O documento discute a produção de enzimas de origem animal, especificamente proteases alcalinas extraídas de vísceras de tambaqui. Ele descreve o processo de extração utilizando etanol e sua purificação por precipitação fracionada. Os testes realizados demonstraram que a protease possui alta estabilidade em surfactantes e oxidantes como o peróxido de hidrogênio, além de ser compatível com diversos detergentes. Sua aplicação na indústria de detergentes é promissora por ser de baixo custo e extraída de res

1. PRODUÇÃO DE ENZIMAS DE ORIGEM ANIMAL
Tropical fish alkaline proteases as a laundry
detergent additive
ESPÓSITO, T. S., 2006
Recife-Brasil
Apresentação:
Gleiciane Pinheiro e Mauren Silveira

2. ENZIMAS

3. ENZIMAS DE ORIGEM ANIMAL
Produção de enzimas de origem animal
Enzima Origem Extração Uso
Pancreatina Pâncreas de porco Adição de Auxiliar digestivo
etanol
Renina Suco gástrico do Adição de Elaboração de
quarto estômago ácido queijos italianos;
do bezerro Preparação de
pudins.
Pepsina Mucosa do Ácido Auxiliar digestivo;
estômago de clorídrico _ Produção de
porco hidrolisados
protéicos.
Catalase Fígado e sangue Adição de Degradação do
de (boi e porco). acetona peróxido de
hidrogênio

4. PROCESSO GERAL DE EXTRAÇÃO
ENZIMÁTICA
• Extraídas em solução aquosa antes de serem processadas.
• Tecidos são secos e triturados em partículas pequenas e finas
• Tecidos ainda úmidos são desintegrados (moinhos ou
homogeneizadores)
• Materiais são então, extraídos com água ou solução tampão
adequada
• Resíduos insolúveis removidos por filtração ou centrifugação
(terra diatomácea é adicionada como auxiliar de filtração
do extrato ou da solução de enzima bruta).

5. PRINCIPAIS INDÚSTRIAS
CONSUMIDORAS DE
ENZIMAS

6. CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS

7. PROTEASES

8. SUBCLASSIFICAÇÃO DAS
ENDOPEPTIDASES

9. MODO DE AÇÃO DAS PROTEASES

10. DETERGENTES EM PÓ
Proteases:
pH 9.0-12.0 - Mais utilizadas em detergentes
- Removem manchas de ovo,
sangue, suor, extratos vegetais,...
- Detergentes sem enzimas:
ineficiente para remover manchas
de proteínas.
Aplicação enzimática em - Proteases Alcalinas:
detergentes no Brasil: Possuem pH ótimo alcalino e
-Organon (1968) atuam em temperatura elevada
- Biopresto (Unilever)
- Henkel – Viva (1978-1984)
- Gessy lever: Omo (1989) –
líder de mercado

11. VANTAGEM DA PROTEASE ALCALINA
ANIMAL
• MANTÉM ESTÁVEL MESMO COM ALTAS
CONCENTRAÇÕES DE H2O2 (10%)
• A ESTABILIDADE DAS OUTRAS REQUER
ENGENHARIA GENÉTICA QUE AUMENTA
CUSTOS
• H2O2 É O BRANQUEADOR

12. PROCESSO DE EXTRAÇÃO DA
PROTEASE ALCALINA DE TAMBAQUI
20 mg/ mL de EXTRATO CENTRÍFUGA
Centrífuga
vísceras BRUTO 10 MIN 4°C
10 min 10°C
+0,9% NaCl 45°C-30 min
SOBRENADANTE
+ 0,05 M tris HCl 300 mL
pH 8.0 2hr + ETANOL 4°C
2X
CENTRÍFUGA
FRAÇÃO 1: + 75 mL de 15 min 4°C
tris HCl
0,1 M ETANOL:
pH 8.0 25°C FRAÇÃO 1: 0-30%
FRAÇÃO 2: IDEM FRAÇÃO 2: 30-70%

13. PURIFICAÇÃO
• Purificações baseadas no tamanho da
molécula (centrifugação)
• Purificações fundamentadas nas diferenças
de solubilidade (sal e/ou solventes)
• Purificações baseadas na carga elétrica
ponto isoeletrico-
não reage e precipita
• Purificações fundamentadas na separação
por adsorção seletiva (cromatografia de
afinidade)

14. 1: SDS-PAGE de Proteínas padrões
2: SDS-PAGE de Proteínas do extrato bruto
3: SDS-PAGE de Proteínas precipitadas com 30-70% de etanol
4: Extrato bruto ( atividade proteolítica na azo-caseína)
5: Precipitado com etanol 30-70% (atividade proteolítica na azo-caseína)
66 kDa –
46 kDa –
36 kDa –
29 kDa –
24 kDa –
14 kDa –
1 2 3 4 5

15. ATIVIDADE PROTEOLÍTICA
Atividade Proteína Atividade Rendimento
TESTES Purificação
Total Total (mg) Específica U/mg (%)
Extrato Bruto 46,875 834 56.2 1.0 100.0
Extrato Bruto
44,574 623 71.6 1.3 95.1
aquecido
F1(0-30% etanol 6,971 448 15.6 0.3 14.9
F2 (30-70%)etanol 35,114 481 73.0 1.3 74.9
Sobrenadante
1,921 97 19.8 0.4 4.1
final
AZOCASEÍNA 1% + ESPECTROFOTOMETRIA
PROTEASE
280-260 nm
SULFOAMIDA
ALARANJADA

16. MODO DE AÇÃO DAS PROTEASES

17. EFEITO DE INIBIDORES
Atividade Enzimática
Sustrato Benzamidina TLCK PMSF TPCK
mU/mL
BapNA 1.59 100% 98% 54%
Suc-Phe-p-
0.04 96% 100%
Nam

18. EFEITO DA TEMPERATURA
Em pH 8.0
Temperatura (a)
Estabilidade Térmica (b)incubado 30 min 25°C e depois testada sua
atividade proteolítica de 25°C-80°C

19. EFEITO DE pH
Protease precipitada com Etanol
Atividade Residual
0.1 M Fosfato
Tris-HCl
NaOH/Glicina

20. EFEITO DE SURFACTANTES
E OXIDANTES
Atividade Residual %
Surfactantes (1%)
Depois 30 min Depois 60 min
Saponina 117.5 118.4
Colato de Sódio 94.2 107.3
Tween 20 117.3 108.2
Tween 40 112.0 107.8
SDS 15.1 7.3

21. COMPATIBILIDADE
Incubação
0,2 mg/mL de
Protease 40°C
Atividade Residual
+ 7 mg/mL de:
Surf®
Ala®
Bem-te-vi®
Omo
Multi-Ação®
Tempo/hr

22. INATIVAÇÃO EM H2O2
Curva de Inativação em H2O2
Enzima incubada a
40°C com H2O2 em:
Atividade Residual
5%
10%
15%
Tempo (min)

23. CONCLUSÕES
 Protocolos de extração de Proteases Alcalinas de Tambaqui com
etanol são econômicos quando em escala industrial;
 São estáveis em surfactantes, com exceção do SDS;
 São estáveis na presença de altas concentrações de H2O2 sem
gastos com manipulação genética ou preparações enzimáticas
prévias;
 São compatíveis com vários tipos de detergentes em pó;
 Suportam altas temperaturas como as encontradas em máquinas
de lavar com ciclo programado;
 São extraídos de resíduos da indústria alimentícia, não requerendo
cuidados com meios e crescimento de biomassa;
 Retira da natureza um problema da indústria alimentícia.

24. OBRIGADA!