Este documento descreve um método de cromatografia líquida (CLAE) para quantificar o fármaco voriconazol em amostras de plasma sanguíneo. Ele detalha a metodologia, incluindo a otimização das condições cromatográficas, validação do método e sua aplicação na análise de amostras de participantes do estudo.

1. C R O M A T O G R A F I A
L Í Q U I D A ( C L A E )
19 de abril de 2022

3. INTRODUÇÃO
1
SUMÁRIO
METODOLOGIA
2
3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO
4 APLICAÇÃO DO MÉTODO
5 CONCLUSÃO

4. INTRODUÇÃO
4
VORICONAZOL:
 Aprovado em 2002 Vfend® (Pfizer Pharmaceuticals);
 Derivado sintético do fluconazol (antifúngico);
 C2H3N3 (triazólico);
 Amplo espectro (ótima atividade contra várias espécies,
especialmente contra (Aspergillus spp).

5. INTRODUÇÃO
5
Pó branco
Ponto de fusão 128 ℃
–134 ℃
Fórmula
C16H14N5OF3
Preparo intravenoso (IV):
agente solubilizante éter
sulfobutílico sódico  -
ciclodextrina
Peso Molecular
349,3 g mol-1
Administração via oral
(P/O):
comprimidos

6. Métodos de
Análise
6
Cromatografia Gasosa com
espectrometria de massa
(GC-MS).
;;
Quantificação de azóis
Método microbiológico.
Cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE), com
diferentes detectores.
Cromatografia Líquida com
espectrometria de massa
(LC-MS).
Baseado nos limites de
inibição
Pouco utilizado
(Volatilidade?)
Alisha Smith and Van Leung-Pineda 2016 diz
que foram os primeiros a desenvolver um
método confiavel por CG

7. 7
 Uma das primeiras determinações de
Voriconazol;
 RP-HPLC;
 DETECTOR UV-VIS;
 Utilizou 3 colunas com troca durante a
análises;
 Coluna 1 é de exclusão por tamanho
para separar as proteínas do plasma;
 Diversas fases móveis.

8. 8
 Não utilizou extração nem padrão
interno, apenas centrifugação;
 RP-HPLC;
 DETECTOR UV-VIS;
 COLUNA DE SÍLICA COM PEPTÍDEO;
 Fase móvel acetonitrila-tampão de
dihidrogenofosfato (17:83 v/v);
 Utilizou altura dos picos invés das áreas
para construção da curva;
 Troca frequente da coluna de guarda e
150 análises para pressão de 3000 psi.

9. 9
 Apenas uma etapa de pré-tratamento
de precipitação proteica (Adição de
metanol + centrífuga)
 Padrão interno de carbamazepina
 HPLC/MS
 COLUNA C-18
 Acetonitrila-Água (40:60 v/v) + 0,1% de
ácido fórmico;
 Baixos tempos de retenção (3min)

10. 10
 Desenvolvimento de fase sólida para
extração;
 HPLC/ UV
 Empacotamento em cartucho;
 Metanol-água (60:40 v/v).
 Spike do plasma com fluconazol e
voriconazol
 Não cita tipo da coluna
 Tempos de retenção elevados (
14min)

11. 11
 Apenas uma etapa de pré-tratamento
de precipitação proteica ( Adição de
metanol + centrifuga);
 HPLC/ UV ;
 Padrão interno com clonazepam;
 COLUNA C-18;
 Acetato de amônio/acetonitrila
/metanol (40:20:40 v/v/v);
 Cita poucos dados de precisão e
exatidão;
 Tempo de retenção e limites de
detecção intermediários.

12. METODOLOGIA
12
PRODUTOS QUÍMICOS:
 Acetonitrila;
 Metanol;
 Água ultrapura;
 comprimidos de Voriconazol (200 mg);
 Fluconazol, itraconazol e diclofenaco de sódio (99,9%).
INSTRUMENTOS DE PESQUISA:
 A determinação da quantidade de fármaco em amostras
biológicas foi realizada por CLAE;
 Composto por coluna analítica C-18 (diâmetro interno de 4,6
mm, tamanho de partícula de 5 µm e comprimento de 150
mm);
 Cartucho de proteção pré-coluna RP-18.

13. METODOLOGIA
13
CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS:
 A fase móvel consistia em ACN: Água (60, 40% v/v) bombeada a
taxa de fluxo de 1,5 mL min-1;
 Todos os solventes foram filtrados através de um filtro de
membrana de 0,45 µm e desgaseificados por ultrassom.
 Fluconazol foi adicionado a uma concentração de 02 µg mL-1
como Padrão e o monitoramento dos eluentes foi feito a 254
nm.

