do meio de cultura
Quanto à natureza do meio de cultura
Quanto a composição ou função do meio de cultura
Quanto à consistência ou estado físico do meio
de cultura
 Meios Líquidos: São aqueles em que
os nutrientes acham-se dissolvidos
em solução aquosa.
Podem ser esterilizados em tubos de
ensaio, balões, Erlenmeyers ou outros
tipos de frascos.
Meios sólidos: Estes meios possuem na sua composição,
nutrientes e ágar na concentração de 1,0 a 2,0 %.
Ágar é uma substância de
natureza polissacarídica
extraída de algas
marinhas. Possui a
propriedade de se fundir
a 96 ºC e solidificar a
45ºC; não é degradado
pelos MO
 Meios Semi-sólidos: Possuem em sua composição, além
dos nutrientes, ágar em uma pequena porcentagem (0,5%
a 0,8%). Certos isolamentos de microrganismos têm mais
sucesso com o emprego de tais meios. São úteis para
comprovar a motilidade bacteriana.
Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa
Quanto à natureza do meio de cultura
Meio animado: É constituído de células vivas (animais
de laboratório, tecidos vivos ou ovo embrionário). Útil
principalmente para o cultivo de vírus.
Meio inanimado: Meio que não possui células vivas.
Meios naturais: São aqueles que contém substâncias
provenientes da natureza (ex. leite)
Meios sintéticos: são aqueles formados por
substâncias químicas preparadas em laboratório (ex.
ágar EMB - eosine methilene blue).
Meio Rico: Meio que permite o cultivo de quase todos os
microrganismos. Permite o crescimento de microrganismos
exigentes que necessitam de fatores de crescimento, mas
não inibem o crescimento daqueles pouco exigentes. Este
meio, além das fontes nutritivas usuais pode possuir
sangue, soro ou extratos de tecidos (meio complexo).
O meio quimicamente definido (conheço todos os
nutrientes)
Quanto à composição ou função
 Meio Enriquecedor ou meio enriquecido
Favorece o crescimento de uma dada espécie
bacteriana que se deseja isolar, mas não favorece o
crescimento de outras espécies bacterianas presentes
em uma população mista.
Estimula o crescimento do organismo de interesse que
está em baixo n°, tornando possível a detecção
Após alguns sub-cultivos nesse meio, a espécie
desejada emerge como uma população predominante ou
enriquecida.
 Meio Enriquecedor ou meio enriquecido
Ex.: as bactérias que oxidam o fenol podem ser
isoladas a partir de amostras do solo, utilizando um
meio de cultura constituído de sais de amônia, com o
fenol como a única fonte de carbono e energia. Após
alguns cultivos seriados, somente os microrganismos
capazes de oxidar o fenol estarão presentes em
grande número.
 Meio seletivo : Contém substâncias que inibem o
crescimento de certos microrganismos, porém
permitem o crescimento de outros.
Ágar Columbia CNA (Columbia
Naladixic Acid): seletivo para
bactérias Gram-positivas
O ácido nalidíxico é um antibiótico sintético derivado da
quinolona. Inibe a síntese de DNA em várias bactérias
Gram-negativas. Especificamente, inibe a DNA girase.
Meio Diferencial: contêm substâncias que permitem
diferenciar grupos de microrganismos.
 CHROMagarTM
Substâncias cromogênicas
específicas são incluídas
no meio de cultura
Ex.: Meio Diferencial: ágar sangue
As bactérias hemolíticas produzem hemolisinas
(enzimas) que lisam as células vermelhas do sangue
Elas podem ser diferenciadas pela região de lise ao
redor da colônia
- hemólise em Staphylococcus aureus
bactérias não hemoliticas
Meio seletivo e diferencial: reúne as propriedades
dos meios seletivos e dos meios diferenciais.
 Seletivo: contêm sais
biliares e o corante
cristal violeta que inibe o
crescimento de bactérias
Gram-positivas.
Staphylococcus aureus
 Ex: o meio de cultura ágar MacConkey
• - Lactose está presente no
meio.
• - Bactérias (gram negativas)
que utilizam lactose
(fermentadoras) irão produzir
ácido. Na presença do indicador
de ph, vermelho neutro, ficam
com a cor vermelha
 As bactérias (Gram negativas)
que não utilizam lactose ficam
incolores (opacas)
Salmonella typhimurium
Escherichia coli
 ágar MacConkey também é diferencial
 Meio seletivo e diferencial: Ágar manitol salgado
Diferencial: A bactéria
Staphylococcus aureus utiliza
o manitol como fonte de
carboidrato e produz ácido.
Esse reage com fenol
alterando a cor da colônia
para amarela.
As colônias brancas de
Staphylococcus epidermidis
não utilizam manitol
Seletivo: A alta concentração de sal (7,5%) seleciona
bactérias tolerantes, como Staphylococcus spp.
