Relatório Final de Estágio - Arthur Lima 2-1

Instituto Federal do Rio de Janeiro
Campus Rio de Janeiro
Relatório Técnico de Estágio
Nome: Arthur Lima e Silva
Curso: Biotecnologia
Conclusão do curso: 2011/ 2 (semestre)
Data do Seminário: 2012 /1 (semestre)
Rio de Janeiro
2012

ii
Valorização de resíduos obtidos na produção de biocombustíveis pela produção fúngica de
complexos multienzimáticos
Empresa/Instituição: Fundação COPPETEC
Endereço: Rua Moniz Aragão
no
: 360 complemento: Bloco 1
Bairro: Ilha do fundão / Cidade Universitária Cidade: Rio de Janeiro
CEP: 21941- 972 UF: RJ
Setor (es) da empresa/instituição:
Laboratório de Biotecnologia Microbiana – LaBiM
Responsável da Empresa/Instituição pelo Estágio: Denise Maria Guimarães Freire
Cargo: Professor pesquisador
Professor Orientador no IFRJ: Leila Pontes
Matrícula: 1152476
Sumário

iii
I. Introdução --------------------------------------------------- p.1
II. Objetivo ------------------------------------------------------ p.3
III. Material e Métodos -------------------------------------p.3
IV. Resultados -------------------------------------------------- p.9
IV. Discussão --------------------------------------------------- p.24
VI. Considerações Finais ------------------------------------ p.25
VII. Bibliografia --------------------------------------------------p.25
1. Introdução

iv
O uso do biodiesel como combustível vem se tornando uma alternativa cada vez mais
atraente devido seus benefícios ambientais e pelo fato de ser originado de recursos
renováveis. O custo do biodiesel é a principal dificuldade da comercialização do produto. Óleos
das mais diversas procedências são utilizados como matérias-primas. A transesterificação é o
processo realizado com mais frequência para a produção de biodiesel. Consiste em uma
reação química entre óleos vegetais, tais como o de mamona, dendê, girassol, babaçu,
amendoim, pinhão manso e soja, bem como gorduras animais, com etanol ou metanol.
Durante a obtenção dos óleos vegetais, são obtidos co-produtos, como tortas e farelos, que
podem agregar valor à cadeia de produção do biocombustível.
Na tentativa da valorização de co-produtos, inocula-se esporos de fungos filamentosos
em diversas tortas de oleaginosas, promovendo assim fermentações em estado sólido (FES).
Enzimas degradadoras de matéria-prima podem então ser produzidas. Os microorganismos
são os mais importantes produtores enzimáticos. Os fungos filamentosos Aspergillus são
organismos de importância considerável para muitas indústrias biotecnológicas. Muitas
espécies de Aspergillus, tais como A. awamori e A. oryzae são utilizadas para a produção
enzimática. Essas espécies produzem grande variedade de enzimas extracelulares, nas quais,
amilases e proteases possuem grande importância industrial.
Os fungos A. awamori IOC-3914 e A oryzae 30103 são capazes de produzir um
complexo multienzimático contendo pelo menos cinco diferentes grupos de enzimas: endo- e
exoamilases, proteases, xilanases e celulases, usando torta de babaçu, farelo de soja, torta de
Fermentação no estado
sólido
Torta
fermentada
Processo global
Pre-inóculo
Enzimas
Matéria-prima
Glicose, xilose e
nutrientes
Autólise
do fungo
Nutrientes
Hidrólise
enzimática

v
mamona, dentre outros substratos. O complexo amilolítico representa um dos mais importantes
grupos de enzimas industriais atualmente. Ele atua na hidrólise de resíduos e apresenta
inúmeras aplicações na indústria alimentícia, têxtil, de bioetanol, dentre outras. Esse complexo
é composto por um grupo de enzimas que atuam sinergicamente na quebra de amilose
(unidades de glicose unidas linearmente)e amilopectina (homopolímero de glicose com
ligações lineares e ramificações) em glicose.
Trabalhos mais recentes têm mostrado que tortas residuais obtidas na extração de
óleos vegetais são excelentes substratos para a produção de complexos multienzimáticos por
fermentações no estado sólido. Além disso, essas tortas residuais podem ser hidrolisadas pelo
complexo amilolítico, liberando glicose, e pelas hidrolases acessórias, incluindo celulases,
xilanases e proteases.
Tendo em vista os interesses econômicos e ambientais, a produção enzimática
utilizando resíduos agroindustriais apresenta muitas vantagens sobre as demais matérias-
primas. No Brasil, uma matéria-prima residual abundante é a torta de babaçu., que é originada
no processo de obtenção do óleo de babaçu para a indústria de biocombustíveis.
2. Objetivos