14. METODOLOGIA
14
PREPARO DA SOLUÇÃO ESTOQUE:
 As soluções estoques (concentração de 1 mg mL-1) de
voriconazol e fluconazol foram preparados em ACN;
 Armazenados em temperatura de geladeira (2–8◦C);
 Uma série de soluções foi preparada por diluição com fase
móvel;
 01 µg mL-1, 02 µg mL-1, 04 µg mL-1, 06 µg mL-1, 08 µg mL-1 e 10
µg mL-1.

15. METODOLOGIA
15
RECRUTAMENTO DE PARTICIPANTES E PROTOCOLO
PADRÃO
 Comitê de ética do departamento de farmácia, Universidade
Abdul Wali Khan, Mardan, Paquistão;
 Este estudo seguiu “princípios éticos da declaração de
Helsinque para pesquisa médica envolvendo seres humanos” e
“diretrizes de boas práticas clínicas”.
Idade :18 a 35 anos
Saudáveis
IMC: 22,4 a 24,8 kg m-2
Sem uso de outros medicamentos

16. METODOLOGIA
16
Administração de medicamentos e coleta de amostra:
Tempo específicos de 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5;
3,0; 4,0; 6,0; 8,0 e 24 h
5.000 rpm por 10-15 min
armazenadas a -80ºC até a análise

17. 17
Extração de drogas e análise de amostras.
 As amostras de plasma com variconazol congelada foram descongeladas.
 Vortex 5 min;
 Centrifuga 10 rpm por 15 min;
 Retirado o sobrenadante (camada orgânica);
 CLAE.
METODOLOGIA
Plasma (200 µL) Fluconazol (2 µg mL-1) padrão
Acetonitrila (200 µL)

18. 18
Otimização das condições cromatográficas de CLAE.
Otimização da composição e vazão da fase móvel:
 Acetonitrila, mistura metanol:água , vazão de 1,0-1,5 mL min-1.
Otimização do comprimento de onda de detecção (λ):
 Detecção UV-Visível em uma faixa de λ: 210–280 nm.
Otimização de solventes usados para extração de voriconazol:
 n-hexano, acetonitrila e metanol.
Seleção de Padrão interno específico/seletivo:
 Fluconazol, diclofenaco sódico e itraconazol .
METODOLOGIA

19. 19
Validação do método CLAE:
 Curva de linearidade/calibração;
 Precisão;
 Exatidão;
 Limite inferior de detecção e limite inferior de quantificação;
 Especificidade/seletividade;
 Estabilidade;
 Robustez.
METODOLOGIA

20. PREPARO DE AMOSTRA
20
Precipitação de Proteínas e Recuperação do Viriconazol:
 Etanol
 Metanol
 Metanol-Acetonitrila
 Acetonitrila
200 µL de ACN + 200 µL de plasma
Centrifugação a 10000 RPM
por 15 min

21. OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS
21
Otimização da Composição da Fase Móvel e do seu Fluxo:
Várias proporções ACN-H2O:
 50:50, 55:45 e 58:42 v/v – Longos tempos de retenção
 64:36 e 60:40 – Picos mais finos e longos.
Melhores resultados (corrida isocrática)
Otimização do Fluxo:
 Estudou entre 1,0 e 1,5 µL mL-1.
 1,5 µL mL-1. melhor resolução e melhor formato dos picos.

22. OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS
22
Otimização do Comprimento de Onda de Detecção:
λ testados: 200-280 nm.
 254 nm considerado ótimo (maior absortividade molar)
 220 nm para o padrão interno.
 Escolha entre Fluconazol, Diclofenaco de Sódio e Itraconazol.
 Fluconazol apresentou melhor recuperação e resolução.
Otimização do Padrão Interno:

23. VALIDAÇÃO DO MÉTODO
23
Curva de Calibração e Linearidade:
R² = 0,996
(Voriconazol)
R² = 0,995
(Fluconazol)

24. VALIDAÇÃO DO MÉTODO
24
Precisão

25. VALIDAÇÃO DO MÉTODO
25
Exatidão
Nível A: Voriconazol 1 µg mL-1;
Nível B: Voriconazol 2 µg mL-1;
Nível C: Voriconazol 4 µg mL-1.
Todos os níveis: Fluconazol 2 µg mL-1.
Recuperação média: 97,4%