S. aureus
S. epidermidis
Técnicas especiais de cultivo
• Estufas de dióxido de carbono: crescimento de
bactérias anaeróbicas que necessitam de concentrações
de CO2 superiores ou inferiores àquelas encontradas na
atmosfera
• Jarras contendo uma vela no seu interior: jarra grande,
fechada hermeticamente, contendo uma vela acesa que
consome o oxigênio
Jarra de anaerobiose: sistema GaspaK
 A água é adicionada ao envelope gerador de gás (GasPak),
promovendo uma liberação de H2 e CO2
 O H2 reage como o O2 na superfície do catalisador de
paládio, formando água e estabelecendo a anaerobiose
Câmara de anaerobiose contendo atmosfera de H, N e CO2.
Cultivo de microrganismos aeróbios
O agitador Orbital expõe
maiores superfícies da
cultura de microrganismos
aeróbios ao oxigênio
Obtenção de culturas puras
• Maioria dos materiais infecciosos, solo, água e alimentos:
apresentam uma grande variedade de bactérias
• Origem de uma colônia visível: um único esporo, célula
vegetativa ou um grupo de MO em grumos ou cadeia
• Normalmente apresentam características morfológicas
diferentes que permitem a diferenciação
• Necessidade de culturas puras
• Método de semeadura por esgotamento
Preservando culturas bacterianas
 Mantidas em refrigeração por curtos períodos
 Congelamento em baixas temperaturas: Culturas puras
colocadas em um líquido e congeladas rapidamente entre
-50oC a -95oC;
 Liofilização: suspensão microbiana é congelada
rapidamente entre -54oC a -72oC e imediatamente ocorre
a remoção da água utilizando alto vácuo. Recuperação:
adição de meio líquido nutriente.
REPRODUÇÃO E
CRESCIMENTO DE
MICRORGANISMOS
PROCARIÓTICOS
Tipos de reprodução assexuada
• Fissão binária transversal (mais comum)
• Brotamento
• Fragmentação
• Formação de exósporo
Etapas da Fissão Binária Transversal
1- Elongação da célula
parental
2- duplicação do cromossomo
3 - Distribuição do
cromossomo e material
celular. Formação do septo
4- Separação das células
1
2
3
4
Fissão binária transversal em E. coli
Brotamento: Rhodopseudomonas acidophila
Fragmentação: Nocardia sp
Formação de exósporo: Streptomyces
(actinomiceto-conídios)
Crescimento de uma cultura bacteriana
por divisão binária (ou fissão binária)
 As células aumentam de volume(alongamento) e se dividem
 Tempo de geração tempo necessário p/ dividir e dobrar a
população
 O crescimento ocorre em progressão geométrica
 1 ==> 2 ==> 4 ==> 8 ==> 16 ==> ...
 n= número de gerações (expoente)
 20 ==> 21 ==> 22 ==23 ==> 24 ==> 2n
O intervalo entre as divisões celulares (duplicação
da população) é chamado tempo de geração
O tempo de geração depende da espécie
bacteriana e, também, das condições nutricionais
e físicas de cultivo (E. coli = 20-30’)
Com a
transformação
logarítmica, você
consegue acomodar
mais valores (uma
maior população)
no mesmo gráfico.
Com os valores
aritméticos não
são detectados
alterações nas
gerações iniciais!
Expressões matemáticas do crescimento
 Para calcular a concentração total de células = n°inicial de
células x 2n° de gerações.
N= n° total de células na cultura com crescimento ativo
n = número de gerações
N0 = número inicial de células
 N= N0 X 2n
 Qual o número total de células quando se tem 5 células
bacterianas que se dividiram 9 vezes?
N?
N0 = 5
n = 9
N = 5 x 29 = 2.560 células
Expressões matemáticas do crescimento
 N= N0 X 2n
Transformação logarítimica
 log10N = log10 N0 + n log10 2
 n = (log10 N - log10 N0) / (log10 2)
 n = 3,3 (log10 N - log10 N0)
A partir de uma população contendo 103 células foram
produzidas 108 células.
Qual o número de gerações ?
 N0= 103 = 1.000
 N= 108 = 100.000.000
 ? ==> n
 n = 3,3 (log10 N - log10 N0)
 n = 3,3 (log10 108 - log10 103)
 n = 3,3 (8-3)
 n=16,5 gerações
O tempo de geração (g)
é o tempo gasto para a
população duplicar
g = t/ n
 g = tempo de geração
 t= intervalo de tempo em minutos
 n= número de gerações
 n = 3,3 (log10 N - log10 N0)
 n = 3,3 (log10 107 - log10 104)
 n= 9,9 (número de gerações).
 g = t/n
 g= (4 h x 60’) / 9,9
 g= 24,24 minutos
Qual o tempo de geração (g) de uma colônia de Staphylococcus aureus com
104 células que gerou no final de 4 horas um número de 107 células?
Primeiro encontrar o número de gerações (n) devido a fórmula do tempo de
geração (g)
Curva padrão de crescimento
Sistema fechado
• Nenhum nutriente é adicionado ao meio
• Nenhum produto de excreção é removido
• As células se dividem por fissão binária
• Número de células aumenta por um período de tempo, até
que os nutrientes cessem ou até que o produto de
excreção se acumulem em quantidades suficientes para que
o crescimento posterior seja interrompido.
CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO
Demonstra o crescimento das células durante um período de
tempo
Log do n° de células viáveis x Tempo
 Imediatamente após a inoculação da bactéria no meio
de cultura “novo” (meio rico para o pobre tb!!!!!)
 Ocorre síntese de proteínas, enzimas, RNA, e outras
substâncias e, também, aumento da atividade
metabólica.
 O tempo da fase depende da quantidade de inóculo
usada; do tempo necessário para recuperação pela
transferência e síntese de co-enzimas e enzimas
 A taxa de crescimento é nula
LAG OU DE FASE DE ADAPTAÇÃO
 Condições de crescimento balanceado
 As células se dividem a uma taxa constante, em
progressão geométrica, dependendo das condições de
incubação e composição do meio de cultura
 A taxa de crescimento é máxima e constante.
 As células são uniformes em composição química e
atividades metabólicas e fisiológicas
 Pico da atividade e eficiência fisiológica
FASE LOG OU EXPONENCIAL
FASE ESTACIONÁRIA
 O crescimento da população bacteriana é limitado pela
exaustão dos nutrientes, intoxicação pelos produtos
de excreção mudança de pH e falta de espaço
 Algumas células ainda se dividem e outras morrem
 Começa a diminuir o número de células viáveis. A taxa
de crescimento é zero (número de células novas =
número de células mortas).
 Interessante que caso o crescimento microbiano não
cessasse: uma bactéria com peso de 9,5 x 10-13 g,
dividindo-se a cada 20 min durante somente 25,5 horas
produziria, teoricamente, uma população igual ao peso
de um avião de transporte (80 mil toneladas).
FASE DE MORTE OU SENESCÊNCIA
 Acúmulo adicional de produtos metabólicos inibitórios
e depleção dos nutrientes essenciais
 A taxa de crescimento é zero e a de morte é
acelerada
 O número de células viáveis diminui de forma
exponencial
Métodos para quantificar o
crescimento bacteriano
DIRETOS INDIRETOS
 contagem em placa;
 filtração;
 NMP;
 contagem no microscópio
 turbidimetria;
 atividade metabólica;
 peso seco
DIRETOS
1. Contagem em placa e diluição em série
Considera que uma única célula bacteriana formará
uma colônia!
Mas nem sempre temos uma única célula, pois
existem os arranjos (estrepto.....).
Assim as contagens em placas são frequentemente
chamadas de unidades formadoras de colônia (UFC)
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1. Contagem em placa e diluição em série
Considera que uma única célula bacteriana formará
uma colônia!
Mas nem sempre temos uma única célula, pois
existem os arranjos (estrepto.....).
Assim as contagens em placas são frequentemente
chamadas de unidades formadoras de colônia (UFC)
DIRETOS
1. Contagem em placa e diluição em série
As vantagens da contagem padrão em placa são:
•Somente células viáveis são contadas;
•Permite o isolamento das colônias, que podem ser sub-
cultivadas em culturas puras, as quais podem ser facilmente
estudadas e identificadas.
No entanto, algumas desvantagens são apresentadas:
•Não existe um meio que permita o crescimento de todos os
microrganismos;
•É necessária a incubação apropriada para permitir o
desenvolvimento das colônias (pode demorar);
•Usa-se muita vidraria e é relativamente trabalhoso;
•A necessidade de muita manipulação pode originar erros nas
contagens devido a erros de diluição e/ou plaqueamento
2. Contagem em placa: “pour plate” e espalhamento
2. Contagem em placa: “pour plate”
Principal desvantagem ágar a 50 °C pode eliminar
microrganismos!
O método por espalhamento não possui esta
desvantagem.
3. Filtração
Utilizado para concentrar os microrganismos em uma
membrana de filtro (porosa). Poros pequenos
impedem a passagem de microrganismos!
-Amostras de água em riachos, lagos, pois possuem
pouca quantidade de células (poluição fecal –
coliformes fecais)
-Procedimento: Filtro 100 mL de água em seguida
coloco a membrana em meio de cultura (incubação)
contagem UFC
3. Filtração
4. Método do número mais provável (MNP)
-É uma técnica estatística baseada: quanto maior o
número de bactérias, maior será o número de
diluições necessárias para eliminar totalmente o
crescimento em tubos contendo meio de cultura.
-Técnica utilizada quando as bactérias não crescem
em meio sólido
-Fornece apenas uma estimativa
5. Contagem direta ao microscópio
 Um volume conhecido de uma suspensão bacteriana é
colocado em uma área definida da lâmina de microscópio
 Uma amostra de 0,01 mL é espalhada na superfície de 1
cm da lâmina e um corante é adicionado
 Após a contagem de diferentes regiões da lâmina a
média do número de bactérias pode ser determinado –
multiplicado por 100 (para se determinar em mL)
Vantagem: não precisa de incubação (resultado imediato)
Desvantagens:
-Não é bom para contagem de bactérias móveis.