vi
Reaproveitar resíduos vegetais obtidos na cadeia de produção do biodiesel utilizando-
os como matérias-primas para fermentações no estado sólido com fungos do gênero
Aspergillus. Dessas fermentações, obtém-se um extrato multienzimático que pode ser utilizado
para hidrolisar, em baixas temperaturas, as mesmas matérias-primas e originar
monossacarídeos e aminoácidos fundamentais para a produção de meios de cultura, síntese
de etanol, biopolímeros, dentre outros. Esse trabalho visa também a investigação do potencial
fúngico de produção de amilases e outras hidrolases em fermentações no estado sólido de
baixos custos utilizando diferentes resíduos agroindustriais gerados no Brasil.
3. Material e Métodos
3.1 Resíduos utilizados (Provenientes da Petrobras Biocombustíveis)
- Torta de babaçu
- Farinha de babaçu
- Casca de soja
- Farelo de soja
Os resíduos foram moídos, peneirados, pesados em becher de 50 mL (2,5g) e
autoclavados, originando biorreatores em escala laboratorial (bécher + resíduo)
- Moinho
- Peneira. Marca: Granutest/Tyler 14
- Balança analítica. Marca: Gahaka BK 2000
- Autoclave. Marca: Tripoli
3.2 Preparo do pré-inóculo
- Água estéril
- Placa de Petri com Aspergillus awamori IOC-3914 e Aspergillus oryzae 30103 mantidos em
ágar Batata-Dextrose (PDA) a 30ºC por 7 dias
- Pipeta automática P1000. Marca: LabMate
- Fluxo laminar Vertical. Marca: Quimis 216F21R
- Tubos Falcon
- Vortex. Marca: Biomatic 00/09/03
- Câmara de Neubauer. Marca: Bolco germany/ Bright line
- Microscópio óptico. Marca: Zeiss Axioskop 40

vii
- Meio malte 35g/L. Marca: Himedia RM004B-500G
- Shaker. Marca: New Brunswick Scientific/ Innova 42R
- Tubo tipo eppendorf
Sob condições estéreis, em fluxo laminar, pipetou-se 4 mL de água estéril sobre o
fungo crescido em placa de Petri. Com o tip da pipeta, raspou-se o fungo do ágar. Esse
procedimento foi repetido quatro vezes. Após a raspagem, recolheu-se o líquido em tubo
falcon e em tubo eppendorf. Armazenou-se o tubo falcon em geladeira. Sob condições não-
estéreis, dilui-se o conteúdo do tubo eppendorf e realizou-se a contagem de esporos em
câmara de Neubauer. A contagem foi efetuada em relação a cinco quadrantes da câmara
superior e cinco quadrantes da câmara inferior. Multiplicou-se a média da contagem dos dez
quadrantes por 25, pela diluição realizada e por 104
, encontrando-se número de células por
mL contidos na solução. Em seguida, dividiu-se a quantidade inicial de células por mL
desejada (2,25x107
) pela encontrada, obtendo-se o volume a inocular, em µL. Inoculou-se o
volume calculado em meio malte 35 g/L, que foi incubado em shaker por 28 horas a
30ºC/200rpm (pré-inóculo).
3.3 Inóculo
-Fluxo laminar Vertical . Marca: Quimis 216F21R
- Pipeta automática P10.000. Marca: LabMate
- Câmara climática. Marca: Nova Ética 420/CLD-300
Para obter-se uma umidade final de 62%, pipetou-se 4,1mL do pré-inóculo nos
biorreatores em escala laboratorial, sob condições estéreis, homogeneizou-se o sistema e
incubou-se os mesmos em câmara climática a 30ºC e 90% de umidade. Para obter-se uma
umidade final de 57%, pipetou-se 3,3mL do pré-inóculo nos biorreatores em escala
laboratorial, sob condições estéreis, homogeneizou-se o sistema e incubou-se os mesmos
em câmara climática a 30ºC e 90% de umidade. Para cada análise, utilizou-se dois
biorreatores em escala laboratorial no intuito de tornar os resultados mais confiáveis.
3.4 Extração

viii
- Água destilada
- Erlenmeyer 250 mL
- Bastão de vidro
- Centrífuga. Marca: Jouan A14N1.11174614
- Shaker. Marca: New Brunswick Scientific/ Innova 42R
- Pipeta automática P1000. Marca: LabMate
- Tubo tipo eppendorf
Transferiu-se o conteúdo fermentado do biorreator em escala laboratorial para um
erlenmeyer de 250 mL juntamente com 25 mL de água destilada (10 mL de água por grama
de matéria-prima). Masserou-se o conteúdo com bastão de vidro e incubou-se o erlenmeyer
em shaker por 30 minutos a 37ºC/200rpm. Posteriormente, pipetou-se 3,0 mL do conteúdo
do erlenmeyer para dois tubos eppendorf. Centrifugou-se os tubos por 10 minutos/10.000
rpm. Recolheu-se os sobrenadantes em um terceiro tubo. Rotulou-se e armazenou-se em
geladeira para serem dosadas as atividades enzimáticas.
3.5 Análises
3.5.1 Teor de água
- Equipamento: AquaLab – Series 3TE
- Recipientes plásticos circulares
- Água destilada
- Balança analítica. Marca: Gahaka BK 2000
Introduziu-se, no equipamento, um recipiente plástico circular contendo apenas água
destilada com a finalidade de calibrar o mesmo. Posteriormente, pesou-se 0,5 grama do
conteúdo fermentado do biorreator em escala laboratorial em recipiente plástico circular ,
antes do procedimento de extração, e introduziu-se o mesmo no equipamento. Após o
tempo necessário, é informado no visor o teor de água do material.
3.5.2 pH