26. VALIDAÇÃO DO MÉTODO
26
Limites de Detecção (LD) e Quantificação (LQ):
LD = 0,01 µg mL-1
LQ = 0,03 µg mL-1

27. VALIDAÇÃO DO MÉTODO
27
Especificidade/Seletividade:

28. OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS
28
Estabilidade
 Solução-Estoque de Voriconazol e Plasma Sanguíneo são estáveis a 25 ºC, 8 ºC e -80 ºC por 48 horas.
 Pequenas variações parâmetros da corrida não alteram significativamente o tempo de retenção, área do pico e a
taxa de recuperação de voriconazol.
Robustez:

29. 29
Parâmetros Média ± DP
Concentração Máxima (μg mL-1) 2,52 ± 0,20
Tempo para Cmáx (h) 2,0 ± 0
Tempo de residência médio (h) 6,1 ± 0,95
Área sob o gráfico (μg.h mL-1) 9,0 ± 0,80
APLICAÇÃO
Concentração
(g
mL
-1
)
Gráfico Concentração x tempo
0,5 h 1 h 1,5 h 2 h 2,5 h 3 h 4h 6h 8 h 24 h
0,22 1,02 1,89 2,52 1,95 1,31 0,78 0,40 0,17 0,039

30. CONCLUSÃO
30
 Um método analítico eficaz para garantia e quantificação de
voriconazol em fluido biológico;
 O método foi econômico, fácil, rápido, simples, preciso,
sofisticado, precisos, robustos e sensíveis;
 Além disso, o método também ofereceu uma técnica LLE, que
exibiu uma boa recuperação de voriconazol junto com
fluconazol;
 Detecção e quantificação de voriconazol em limites
inferiores(também conhecido como LLOD e LLOQ) também foi
determinado;
 O método desenvolvido forneceu excelentes resultados de
todos os parâmetros de validação, ou seja, recuperação,
precisão, seletividade, precisão e reprodutibilidade;
 Este método também pode ser utilizado para laboratório
análise com uma pequena diferença na metodologia para
extração e preparações farmacêuticas de voriconazol.

31. CONCLUSÃO
31
Extração Coluna
Precisão
(%)
Exatidão
(%)
LD
(ng mL-1)
LQ
(ng mL-1)
Recuperação
(%)
Tempo
(min)
Referência
Coluna de
exclusão
C18 8,4 0 até -4,9 - 5 >94 12
Stopher, D. A.
1997.
* GFF* 5,9
-1,4 até -
7,5
80 200 97 7 Péhourcq, F. 2004.
Precipitação
proteína
C18 5,3
-4,3 até -
5,7
- 2.49 >93 3 Lin, D. 2012.
SPE * 3,6
-13,2 até -
23,7
30 50 >78,8 14 Bashir, K. 2020.
Precipitação
proteína
C18 <20 -15 até 15 42 125 - 11,5 Yousefian, S. 2021.
LLE C18 <2
0,211 até
1,43
10 30 >96,4 7 Mushtaq, M. 2020.
* glicina fenilalanina fenilalanina

32. CONCLUSÃO
32
Matriz biológica Características Extração
Fluído Oral
 Fármaco encontrado na forma não
metabolizada
 Microextração em sorvente
empacotado (MEPS)
Urina
 Fármaco e metabolitos são
encontrados em elevadas
concentrações (80%)
 Extração líquido-líquido (LLE);
 Microextração dispersiva líquido-
líquido (DLLME).
Sangue (total, plasma e/ou soro)
 Trata-se de um fluido complexo,
constituído em grande parte de água
(cerca de 80%), proteínas solúveis,
gorduras, sais e células suspensas
 LLE;
 DLLME.
 SPE;
 Microextração em Fase Sólida.