-As células mortas tb são contadas junto com as vivas
-Uma contagem satisfatória necessita de um grande número
de células
INDIRETOS
1. Turbidimetria
• Quando uma bactéria de multiplica em meio líquido, esse
meio fica turvo ou com alta densidade de células
• Utilização do espectrofotômetro
INDIRETOS
2. Atividade metabólica
• Assume que a quantidade de um produto metabólico
determinado (ácido ou CO2) é diretamente proporcional
ao número de bactérias presentes
3. Peso seco
• Usado pra medir a quantidade de microrganismo
• O Microrganismo é removido do meio de crescimento,
filtrado (ou centrifugado) e seco em dissecador, sendo
então pesado.
• Bom método para fungos filamentosos
Obrigado!

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  • 1. AULA 5: CRESCIMENTO MICROBIANO Microbiologia Geral Prof°. Thiago Corrêa de Souza Universidade Federal de Alfenas Instituto de Ciências da Natureza (ICN)
  • 2. • Crescimento microbiano: aumento do número de Microrganismos (MO) e não do tamanho das células; • Colônias: grupo de células que podem ser visualizadas sem o microscópio; Porque estudar? • Controlar o crescimento de microrganismos patogênicos ou daqueles que degradam os alimentos; • Entender como estimular o crescimento de MO que estamos interessados em estudar.
  • 3. Fatores necessários ao crescimento  Fatores físicos: pH, temperatura, pressão hidrostática e pressão osmótica.  Fatores químicos: fontes de carbono, nitrogênio, fósforo, enxofre, oligoelementos, oxigênio e fatores orgânicos de crescimento.
  • 4. Fatores físicos : TEMPERATURA  Maioria dos MO: crescem em temperaturas ideais para o homem  Temperatura mínima de crescimento: menor temperatura em que a espécie é capaz de crescer  Temperatura ótima: é aquela em que a espécie apresenta melhor crescimento  Temperatura máxima de crescimento: é a temperatura mais alta em que ainda pode haver crescimento.
  • 5. Temperatura ótima: temperatura na qual o MO cresce mais rapidamente. Fica geralmente apenas alguns graus abaixo da temperatura máxima.
  • 6.  Termófilos: - MO que crescem em temperaturas altas. - Crescem em T acima de 50ºC.  Termófilos facultativos: Conseguem crescer abaixo de 37ºC (Solo).  Estenotermófilos: Não conseguem crescer abaixo de 37ºC. Compostagem.  Termófilos extremos: Crescem acima de 80ºC. Hidrotermais. Pyrolobus fumarii pode crescer a 113ºC.
  • 7.  Mesófilos: - MO que crescem em temperaturas moderadas. - Crescem em T próximas a 37ºC, temperatura do corpo humano Ambiente típico: animais. Escherichia coli, assim como a maioria das bactérias causadoras de doenças, são mesófilas.
  • 8.  Psicrófilos: - MO que crescem em temperaturas baixas. - Crescem a taxas apreciáveis abaixo de 5ºC. Psicrófilos estritos: Não conseguem crescer acima de 20ºC (Água fria do oceano). Psicrófilos facultativos: Conseguem crescer acima de 20ºC (Solo e água).
  • 9.
  • 10. O que determina a temperatura máxima ou mínima na qual um microrganimo pode crescer??? Termoestabilidade das proteínas do microrganismo Proteínas: são as macromoléculas mais sensíveis ao calor em uma célula, e o crescimento não pode acontecer em temperaturas que desnaturam as proteínas.
  • 11.
  • 12. Refrigeração: método mais comum na preservação de alimentos – a velocidade de reprodução diminui em baixas temperaturas MO podem sobreviver em temperaturas próximas ao congelamento – forma dormente – e podem diminuir o número Em refrigeradores, MO patogênicos não crescem Binômio: TEMPO X TEMPERATURA Grandes quantidades de alimentos refrigerados: considerar que são refrigerados a uma velocidade bastante lenta
  • 13. Fatores físicos: pH Bactérias: crescem melhor em uma faixa estreita de pH perto da neutralidade, entre 6,5 e 7,5 (ligeiramente básico) Fungos: crescem melhor em pH ligeiramente ácido Protozoários e algas: crescem melhor em pH neutro
  • 14. Acidez: utilizada na conservação de alimentos: chucrute, picles, queijos, conservas.... -Acidófilas: crescem em ambientes com pH extremamente baixos. Lixiviações de ácido dos resíduos de minas – pH: 1,0; - Basófilas: prosperam em ambientes com pH extremamente alto. Lagos salgados alcalinos, comuns nos desertos do oeste norte-americano – pH:12; - Escherichia coli: pode crescer entre pH 5,0 até 8,0. pH interno mantido próximo a 7,6 (valor ótimo para seu metabolismo) = mecanismos que bombeiam íons hidrogênio para fora ou para dentro da célula.
  • 15. Fatores Físicos: PRESSÃO HIDROSTÁTICA - É a pressão aplicada a um líquido. Comumente medida em atmosferas; -Escherichia coli: crescem em pressões de até 300 atm. - Procariontes encontrados no fundo do oceano: toleram até 1500 atm (o suficiente para esmagar tudo, menos as embarações de aço mais resistentes) - Pressão elevada não esmaga uma célula microbiana: a água passa imediatamente pela membrana da célula, igualando a pressão de fora e de dentro.