ix
- pHâmetro . Marca: Mettler Toledo – Seven Easy
Após o procedimento de extração, introduziu-se no erlenmeyer o eletrodo do
pHâmetro. Após o tempo necessário, é informado no visor do equipamento o pH do material.
3.5.3 Atividade Exoamilolítica
- Banho 40ºC. Marca: Kacil BM-02
- Banho 100ºC . Marca: Novatecnica NT248
- Espectrofotômetro. Marca: Biospectro SP-22
- Cubetas de poliestireno
- Pipetas p20,100,1.000. Marca: Eppendorf
- Tips para pipeta
- Presilhas para eppendorf. Marca: Sigma – Aldrich
- Solução de amido 1%. Marca: Vetec
- Reativo de GOD-POD. Marca: Katal
Em uma estante, colocou-se 4 eppendorfs para cada amostra, sendo 1 branco e 3
réplicas. Adicionou-se 10µL da amostra em todos os eppendorfs. Posteriormente, adicionou-se
90 µL da solução de amido 1,0% somente nas triplicatas em seguida levou-se ao banho-maria
à 40ºC por 15 minutos. Em seguida, inativou-se as enzimas levando-as ao banho-maria à
100ºC durante 5 minutos (usou-se presilhas nas tampas dos eppendorfs para eles não abrirem
durante a incubação). Ao retirar deste banho-maria, adicionou-se 90µL de solução de amido
1%, apenas nos brancos de cada tempo e adicionou-se 1mL do reativo de GOD-POD em todos
eppendorfs. Feito isto, levou-se ao banho de 40ºC por 10 minutos para que o reativo
enzimático possa interagir com a reação para então fazer a leitura. A leitura foi feita em cubeta
de poliestireno a 505 nanômetros (nm) no espectrofotômetro.
3.5.4 Atividade Celulolítica

x
- Tips para pipeta
- Solução de carboxi-metil celulose (CMC). Marca: Sigma
- Reativo de GOD-POD. Marca: Katal
réplicas. Adicionou-se 10µL da amostra em todos os eppendorfs. Posteriormente, adicionou-se
90 µL da solução de CMC somente nas triplicatas em seguida levou-se ao banho-maria à 40ºC
por 10 minutos. Em seguida, inativou-se as enzimas levando-as ao banho-maria à 100ºC
durante 5 minutos (usou-se presilhas nas tampas dos eppendorfs para eles não abrirem
durante a incubação). Ao retirar deste banho-maria, adicionou-se 90µL de solução de CMC,
apenas nos brancos de cada tempo e adicionou-se 1mL do reativo de GOD-POD em todos
eppendorfs. Feito isto, levou-se ao banho de 40ºC por 10 minutos para que o reativo
enzimático possa interagir com a reação para então fazer a leitura. A leitura foi feita em cubeta
de poliestireno a 505 nanômetros (nm) no espectrofotômetro.
3.5.5 Atividade Proteolítica
- Pipetas p100,1.000. Marca: Eppendorf
- Tips para pipeta
- Solução de azocaseína 5g/L pH=5,0
- Solução de HCl 1M
réplicas. Adicionou-se 50µL da amostra em todos os eppendorfs. Para os brancos das
amostras, adicionou-se 1mL da solução de HCL 1M. Em seguida, levou-se ao banho-maria à

xi
40ºC, adicionou-se 90µL da solução de azocaseína em cada tubo e incubou-se até completar
5 minutos de reação. Em seguida, inativou-se as enzimas adicionando 1mL da solução de
HCL 1M nas triplicatas. Centrifugar as amostras por 5 minutos a 10000 rpm. A leitura foi feita
em cubeta de poliestireno a 345 nanômetros (nm) no espectrofotômetro.
3.5.6 Atividade Xilanolítica
- Tips para pipeta
- Reagente DNS
- Água mili-Q
- Solução de xilana 10g/L
réplicas. Adicionou-se 10µL da amostra em todos os eppendorfs. Adicionou-se 300µL de DNS
nos tubos referentes aos brancos. Em seguida, levou-se ao banho-maria à 40ºC e adicionou-se
90µL da solução de xilana 1,0% nos eppendorfs a cada 10 segundos até completar 5 minutos
de reação. Em seguida, inativou-se as enzimas adicionando 300µL do reagente DNS apenas
nas triplicatas a cada 10 segundos e levando-os, posteriormente, ao banho-maria à 100ºC
durante 5 minutos. Ao retirar deste banho, adicionou-se 1mL de água mili-Q em cada tubo. A
leitura foi feita em cubeta de poliestireno a 540nanômetros (nm) no espectrofotômetro.
4. Resultados
4.1 Torta de babaçu suplementada com farinha de babaçu (50%):

xii
4.1.1 Cálculo da contagem de esporos
4.1.1.1 Aspergillus oryzae
 Média da contagem: 75,2 esporos
 Diluição: 1x (sem diluição)
 Volume de líquido entre a câmara e
a lamínula: 25 µL
 Fator de correção volumétrico: 104
 Quantidade inicial desejada de
esporos/mL : 2,25 x 107
Cálculo (esporos/mL) : 75,2 x 25 x 1
x 104
= 1,88 x 107
Cálculo volume a inocular no meio
malte (µL): 2,25x107
/1,88x107
=
1.196 µL
4.1.1.2 Aspergillus awamori
 Média da contagem: 170 esporos
 Diluição: 2x
a lamínula: 25 µL
Cálculo (esporos/mL) : 170 x 25 x 2
x 104
= 8,50 x 107
/8,5x107
= 265
µL
4.1.2 Cálculo atividade exoamilolítica:
 Cálculo:
Uxg-1
= (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido
inoculado/ (Vol. Amostra x Massa de matéria-prima pesada)
N° esporos
84
N° esporos
85
N° esporos
89
N° esporos
54
N° esporos
64
N° esporos
176
N° esporos
157
N° esporos
167
N° esporos
161
N° esporos
189