33. REFERÊNCIAS
33
 BASHIR, Kamran; CHEN, Guoning; HAN, Jili; SHU, Hua; CUI, Xia; WANG, Lu; LI, Wen; FU, Qiang. Preparation of magnetic metal organic framework and development of solid phase extraction
method for simultaneous determination of fluconazole and voriconazole in rat plasma samples by HPLC. Journal Of Chromatography B, [S.L.], v. 1152, p. 122201, set. 2020. Elsevier BV.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2020.122201.
 BORDIN, Dayanne Cristiane Mozaner; MONEDEIRO, Fernanda F. da Silva Souza; CAMPOS, Eduardo Geraldo de; ALVES, Marcela Nogueira Rabelo; BUENO, Laís Helena Picolo; MARTINIS, Bruno
Spinosa de. Técnicas de preparo de amostras biológicas com interesse forense. Scientia Chromatographica, [S.L.], v. 7, n. 2, p. 125-143, 2015. GN1 Genesis Network.
http://dx.doi.org/10.4322/sc.2015.022.
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 MUSHTAQ, Mehwish; SHAH, Yasar; SAMIULLAH, ; NASIR, Fazli; KHAN, Haroon; FAHEEM, Muhammad; NADEEM, Atif; KHAN, Sundas; KHAN, Sumaira Irum; ABBAS, Muhammad. Determination
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229, 2011. GN1 Genesis Network. http://dx.doi.org/10.4322/sc.2011.013.

34. REFERÊNCIAS
34
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size-exclusion column. Journal Of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, [S.L.], v. 691, n. 2, p. 441-448, abr. 1997. Elsevier BV. http://dx.doi.org/10.1016/s0378-
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 THEURETZBACHER, Ursula; IHLE, Franziska; DERENDORF, Hartmut. Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Profile of Voriconazole. Clinical Pharmacokinetics, [S.L.], v. 45, n. 7, p. 649-663, 2006.
Springer Science and Business Media LLC. http://dx.doi.org/10.2165/00003088-200645070-00002.
 YOUSEFIAN, Sahar; DASTAN, Farzaneh; MARJANI, Majid; TABARSI, Payam; BARATI, Saghar; SHAHSAVARI, Nahid; KOBARFARD, Farzad. Determination of Voriconazole Plasma Concentration by
HPLC Technique and Evaluating Its Association with Clinical Outcome and Adverse Effects in Patients with Invasive Aspergillosis. Canadian Journal Of Infectious Diseases And Medical
Microbiology, [S.L.], v. 2021, p. 1-6, 12 abr. 2021. Hindawi Limited. http://dx.doi.org/10.1155/2021/5497427.
 YU, Yong; YANG, Yu-Qing; ZENG, Nv-Jin; ZHANG, Hong-Wen; SUN, Lu-Ning; WANG, Yong-Qing. Simultaneous Determination of Voriconazole and Its Voriconazole N-Oxide Metabolite in Human
Urine by Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry. Journal Of Chromatographic Science, [S.L.], p. 1-7, 11 nov. 2021. Oxford University Press (OUP).
http://dx.doi.org/10.1093/chromsci/bmab126.

36. MEPS
36
 Consiste na miniaturização da técnica convencional de SPE;
 As mesmas etapas presentes em SPE convencional
 estão presentes no MEPS. Elas são: aspiração da amostra,
lavagem do sorvente, eluição da amostra e limpeza do
sorvente.

37. LLE
37
Extração Líquido-Líquido:
 É um dos 1º métodos de preparo de amostra;
 Baseado no princípio de partição da amostra entre duas fases
imiscíveis (orgânica e aquosa);
 A eficiência da extração depende da afinidade do analito
investigado pelo solvente de extração, da razão das fases e do
número de extrações.

38. DLLME
38
Micro extração dispersiva líquido-líquido:
 Utiliza uma mistura de 2 solventes orgânicos, um com alta
densidade e imiscível em água (solvente extrator) e outro
miscível no solvente extrator e em água (solvente dispersor);
 Quando essa mistura é rapidamente injetada, uma turbulência
é produzida, acarretando a formação de uma emulsão de
gotículas que dispersam pela amostra;
 Após a centrifugação, a fase sedimentada é retirada e
analisada.

39. SPE
39
Extração em fase sólida
 Uma das técnicas mais utilizadas para extração e/ou
concentração de amostras complexas;
 Baseada no princípio de separação à base de afinidade como
cromatografia em fase líquida, consistindo na separação
líquido-sólido.
 Usada para extrair analitos semivoláteis e não-voláteis de
amostras líquidas e amostras sólidas pré extraídas com
solvente.

40. SPME
40
Microextração em fase sólida
 Consiste na captura dos analitos em uma fibra capilar de sílica
fundida quimicamente modificada, recoberta com uma película
de material apropriado;
 A fase extrativa pode ser posicionada diretamente na fase
líquida (DIRETO) ou, no caso de amostras gasosas, em contato
com o gás/vapor em equilíbrio com a amostra líquida ou sólida
(HEADSPACE).