  • 16. Fatores físicos: PRESSÃO OSMÓTICA -A força osmótica é uma medida de quanto a água está disponível. -MO necessitam de água para o seu crescimento -A célula contém de 80 a 90% de água -Pressão osmótica elevada têm o efeito de remover água da célula Solução HipotônicaSolução Hipertônica plasmólise
  • 17. Importância: Inibição do crescimento no momento em que a membrana plasmática se separa da parede celular (célula murcha, meio hipertônico) Adição de sais em uma solução (aumento da pressão osmótica): preserva alimentos EX: mel, peixe, leite condensado – alta concentração de sal ou açúcar remove a água do interior da célula do MO, impedindo o crescimento
  • 18. Fatores químicos (nutricionais) -Escherichia coli cresce até dez vezes mais rápido em um meio rico. O meio pobre satisfaz todas as necessidades essenciais dela, mas a célula deve sintetizar mais moléculas pequenas. Resultado: crescimento mais lento. -Taxa de crescimento: depende da qualidade do meio - Produto do crescimento (biomassa): quantidade de nutrientes no meio.
  • 19. Elementos principais: Carbono: carbono, lipídeos, proteínas e CO2 Oxigênio: parte de muitos compostos orgânicos Hidrogênio: parte de muitos compostos orgânicos Nitrogênio: aminoácidos, nitrato, nitrito, sais de amônia Enxofre: biossíntese de aa cisteína, cistina, metionina Fósforo: síntese de ácidos nucléicos e ATP
  • 20. Oligoelementos • Ferro, cobre, molibdênio, zinco, potássio, magnésio, cálcio, manganês, cobalto. • Elementos necessários em quantidades pequenas • São requeridos para ativar enzimas – cofatores – íons que uma enzima precisa para ser ativa • São componentes de coenzimas – moléculas orgânicas que uma enzima precisa para ser ativa. • Presentes na água, constituintes do meio de cultura ou adicionados ao mesmo
  • 21. Fatores de crescimento Compostos essenciais que os microrganismos não conseguem sintetizar, devendo obtê-los do ambiente. -Leuconostoc citrovorum: precisa dos 20 aa. Se os fatores de crescimento estiverem presentes no meio, até as bactérias que não precisam os utilizam = crescimento acelerado. Meio Composição T duplicação (min) Nº ribossomos por célula Lisina mínima Aa + sais 97 7.000 Glicose mínima Glicose + sais 50 17.000 20 aa 20 aa + sais 32 42.000 Cérebro-coração Extrato 21 83.000
  • 22. 1. Aeróbico obrigatório: Utilizam oxigênio molecular para produzir energia. 2. Anaeróbicos obrigatórios: não há crescimento na presença de oxigênio. 3. Anaeróbicos facultativos: crescimento aeróbico e anaeróbico. Cresce mais na presença de oxigênio. 4. Microaerófilo: crescimento somente aeróbico, mas o oxigênio é requerido em baixa concentração 5. Anaeróbicos aerotolerantes: crescimento somente anaeróbico, mas continua na presença de oxigênio Oxigênio
  • 23. Oxigênio -Anaeróbicos são sensíveis ao oxigênio. -Normalmente não produzem enzimas antioxidantes para combater as Espécies reativas de oxigênio (EROs) As EROs incluem:  ânion superóxido (O2 •–)  oxigênio singleto (1O2)  peróxido de hidrogênio (H2O2)  radical hidroxila (OH•)
  • 24. Biofilmes • Falhas no processo de higienização: resíduos aderidos em equipamentos e superfícies – potencial fonte de contaminação. • Os MO se aderem, interagem com as superfícies e iniciam crescimento celular. Multiplicação: origem das colônias. • Quando a massa celular é suficiente para agregar nutrientes, resíduos e outros microrganismos - biofilme • Contém partículas de proteínas, lipídeos, fosfolipídeos, carboidratos, sais minerais e vitaminas - formam uma crosta, debaixo da qual, os MO continuam a crescer.
  • 25. • No biofilme: os MO estão mais resistentes à ação de agentes químicos e físicos. • Três etapas: fixação (adesão), colonização e crescimento. • MO envolvidos no processo de fixação: - Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fragi, Pseudomonas fluorescens, Micrococcus sp e Enterococcus faecium. - Patogênicos: Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Salmonella thyphimurium, Escherichia coli O157:H7, Staphylococcus aureus e Bacillus cereus
  • 26.
  • 27. MEIOS DE CULTURA: Material nutriente preparado em laboratório para o crescimento de MO - Inóculo: quando MO são colocados em um meio de cultura para início do crescimento. - Cultura: crescimento e multiplicação dos MOs em um meio de cultura
  • 28. Critérios utilizados para crescimento de MO em meio de cultura 1. Conter nutrientes corretos para que o MO possa crescer; 2. Conter quantidade de água necessária; 3. Ter o pH ajustado; 4. Conter quantidade específica de oxigênio; 5. Ser estéril; 6. Ser incubado na temperatura ideal de crescimento da cultura.