13
Amostra Tempo
(h)
Diluição Abs 1 Abs 2 Abs 3 Atividade (U/g) Média das
Atividades
T.Babaçu 24 1 0,061 0,028 0,083 1,01 0,46 1,37
T.Babaçu 24 1 0,014 0,007 0 0,23 0,12 0,00 0,53
T.Babaçu 48 5 0,131 0,123 0,132 10,01 9,40 10,09
T.Babaçu 48 5 0,137 0,12 0,156 10,47 9,17 11,92 10,18
T.Babaçu 72 10 0,099 0,085 0,08 16,32 14,01 13,19
T.Babaçu 72 10 0,1 0,096 0,1 16,48 15,82 16,48 15,38
T.Babaçu 96 10 0,121 0,106 0,105 19,94 17,47 17,31
T.Babaçu 96 10 0,148 0,133 0,102 24,39 21,92 16,81 19,64
T.Babaçu 120 10 0,094 0,101 0,096 15,49 16,65 15,82
T.Babaçu 120 5 0,275 0,284 0,253 21,02 21,71 19,34 18,34
Amostra Tempo
(h)
Atividades
T.Babaçu 24 1 0,126 0,132 0,13 2,08 2,18 2,14
T.Babaçu 24
1 0,238 0,273 0,226 3,92 4,50 3,72 3,09
T.Babaçu 48 20 0,124 0,125 0,127 40,88 41,21 41,86
T.Babaçu 48 10 0,074 0,08 0,084 12,20 13,19 13,85 27,20
T.Babaçu 72 50 0,118 0,121 0,113 97,25 99,72 93,12
T.Babaçu 72 30 0,135 0,138 0,148 66,75 68,24 73,18 83,04
T.Babaçu 96 50 0,136 0,115 0,105 112,08 94,77 86,53
T.Babaçu 96 30 0,293 0,318 0,323 144,88 157,24 159,71 125,87
T.Babaçu 120 50 0,151 0,154 0,15 124,44 126,91 123,62
T.Babaçu 120 10 0,058 0,072 0,062 8,87 11,01 9,48 67,39
4.1.3 Cálculo atividade Celulolítica
 Cálculo:
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 24 48 72 96 120 144
Atividade(U/g)
Tempo (h)
Atividade Amilolítica
A. awamori
A. oryzae

14
Uxg-1
= (Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido
Amostra Tempo
(h)
Atividades
T.Babaçu 24 1 0,018 0,012 0,005 0,45 0,30 0,12 0,33
T.Babaçu 24 1 0,038 0 0,008 0,94 0,00 0,20
T.Babaçu 48 1 0,023 0,009 0,018 0,57 0,22 0,45 0,27
T.Babaçu 48 1 0 0,014 0,001 0,00 0,35 0,02
T.Babaçu 72 1 0,001 0,027 0,002 0,02 0,67 0,05 0,39
T.Babaçu 72 1 0,012 0,023 0,03 0,30 0,57 0,74
T.Babaçu 96 1 0,051 0,063 0,064 1,26 1,56 1,58 1,32
T.Babaçu 96 1 0,05 0,073 0,02 1,24 1,81 0,49
T.Babaçu 120 1 0,043 0,028 0,028 1,06 0,69 0,69 1,15
T.Babaçu 120 1 0,046 0,07 0,063 1,14 1,73 1,56
Amostra Tempo
(h)
Atividades
T.Babaçu 24 1 0,005 0,027 0,04 0,12 0,67 1,01 1,88
T.Babaçu 24 1 0,1 0,141 0,14 2,47 3,49 3,51
T.Babaçu 48 1 0,006 0,026 0,03 0,15 0,64 0,84 0,33
T.Babaçu 48 1 0 0,003 0,01 0,00 0,07 0,27
T.Babaçu 72 1 0,184 0,27 0,24 4,55 6,68 6,01 6,08
T.Babaçu 72 2 0,116 0,136 0,14 5,74 6,73 6,73
T.Babaçu 96 2 0,169 0,181 0,17 8,36 8,96 8,36 6,94
T.Babaçu 96 2 0,102 0,1 0,12 5,05 4,95 5,94
T.Babaçu 120 2 0,154 0,161 0,18 7,62 7,97 9,11 5,27
T.Babaçu 120 1 0,08 0,082 0,12 1,98 2,03 2,92
4.1.4 Cálculo atividade proteolítica
 Cálculo:
Concentração de FAN (Nitrogênio livre) = (Fator da curva padrão x diluição x absorbância)
0
5
10
0 24 48 72 96 120
Atividade(U/g)
Tempo (h)
Atividade celulolítica
A.awamori
A.oryzae

