O documento descreve a produção, purificação e complexação da violaceína, um pigmento produzido por bactérias marinhas, com β-ciclodextrina para obtenção de fármacos. A violaceína é produzida por bactérias como Cromobacterium violaceum via quorum sensing e possui propriedades antimicrobianas e anticancerígenas. O documento detalha os métodos para isolamento das bactérias produtoras a partir de amostras marinhas, produção, purificação da violaceína e sua complexa

1. Bactérias marinhas produtoras de
Violaceína: prospecção, produção e
purificação para complexação em β-
cliclodextrina para obtenção de
fármacos.
Paulo Marcelo Avila Neto
Projeto apresentado na Disciplina de
Isolmento, preservação e identificação
de micro-organismos.

2. Introdução
Violaceína, um pigmento azul-violeta, é um tipo
de metabólito secundário com vários bioativos importantes produzidos
por várias bactérias Gram-negativas.

3. Produção
A produção de violaceina está sujeita a regulação via Quorum sensing.
O sensoriamento populacional é realizado por meio de pequenas
moléculas, denominadas autoindutores (AI). Os autoindutores podem
ser de diferentes naturezas
químicas: em organismos Gram
negativos, via de regra os
autoindutores são do tipo N-acil
homoserina lactonas (AHL).

4. Como se Forma?

5. Enzimas relcionadas

6. Pra que violaceína???
- Proteção contra efeitos da radiação solar
sobre o microrganismo.
• elevado coeficiente de extinção molar e baixa
solubilidade em água
- Regulação da concentração do triptofano
• esse aminoácido em elevadas quantidades seria tóxico

7. Violaceina
• Propriedades
– Antimicrobianas
– Antifúngicas
– Inseticidas
– Anti células cancerígenas
– Anti-malárico
– Antiviral
– Anti-oxidante
– Etc...

9. Micro-organismos
• Cromobacterium violaceum
– Gram Negativo
– Descrito em 1881, isolado do Rio
Amazonas
• C. fluviatile Janthinobacterium lividum
• Janthinobacterium lividum
• Iodobacterium sp.
• Pseudoalteromonas luteoviolacea
• Duganella sp.
• Collimonas sp.
Pseudoalteromonas sp.
• Massillia sp. Isolada do fundo do mar
produtora de violaceina
Cromobacterium violaceum

10. Micro-organismos
• Geralmente são cocobacilos ou bastonetes
curtos.
• geralmente encontrados em solo e água
(principalmente na interface água-solo).
– Nascentes
– Sedimento
– Rios, lagos e oceano

11. Material e Métodos
• Bioprospecção:
• Sedimento marinho e de
corais da costa brasileira de
diferentes regiões.
• Alternativamente poderão
ser isolados microrganismos
de sedimentos de nascente,
corpo e margem do Rio
Negro – MA.

12. Material e Métodos
Keeble Cross Agar
King’s B Agar Arroz estéril
Autoclave, esfrie a 550c
e
filtrar esteril solução de Meio de Manutenção
neomicina, ciclohexamida e produção de
and nistatina a uma pigmentos
concentração final de 50
mg/l. Peptona pode ser Peptona 20g/l
usada ao invés de Glicerol 10g/l
Casitona. Glicose por ser K2HPO4 1.5g/l
substituido por glicerol MgSO4 1.5g/l
Agar 15g/l
Água 1000ml
Extrato de Lev. 1g/l
pH 7.2
Extrato de carne 1g/l
Casitona 2g/l
Glicose 10g/l
Agar 15g/l
Água 1000
pH 7.3

13. Material e Métodos
Identificação de Micro-organismos.
- Caracterização colonial
- Caracterização de Gram
- Provas bioquímicas
- Identificação rDNA 16s
-As sequencias serão comparadas no GenBank usando
método BLAST.
Análises filogenéticas serão realizadas utilizando o
Software MEGA. Os cladogramas serão construídos usando
método de máxima máxima verossimilhança

14. Material e Métodos
Produção
• A produção de
violaceína será realizada
em shaker e em reator
– Em shaker serão
definidos os parametros
nutricionais e
temperatura para uma
melhor produção
usando DCCR.
– Em reator será realizado
cultivo para determinar
melhor pH, agitação e
aeração.

15. Quantificação e Caracterização
• A violaceína e deoxyviolaceina Violaceína
serão extraídas utilizando Acetato
de Etila (Amotra:Acetato de
Fase Aquosa
Etila, 1:1 v/v), quantificadas por
HPLC, utilizando uma coluna
ZORBAX SB-Aq e fase móvel
MeOH:Água (70:30 v/v) via
absorbância a 577nm e 555nm.
• Serão caracterizadas e
confirmadas utilizando H NMR a
500MHz.

16. Purificação
Cristalização
Secagem em Secagem
Clorofórmio Dietil-eter Etanol Metanol:Água
rotavapor 100ºC
1:1
Secagem a Coleta das HPLC
100 ºC frações x 10 Preparativo
C18
MeOH:H2O (75:25)
De acordo com: Rettori, D., Dura´n, N., 1998. Production, extraction and
purification of violacein: an antibiotic produced by Chromobacterium
violaceum . World J. Microbiol. Biotechnol. 14, 685/688.

17. Complexação em ciclodextrinas
Violacein/-Cyclodextrin Inclusion Complex Formation Studied by Measurements of Diffusion
Coefficient and Circular Dichroism MARIÂNGELA B. M. DE AZEVEDO, JOEL B. ALDERETE, ANTONIO C.
S. LINO, WATSON LOH, ADELAIDE FALJONI-ALARIO and NELSON DURÁN. Journal of Inclusion
Phenomena and Macrocyclic Chemistry 37: 67–74, 2000

18. Complexação
Complexação: Concentrações equimolares
Ciclodextrina em água + Violaceina em acetona
Misturas 1:1, 1:2 e 1:4
Forno a vácuo: 50ºC overnight

19. Avaliação das propriedades
• Caracterização do complexado X
controle ciclodextrina X controle
violaceina
– H RNM
– FTIR
– HPLC • Propriedades
– Antimicrobianas

20. Perspectivas futuras
• Novas derivatizações utilizando dextranas de
baixo peso molecular.
• Verificar eficácia em células tumorais.
• Verificar eficácia contra Tripanossoma cruzi e
outros protozoários.

21. OBRIGADO