  • 29. Meios utilizados para o cultivo de microrganismos Quanto à consistência ou estado físico do meio de cultura Quanto à natureza do meio de cultura Quanto a composição ou função do meio de cultura
  • 30. Quanto à consistência ou estado físico do meio de cultura  Meios Líquidos: São aqueles em que os nutrientes acham-se dissolvidos em solução aquosa. Podem ser esterilizados em tubos de ensaio, balões, Erlenmeyers ou outros tipos de frascos.
  • 31. Meios sólidos: Estes meios possuem na sua composição, nutrientes e ágar na concentração de 1,0 a 2,0 %. Ágar é uma substância de natureza polissacarídica extraída de algas marinhas. Possui a propriedade de se fundir a 96 ºC e solidificar a 45ºC; não é degradado pelos MO
  • 32.  Meios Semi-sólidos: Possuem em sua composição, além dos nutrientes, ágar em uma pequena porcentagem (0,5% a 0,8%). Certos isolamentos de microrganismos têm mais sucesso com o emprego de tais meios. São úteis para comprovar a motilidade bacteriana. Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa
  • 33. Quanto à natureza do meio de cultura Meio animado: É constituído de células vivas (animais de laboratório, tecidos vivos ou ovo embrionário). Útil principalmente para o cultivo de vírus. Meio inanimado: Meio que não possui células vivas. Meios naturais: São aqueles que contém substâncias provenientes da natureza (ex. leite) Meios sintéticos: são aqueles formados por substâncias químicas preparadas em laboratório (ex. ágar EMB - eosine methilene blue).
  • 34. Meio Rico: Meio que permite o cultivo de quase todos os microrganismos. Permite o crescimento de microrganismos exigentes que necessitam de fatores de crescimento, mas não inibem o crescimento daqueles pouco exigentes. Este meio, além das fontes nutritivas usuais pode possuir sangue, soro ou extratos de tecidos (meio complexo). O meio quimicamente definido (conheço todos os nutrientes) Quanto à composição ou função
  • 35.  Meio Enriquecedor ou meio enriquecido Favorece o crescimento de uma dada espécie bacteriana que se deseja isolar, mas não favorece o crescimento de outras espécies bacterianas presentes em uma população mista. Estimula o crescimento do organismo de interesse que está em baixo n°, tornando possível a detecção Após alguns sub-cultivos nesse meio, a espécie desejada emerge como uma população predominante ou enriquecida.
  • 36.  Meio Enriquecedor ou meio enriquecido Ex.: as bactérias que oxidam o fenol podem ser isoladas a partir de amostras do solo, utilizando um meio de cultura constituído de sais de amônia, com o fenol como a única fonte de carbono e energia. Após alguns cultivos seriados, somente os microrganismos capazes de oxidar o fenol estarão presentes em grande número.
  • 37.  Meio seletivo : Contém substâncias que inibem o crescimento de certos microrganismos, porém permitem o crescimento de outros. Ágar Columbia CNA (Columbia Naladixic Acid): seletivo para bactérias Gram-positivas O ácido nalidíxico é um antibiótico sintético derivado da quinolona. Inibe a síntese de DNA em várias bactérias Gram-negativas. Especificamente, inibe a DNA girase.
  • 38. Meio Diferencial: contêm substâncias que permitem diferenciar grupos de microrganismos.  CHROMagarTM Substâncias cromogênicas específicas são incluídas no meio de cultura
  • 39. Ex.: Meio Diferencial: ágar sangue As bactérias hemolíticas produzem hemolisinas (enzimas) que lisam as células vermelhas do sangue Elas podem ser diferenciadas pela região de lise ao redor da colônia - hemólise em Staphylococcus aureus bactérias não hemoliticas
  • 40. Meio seletivo e diferencial: reúne as propriedades dos meios seletivos e dos meios diferenciais.  Seletivo: contêm sais biliares e o corante cristal violeta que inibe o crescimento de bactérias Gram-positivas. Staphylococcus aureus  Ex: o meio de cultura ágar MacConkey
  • 41. • - Lactose está presente no meio. • - Bactérias (gram negativas) que utilizam lactose (fermentadoras) irão produzir ácido. Na presença do indicador de ph, vermelho neutro, ficam com a cor vermelha  As bactérias (Gram negativas) que não utilizam lactose ficam incolores (opacas) Salmonella typhimurium Escherichia coli  ágar MacConkey também é diferencial
  • 42.  Meio seletivo e diferencial: Ágar manitol salgado Diferencial: A bactéria Staphylococcus aureus utiliza o manitol como fonte de carboidrato e produz ácido. Esse reage com fenol alterando a cor da colônia para amarela. As colônias brancas de Staphylococcus epidermidis não utilizam manitol Seletivo: A alta concentração de sal (7,5%) seleciona bactérias tolerantes, como Staphylococcus spp. S. aureus S. epidermidis
  • 43. Técnicas especiais de cultivo • Estufas de dióxido de carbono: crescimento de bactérias anaeróbicas que necessitam de concentrações de CO2 superiores ou inferiores àquelas encontradas na atmosfera • Jarras contendo uma vela no seu interior: jarra grande, fechada hermeticamente, contendo uma vela acesa que consome o oxigênio
  • 44. Jarra de anaerobiose: sistema GaspaK  A água é adicionada ao envelope gerador de gás (GasPak), promovendo uma liberação de H2 e CO2  O H2 reage como o O2 na superfície do catalisador de paládio, formando água e estabelecendo a anaerobiose
  • 45. Câmara de anaerobiose contendo atmosfera de H, N e CO2.