15
Uxg-1
= média [FAN] x (Vol. de líquido inoculado/ Massa de matéria-prima pesada)/ Tempo de
reação
Amostra Tempo
(h)
Diluição Abs
1
Abs
2
Concentração de FAN Média
FAN
Média das
Atividades
T.Babaçu 24 100 0,522 0,54 396,3 410,0 401,5 140,9
T.Babaçu 24 100 0,508 0,545 385,7 413,8
T.Babaçu 48 250 0,4 0,403 759,3 765,0 770,2 281,6
T.Babaçu 48 250 0,39 0,43 740,3 816,2
T.Babaçu 72 300 0,42 0,473 956,7 1077,4 999,4 365,9
T.Babaçu 72 300 0,429 0,433 977,2 986,3
T.Babaçu 96 400 0,257 0,25 780,6 759,3 747,9 271,2
T.Babaçu 96 400 0,237 0,241 719,8 732,0
T.Babaçu 120 500 0,232 0,235 880,8 892,2 889,3 320,1
T.Babaçu 120 500 0,208 0,262 789,7 994,7
Amostra Tempo
(h)
Diluição Abs
1
Abs
2
Concentração de FAN Média
FAN
Média das
Atividades
T.Babaçu 24 20 0,262 0,288 39,8 43,7 41,8 1,3
T.Babaçu 24 20 0,268 0,282 40,7 42,8
T.Babaçu 48 150 0,354 0,36 403,2 410,0 394,1 136,2
T.Babaçu 48 150 0,329 0,341 374,7 388,4
T.Babaçu 72 200 0,648 0,684 984,0 1038,7 1011,4 371,8
T.Babaçu 72 200 0,678 0,654 1029,6 993,2
T.Babaçu 96 400 0,26 0,246 789,7 747,1 764,6 281,8
T.Babaçu 96 400 0,246 0,255 747,1 774,5
T.Babaçu 120 500 0,197 0,207 747,9 785,9 767,8 281,9
T.Babaçu 120 500 0,191 0,214 725,1 812,4
4.1.5 Cálculo atividade xilanolítica
 Cálculo:
-100
0
100
200
300
400
500
0 24 48 72 96 120
Atividade(U/g)
Tempo (h)
Atividade proteolítica
A.awamori
A.oryzae

16
(Fator da curva padrão x diluição x absorbância/Tempo de incubação) x Vol. de líquido
Amostra Tempo
(h)
Atividades
T.Babaçu 24 1 0,005 0,019 0,024 0,62 2,35 2,97 4,57
T.Babaçu 24 1 0,061 0,065 0,048 7,54 8,03 5,93
T.Babaçu 48 1 0,045 0,044 0,044 5,56 5,44 5,44 5,21
T.Babaçu 48 1 0,042 0,038 0,04 5,19 4,70 4,94
T.Babaçu 72 1 0,047 0,041 0,038 5,81 5,07 4,70 6,61
T.Babaçu 72 1 0,069 0,056 0,07 8,53 6,92 8,65
T.Babaçu 96 1 0,055 0,031 0,046 6,80 3,83 5,68 5,70
T.Babaçu 96 1 0,044 0,057 0,044 5,44 7,04 5,44
T.Babaçu 120 1 0,021 0,026 0,015 2,59 3,21 1,85 4,16
T.Babaçu 120 1 0,028 0,063 0,049 3,46 7,78 6,05
Amostra Tempo
(h)
Atividades
T.Babaçu 24 1 0,023 0,029 0,036 2,84 3,58 4,45 4,53
T.Babaçu 24 1 0,04 0,042 0,05 4,94 5,19 6,18
T.Babaçu 48 1 0,069 0,107 0,09 8,53 13,22 11,12 8,96
T.Babaçu 48 1 0,052 0,063 0,054 6,43 7,78 6,67
T.Babaçu 72 3 0,134 0,145 0,142 49,68 53,75 52,64 40,96
T.Babaçu 72 3 0,119 0,005 0,118 44,11 1,85 43,74
T.Babaçu 96 1 0,267 0,257 0,295 32,99 31,76 36,45 31,41
T.Babaçu 96 1 0,237 0,249 0,22 29,29 30,77 27,19
T.Babaçu 120 1 0,156 0,169 0,176 19,28 20,88 21,75 18,27
T.Babaçu 120 1 0,111 0,129 0,146 13,72 15,94 18,04
4.2 Farelo de Soja
4.2.1 Cálculo da contagem de esporos (A.awamori)
N° esporos
114
N° esporos
104

17
 Diluição: 2x
a lamínula: 25 µL
Cálculo (esporos/mL) : 102,9 x 25 x
2 x 104
= 25,725 x 107
/25,725x107
=
87,5 µL
4.2.2 Cálculo atividade exoamilolítica
 Cálculo:
Amostra Tempo
(h)
Atividades
Farelo
de Soja
24
5 0,066 0,122 0,110 4,91 9,07 8,18 7,50
Farelo
de Soja
24
5 0,096 0,105 0,106 7,14 7,81 7,88
Farelo
de Soja
48
5 0,185 0,191 0,170 13,75 14,20 12,64 12,50
Farelo
de Soja
48
5 0,152 0,153 0,158 11,30 11,37 11,74
Farelo
de Soja
72
1 0,369 0,368 0,337 5,49 5,47 5,01 4,84
Farelo
de Soja
72
1 0,293 0,288 0,300 4,36 4,28 4,46
Farelo
de Soja
96
1 0,290 0,307 0,306 4,31 4,56 4,55 4,45
Farelo
de Soja
96
1 0,310 0,303 0,281 4,61 4,50 4,18
Farelo
de Soja
120
1 0,368 0,336 0,350 5,47 5,00 5,20 4,90
Farelo
de Soja
120
1 0,320 0,294 0,308 4,76 4,37 4,58
N° esporos
97
N° esporos
115
N° esporos
84