  • 46. Cultivo de microrganismos aeróbios O agitador Orbital expõe maiores superfícies da cultura de microrganismos aeróbios ao oxigênio
  • 47. Obtenção de culturas puras • Maioria dos materiais infecciosos, solo, água e alimentos: apresentam uma grande variedade de bactérias • Origem de uma colônia visível: um único esporo, célula vegetativa ou um grupo de MO em grumos ou cadeia • Normalmente apresentam características morfológicas diferentes que permitem a diferenciação • Necessidade de culturas puras • Método de semeadura por esgotamento
  • 48.
  • 49.
  • 50. Preservando culturas bacterianas  Mantidas em refrigeração por curtos períodos  Congelamento em baixas temperaturas: Culturas puras colocadas em um líquido e congeladas rapidamente entre -50oC a -95oC;  Liofilização: suspensão microbiana é congelada rapidamente entre -54oC a -72oC e imediatamente ocorre a remoção da água utilizando alto vácuo. Recuperação: adição de meio líquido nutriente.
  • 51.
  • 53. Tipos de reprodução assexuada • Fissão binária transversal (mais comum) • Brotamento • Fragmentação • Formação de exósporo
  • 54. Etapas da Fissão Binária Transversal 1- Elongação da célula parental 2- duplicação do cromossomo 3 - Distribuição do cromossomo e material celular. Formação do septo 4- Separação das células 1 2 3 4
  • 58. Formação de exósporo: Streptomyces (actinomiceto-conídios)
  • 59. Crescimento de uma cultura bacteriana por divisão binária (ou fissão binária)  As células aumentam de volume(alongamento) e se dividem  Tempo de geração tempo necessário p/ dividir e dobrar a população  O crescimento ocorre em progressão geométrica  1 ==> 2 ==> 4 ==> 8 ==> 16 ==> ...  n= número de gerações (expoente)  20 ==> 21 ==> 22 ==23 ==> 24 ==> 2n
  • 60. O intervalo entre as divisões celulares (duplicação da população) é chamado tempo de geração O tempo de geração depende da espécie bacteriana e, também, das condições nutricionais e físicas de cultivo (E. coli = 20-30’)
  • 61.
  • 62. Com a transformação logarítmica, você consegue acomodar mais valores (uma maior população) no mesmo gráfico. Com os valores aritméticos não são detectados alterações nas gerações iniciais!
  • 63. Expressões matemáticas do crescimento  Para calcular a concentração total de células = n°inicial de células x 2n° de gerações. N= n° total de células na cultura com crescimento ativo n = número de gerações N0 = número inicial de células  N= N0 X 2n  Qual o número total de células quando se tem 5 células bacterianas que se dividiram 9 vezes? N? N0 = 5 n = 9 N = 5 x 29 = 2.560 células
  • 64. Expressões matemáticas do crescimento  N= N0 X 2n Transformação logarítimica  log10N = log10 N0 + n log10 2  n = (log10 N - log10 N0) / (log10 2)  n = 3,3 (log10 N - log10 N0)
  • 65. A partir de uma população contendo 103 células foram produzidas 108 células. Qual o número de gerações ?  N0= 103 = 1.000  N= 108 = 100.000.000  ? ==> n  n = 3,3 (log10 N - log10 N0)  n = 3,3 (log10 108 - log10 103)  n = 3,3 (8-3)  n=16,5 gerações
  • 66. O tempo de geração (g) é o tempo gasto para a população duplicar g = t/ n  g = tempo de geração  t= intervalo de tempo em minutos  n= número de gerações
  • 67.  n = 3,3 (log10 N - log10 N0)  n = 3,3 (log10 107 - log10 104)  n= 9,9 (número de gerações).  g = t/n  g= (4 h x 60’) / 9,9  g= 24,24 minutos Qual o tempo de geração (g) de uma colônia de Staphylococcus aureus com 104 células que gerou no final de 4 horas um número de 107 células? Primeiro encontrar o número de gerações (n) devido a fórmula do tempo de geração (g)
  • 68. Curva padrão de crescimento Sistema fechado • Nenhum nutriente é adicionado ao meio • Nenhum produto de excreção é removido • As células se dividem por fissão binária • Número de células aumenta por um período de tempo, até que os nutrientes cessem ou até que o produto de excreção se acumulem em quantidades suficientes para que o crescimento posterior seja interrompido.