18
4.2.3 Cálculo atividade Celulolítica
 Cálculo:
Amostra Tempo
(h)
Atividades
Farelo
de Soja
24
1 0,007 0,005 0,013 0,16 0,12 0,15 1,04
Farelo
de Soja
24
1 0,086 0,041 0,088 1,92 1,94 1,96
Farelo
de Soja
48
1 0,020 0,062 0,012 0,45 0,30 0,27 0,42
Farelo
de Soja
48
1 0,024 0,021 0,016 0,54 0,47 0,50
Farelo
de Soja
72
1 0,070 0,070 0,000 1,56 1,56 1,55 1,36
Farelo
de Soja
72
1 0,033 0,135 0,079 0,74 1,00 1,76
Farelo
de Soja
96
1 0,036 0,096 0,033 0,80 0,77 0,74 1,89
Farelo
de Soja
96
1 0,139 0,149 0,116 3,10 3,32 2,59
Farelo
de Soja
120
1 0,006 0,058 0,070 1,39 1,29 1,56 2,33
Farelo
de Soja
120
1 0,081 0,173 0,128 3,00 3,86 2,85
0
5
10
15
0 24 48 72 96 120
Atividade(U/g)
Tempo (h)
Atividade exoamilolítica
A.awa…

19
4.2.4 Cálculo atividade Proteolítica
 Cálculo:
Amostra Tempo
(h)
Atividades
Farelo
de Soja
24
1 0,275 0,279 0,284 20,75 21,06 21,43 17,43
Farelo
de Soja
24
1 0,180 0,183 0,185 13,58 13,81 13,96
Farelo
de Soja
48
1 0,108 0,103 0,100 8,15 7,77 7,55 9,30
Farelo
de Soja
48
1 0,100 0,162 0,143 11,0 12,23 10,79
Farelo
de Soja
72
1 0,118 0,136 0,129 8,91 10,26 9,74 11,77
Farelo
de Soja
72
1 0,177 0,184 0,192 13,36 13,89 14,49
Farelo
de Soja
96
1 0,116 0,115 0,128 8,75 8,68 9,66 10,45
Farelo
de Soja
96
1 0,152 0,155 0,165 11,47 11,70 12,45
Farelo
de Soja
120
1 0,170 0,185 0,172 12,83 13,96 12,98 14,73
Farelo
de Soja
120
1 0,232 0,212 0,200 17,51 16,00 15,09
-1
0
1
2
3
4
0 24 48 72 96 120
Atividade(U/g)
Tempo (h)
Atividade celulolítica
A.awa…

20
4.2.5 Cálculo atividade Xilanolítica
 Cálculo:
Amostra Tempo
(h)
Atividades
Farelo
de Soja
24
1 0,130 0,155 0,119 15,62 18,63 14,30 10,95
Farelo
de Soja
24
1 0,050 0,043 0,094 6,01 5,17 6,00
Farelo
de Soja
48
1 0,085 0,058 0,121 10,21 13,00 14,54 8,93
Farelo
de Soja
48
1 0,045 0,045 0,065 5,41 5,41 5,00
Farelo
de Soja
72
1 0,140 0,079 0,089 10,00 9,49 10,70 8,15
Farelo
de Soja
72
1 0,048 0,058 0,082 5,77 6,97 6,00
Farelo
de Soja
96
1 0,011 0,003 0,007 1,32 1,00 0,84 1,17
Farelo
de Soja
96
1 0,014 0,010 0,008 1,68 1,20 0,96
Farelo
de Soja
120
1 0,000 0,026 0,001 0,00 0,11 0,12 1,20
Farelo
de Soja
120
1 0,020 0,021 0,017 2,40 2,52 2,04
0
5
10
15
20
25
0 24 48 72 96 120
Atividade(U/g)
Tempo (h)
Atividade Proteolítica
A.awamori

21
4.2.6 Teor de água e pH
Amostra Tempo (h) Teor de água Média Teor pH Média pH
Farelo de
Soja
0
0,989 0,989 6,63 6,63
Farelo de
Soja
24
0,972 0,9735 7,41 7,42
Farelo de
Soja
24
0,975 7,43
Farelo de
Soja
48
0,957 0,965 6,94 7,125
Farelo de
Soja
48
0,973 7,31
Farelo de
Soja
72
0,966 0,953 7,6 7,31
Farelo de
Soja
72
0,94 7,02
Farelo de
Soja
96
0,955 0,9435 7,45 7,465
Farelo de
Soja
96
0,932 7,48
Farelo de
Soja
120
0,849 0,845 6,78 7,015
Farelo de
Soja
120
0,841 7,25
0
5
10
15
20
0 24 48 72 96 120
Atividade(U/g)
Tempo (h)
Atividade xilanolítica
A.awam…
6.5
7
7.5
8
0 24 48 72 96 120
Tempo(h)
pH
Farelo de soja
Torta de
mamona
0
0.5
1
1.5
0 24 48 72 96 120
Tempo (h)
Teor de água
Farelo de…
Torta de…

22
4.3 Casca de soja
4.3.1 Cálculo da contagem de esporos
 Diluição: 10x
 Volume de líquido entre a câmara e a
lamínula: 25 µL
Cálculo (esporos/mL) : 36,2 x 25 x 10 x 104
=
9,05 x 107
Cálculo volume a inocular no meio malte (µL):
2,25x107
/9,05x107
= 249 µL
4.3.2 Cálculo da atividade Exoamilolítica
 Cálculo:
Amostra Tempo
(h)
Atividades
Casca
de Soja
24
1 0,135 0,148 0,136 2,01 2,20 2,02 1,71
Casca
de Soja
24
1 0,090 0,092 0,091 1,34 1,37 1,35
Casca
de Soja
48
1 0,292 0,294 0,284 4,34 4,37 4,22 4,28
Casca
de Soja
48
1 0,272 0,300 0,286 4,04 4,46 4,25
Casca
de Soja
72
2 0,196 0,193 0,215 5,83 5,74 6,39 5,20
Casca
de Soja
72
2 0,146 0,144 0,155 4,34 4,28 4,61
Casca
de Soja
96
2 0,222 0,230 0,245 6,60 6,84 7,28 6,48
Casca
de Soja
96
2 0,211 0,206 0,193 6,27 6,13 5,74
Casca
de Soja
120
2 0,245 0,227 0,270 7,28 6,75 8,03 6,81
Casca
de Soja
120
2 0,199 0,220 0,214 5,92 6,54 6,36
N° esporos
35
N° esporos
33
N° esporos
36
N° esporos
45
N° esporos
32

23
4.3.2 Cálculo da atividade Celulolítica
 Cálculo:
Amostra Tempo
(h)
Atividades
Casca
de Soja
24
1 0,014 0,008 0,007 0,31 0,18 0,16 0,22
Casca
de Soja
24
1 0,013 0,008 0,008 0,29 0,18 0,18
Casca
de Soja
48
1 0,010 0,003 0,005 0,22 0,07 0,11 0,10
Casca
de Soja
48
1 0,001 0,003 0,004 0,02 0,07 0,09
Casca
de Soja
72
1 0,015 0,022 0,026 0,33 0,49 0,58 0,34
Casca
de Soja
72
1 0,016 0,002 0,011 0,36 0,04 0,25
Casca
de Soja
96
1 0,027 0,015 0,019 0,60 0,33 0,42 0,49
Casca
de Soja
96
1 0,025 0,024 0,021 0,56 0,54 0,47
Casca
de Soja
120
1 0,034 0,023 0,040 0,76 0,51 0,89 0,56
Casca
de Soja
120
1 0,017 0,019 0,017 0,38 0,42 0,38
0
2
4
6
8
0 24 48 72 96 120
Atividade(U/g)
Tempo (h)
Atividade Exoamilolítica
A.awa…

24
4.3.3 Cálculo da atividade Proteolítica
 Cálculo:
Amostra Tempo
(h)
Atividades
Casca
de Soja
24
1 0,265 0,324 0,318 12,00 14,67 14,40 13,22
Casca
de Soja
24
1 0,266 0,285 0,294 12,04 12,90 13,31
Casca
de Soja
48
1 0,140 0,149 0,162 6,34 6,75 7,34 7,06
Casca
de Soja
48
1 0,167 0,159 0,158 7,56 7,20 7,15
Casca
de Soja
72
1 0,169 0,164 0,174 7,65 7,43 7,88 7,49
Casca
de Soja
72
1 0,166 0,158 0,162 7,52 7,15 7,34
Casca
de Soja
96
1 0,159 0,151 0,150 7,20 6,84 6,79 7,03
Casca
de Soja
96
1 0,162 0,160 0,150 7,34 7,24 6,79
Casca
de Soja
120
1 0,135 0,145 0,155 6,11 6,57 7,02 6,59
Casca
de Soja
120
1 0,151 0,145 0,142 6,84 6,57 6,43
0
0.2
0.4
0.6
0.8
0 24 48 72 96 120
Atividade(U/g)
Tempo (h)
Atividade Celulolítica
A.awamori

25
4.3.4 Cálculo da atividade Xilanolítica
 Cálculo
Amostra Tempo
(h)
Atividades
Casca
de Soja
24
1 0,068 0,045 0,072 8,17 5,41 8,65 4,39
Casca
de Soja
24
1 0,012 0,003 0,019 1,44 0,36 2,28
Casca
de Soja
48
1 0,031 0,032 0,021 3,73 3,85 2,52 9,31
Casca
de Soja
48
1 0,114 0,128 0,139 13,70 15,38 16,70
Casca
de Soja
72
1 0,183 0,191 0,208 21,99 22,95 25,00 18,11
Casca
de Soja
72
1 0,111 0,090 0,121 13,34 10,82 14,54
Casca
de Soja
96
1 0,313 0,336 0,346 37,61 40,38 41,58 29,68
Casca
de Soja
96
1 0,150 0,129 0,208 18,03 15,50 25,00
Casca
de Soja
120
1 0,252 0,230 0,245 30,28 27,64 29,44 23,35
Casca
de Soja
120
1 0,136 0,140 0,163 16,34 16,82 19,59
0
5
10
15
0 24 48 72 96 120
Atividade(U/g)
Tempo (h)
Atividade Proteolítica
A.awa…