  • 69. CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO Demonstra o crescimento das células durante um período de tempo Log do n° de células viáveis x Tempo
  • 70.  Imediatamente após a inoculação da bactéria no meio de cultura “novo” (meio rico para o pobre tb!!!!!)  Ocorre síntese de proteínas, enzimas, RNA, e outras substâncias e, também, aumento da atividade metabólica.  O tempo da fase depende da quantidade de inóculo usada; do tempo necessário para recuperação pela transferência e síntese de co-enzimas e enzimas  A taxa de crescimento é nula LAG OU DE FASE DE ADAPTAÇÃO
  • 71.  Condições de crescimento balanceado  As células se dividem a uma taxa constante, em progressão geométrica, dependendo das condições de incubação e composição do meio de cultura  A taxa de crescimento é máxima e constante.  As células são uniformes em composição química e atividades metabólicas e fisiológicas  Pico da atividade e eficiência fisiológica FASE LOG OU EXPONENCIAL
  • 72. FASE ESTACIONÁRIA  O crescimento da população bacteriana é limitado pela exaustão dos nutrientes, intoxicação pelos produtos de excreção mudança de pH e falta de espaço  Algumas células ainda se dividem e outras morrem  Começa a diminuir o número de células viáveis. A taxa de crescimento é zero (número de células novas = número de células mortas).  Interessante que caso o crescimento microbiano não cessasse: uma bactéria com peso de 9,5 x 10-13 g, dividindo-se a cada 20 min durante somente 25,5 horas produziria, teoricamente, uma população igual ao peso de um avião de transporte (80 mil toneladas).
  • 73. FASE DE MORTE OU SENESCÊNCIA  Acúmulo adicional de produtos metabólicos inibitórios e depleção dos nutrientes essenciais  A taxa de crescimento é zero e a de morte é acelerada  O número de células viáveis diminui de forma exponencial
  • 74. Métodos para quantificar o crescimento bacteriano DIRETOS INDIRETOS  contagem em placa;  filtração;  NMP;  contagem no microscópio  turbidimetria;  atividade metabólica;  peso seco
  • 75. DIRETOS 1. Contagem em placa e diluição em série Considera que uma única célula bacteriana formará uma colônia! Mas nem sempre temos uma única célula, pois existem os arranjos (estrepto.....). Assim as contagens em placas são frequentemente chamadas de unidades formadoras de colônia (UFC)
  • 76. DIRETOS 1. Contagem em placa e diluição em série Considera que uma única célula bacteriana formará uma colônia! Mas nem sempre temos uma única célula, pois existem os arranjos (estrepto.....). Assim as contagens em placas são frequentemente chamadas de unidades formadoras de colônia (UFC)
  • 77. DIRETOS 1. Contagem em placa e diluição em série
  • 78. As vantagens da contagem padrão em placa são: •Somente células viáveis são contadas; •Permite o isolamento das colônias, que podem ser sub- cultivadas em culturas puras, as quais podem ser facilmente estudadas e identificadas. No entanto, algumas desvantagens são apresentadas: •Não existe um meio que permita o crescimento de todos os microrganismos; •É necessária a incubação apropriada para permitir o desenvolvimento das colônias (pode demorar); •Usa-se muita vidraria e é relativamente trabalhoso; •A necessidade de muita manipulação pode originar erros nas contagens devido a erros de diluição e/ou plaqueamento
  • 79. 2. Contagem em placa: “pour plate” e espalhamento
  • 80. 2. Contagem em placa: “pour plate” Principal desvantagem ágar a 50 °C pode eliminar microrganismos! O método por espalhamento não possui esta desvantagem.
  • 81. 3. Filtração Utilizado para concentrar os microrganismos em uma membrana de filtro (porosa). Poros pequenos impedem a passagem de microrganismos! -Amostras de água em riachos, lagos, pois possuem pouca quantidade de células (poluição fecal – coliformes fecais) -Procedimento: Filtro 100 mL de água em seguida coloco a membrana em meio de cultura (incubação) contagem UFC
  • 83. 4. Método do número mais provável (MNP) -É uma técnica estatística baseada: quanto maior o número de bactérias, maior será o número de diluições necessárias para eliminar totalmente o crescimento em tubos contendo meio de cultura. -Técnica utilizada quando as bactérias não crescem em meio sólido -Fornece apenas uma estimativa
  • 84.
  • 85. 5. Contagem direta ao microscópio  Um volume conhecido de uma suspensão bacteriana é colocado em uma área definida da lâmina de microscópio  Uma amostra de 0,01 mL é espalhada na superfície de 1 cm da lâmina e um corante é adicionado  Após a contagem de diferentes regiões da lâmina a média do número de bactérias pode ser determinado – multiplicado por 100 (para se determinar em mL)
  • 86. Vantagem: não precisa de incubação (resultado imediato) Desvantagens: -Não é bom para contagem de bactérias móveis. -As células mortas tb são contadas junto com as vivas -Uma contagem satisfatória necessita de um grande número de células
  • 87. INDIRETOS 1. Turbidimetria • Quando uma bactéria de multiplica em meio líquido, esse meio fica turvo ou com alta densidade de células • Utilização do espectrofotômetro
  • 88.
  • 89. INDIRETOS 2. Atividade metabólica • Assume que a quantidade de um produto metabólico determinado (ácido ou CO2) é diretamente proporcional ao número de bactérias presentes
  • 90. 3. Peso seco • Usado pra medir a quantidade de microrganismo • O Microrganismo é removido do meio de crescimento, filtrado (ou centrifugado) e seco em dissecador, sendo então pesado. • Bom método para fungos filamentosos