26
4.3.5 Teor de água e pH
Amostra Tempo (h) Teor de água Média Teor pH Média pH
Casca de
Soja
0
0,976 0,976 5,78 5,78
Casca de
Soja
24
0,981 0,981 6,91 7,01
Casca de
Soja
24
0,98 7,1
Casca de
Soja
48
0,979 0,973 6,46 6,45
Casca de
Soja
48
0,967 6,44
Casca de
Soja
72
0,956 0,956 5,58 5,70
Casca de
Soja
72
0,956 5,81
Casca de
Soja
96
0,869 0,849 4,98 4,98
Casca de
Soja
96
0,828 4,98
Casca de
Soja
120
0,841 0,841 4,66 4,65
Casca de
Soja
120
0,841 4,64
0
20
40
60
0 24 48 72 96 120
Atividade(U/g)
Tempo (h)
Atividade Xilanolítica
A.awa…
0.8
0.85
0.9
0.95
1
0 24 48 72 96 120
Tempo (h)
Teor de água
Casca de Soja
casca de
mamona 0
2
4
6
8
0 24 48 72 96 120
Tempo (h)
pH
Casca de Soja
Casca de
Mamona

27
5. Discussão
A contagem de esporos para Aspergillus oryzae indicou 1,88 x 107
esporos/mL. Já a
contagem de esporos para Aspergillus awamori indicou 8,50 x 107 esporos/mL, o que significa
que o A.awamori esporula melhor que o A.oryzae quando em ágar PDA (Dextrose-Batata) por
7 dias a 30ºC.
Quanto as atividades, o A.awamori apresentou maior produção exoamilolítica: 125,87
U/g após 96 horas de crescimento, enquanto o A.oryzae apresentou menor produção: 19,64
U/g após 96 horas de crescimento. A.awamori apresentou maior produção celulolítica: 6,94 U/g
após 96 horas de crescimento, enquanto o A.oryzae apresentou menor produção: 1,32 U/g
após 96 horas de crescimento. A.awamori apresentou maior produção proteolítica: 371,8 U/g
após 72 horas de crescimento. A.awamori apresentou maior produção xilanolítica: 40,96 U/g
após 72 horas de crescimento.
Com isso, fica evidente que o A.awamori teve melhor desempenho em produção
enzimática, em torta de babaçu suplementada, em relação ao A.oryzae. Devido seu
desempenho, o A.awamori foi o único fungo a ser testado em farelo de soja e casca de soja.
Esses testes são importantes para caracterizar as matérias-primas e mostrar em qual delas o
fungo realiza maiores produções enzimáticas.
Em farelo de soja, o A.awamori apresentou pico de produção exoamilolítica de 12,50
U/g após 48 horas de crescimento, pico de produção celulolítica de 2,33 U/g após 120 horas de
crescimento, pico de produção proteolítica de 17,43 U/g após 24 horas de crescimento e pico
de atividade xilanolítica de 10,95 U/g após 24 horas de crescimento. O teor de água, ao longo
do crescimento, se mostrou constante, em torno de 0,9. O pH se mostrou neutro ao longo de
todo o crescimento.
Em casca de soja, o A.awamori apresentou pico de produção exoamilolítica de 6,81 U/g
após 120 horas de crescimento, pico de produção celulolítica de 0,56 U/g após 120 horas de
crescimento, pico de produção proteolítica de 13,22 U/g após 24 horas de crescimento e pico
de atividade xilanolítica de 29,68 U/g após 96 horas de crescimento. O teor de água, ao longo
do crescimento, se mostrou estável, em torno de 0,9. Já o pH oscilou, fato que pode se dar
pela dinâmica de produção de proteases, que leva a produção e consumo de aminoácidos pelo
fungo.
Ao correlacionarmos as matérias-primas, o farelo de soja mostrou induzir melhor a
produção enzimática em geral, em relação a casca de soja. No entanto, a torta de babaçu
suplementada com farinha de babaçu mostrou ser um substrato muito mais rico e indutor de
produção enzimática pelo fungo A.awamori.

28
6. Considerações Finais
O Aspergillus awamori esporula melhor e realiza maior produção enzimática em relação
ao Aspergillus oryzae. É, portanto, o fungo mais interessante para essa pesquisa. A torta de
babaçu mostrou ser uma matéria-prima mais rica em nutrientes, induzindo melhor a produção
de amilases e enzimas acessórias, como celulases, proteases e xilanases. Dessa forma, a
fermentação no estado sólido do fungo Aspergillus awamori em torta de babaçu suplementada
com farinha de babaçu origina um extrato multienzimático rico e de grande interesse para a
pesquisa. Esse extrato poderá ser concentrado por liofilização ou filtração para posteriormente,
hidrolisar as mesmas matérias-primas e originar monossacarídeos e aminoácidos, que são de
grande interesse para a produção de etanol, meios de cultura, biopolímeros, dentre outros.
7. Bibliografia
Castro, A.M., Andrea, T.V., Castilho, L.R., Freire, D.M.G.: Use of mesophilic fungal amylases
produced by solid-state fermentation in the cold hydrolysis of raw babassu cake starch. Appl.
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Castro, A.M., Carvalho, D.F., Freire, D.M.G., Castilho, L.R.: Economic analysis of the
production of amylases and other hydrolases by Aspergillus awamori in solid-state fermentation
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protease-less mutant from Aspergillus awamori var. kawachi. Agric. Biol. Chem. 45: 2675-2681.

Relatório Final de Estágio - Arthur Lima 2-1

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