Apostila pratica farm-odonto

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Apostila pratica farm-odonto

  1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO BIOMÉDICO DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS - DISCIPLINA - BACTERIOLOGIA ORIENTADOR DIDÁTICO: PROFESSOR ALOYSIO CERQUEIRA
  2. 2. Roteiros de aulas Práticas: ASSUNTO 1: Material utilizado nas práticas Técnicas e Processo de Assepsia Microscopia ASSUNTO 2: Meios de Cultura e Técnicas de Semeadura ASSUNTO 3: Esterilização e Desinfecção ASSUNTO 4: Diluição Contagem de UFC viáveis Obtenção de Cultura pura ASSUNTO 5: Coloração Simples Morfologia ASSUNTO 6: Coloração de Gram ASSUNTO 7: Identificação de Cocos Gram positivos ASSUNTO 8: Colimetria: Exame microbiológico da Água ASSUNTO 9: Provas Bioquímicas para Idenitifcação de Bacilos Gram Negativos ASSUNTO 10: Teste de Sensibilidade a Antibióticos ANEXO I Técnicas de Coloração Coloração de Gram Coloração de Zihel-Neelsen (BAAR) Técnica Para Evidenciação de Espiroquetas Método de Albert-Laybourn 1 4 8 14 15 19 23 30 37 42 45 45 45 48 50 53
  3. 3. APRESENTAÇÃO O aprendizado teórico e prático de microbiologia, incluindo a bacteriologia, é muito importante para o profissional farmacêutico. As áreas de atuação em análises clínicas, enzimologia, controle microbiológico de medicamentos e alimentos, entre outras, exigem um profundo conhecimento desta disciplina. Muitas vezes os alunos não percebem a importância da bacteriologia, pois como o curso é ministrado durante o ciclo básico, há uma grande distância entre o curso de bacteriologia e as demais disciplinas nela embasadas durante o curso de graduação. Ao chegarem ao ciclo profissional percebem o quão fundamental ela é para o entendimento de outras disciplinas, assim como, para seu futuro profissional. A presente apostila resulta do processo de atualização e aperfeiçoamento da apostila de aulas práticas de bacteriologia para o curso de Farmácia. A apostila contém explicações teóricas e práticas dos procedimentos a serem realizados em cada aula de forma clara e didática. No final de cada assunto o aluno poderá tirar as suas conclusões da prática executada. Sempre que possível procurou-se utilizar esquemas, gravuras e ilustrações que facilitassem a compreensão do assunto. Cada assunto apresenta uma introdução contendo a teoria do tema abordado, assim como a sua aplicação e importância no exercício da profissão, objetivando o melhor entendimento do tema, dos materiais a serem utilizados, da execução e dos resultados obtidos. Finalmente procurou-se acentuar a importância e aplicação de cada prática no contexto das atividades de um farmacêutico de modo a estimular o aprendizado.
  4. 4. 1 ASSUNTO 1: - Material utilizado nas práticas de Bacteriologia. - Técnica e Processos de Assepsia em Bacteriologia. - Microscopia. INTRODUÇÃO: TÉCNICA E PROCESSO DE ASSEPSIA É importante ter claro os procedimentos que se deve adotar na manipulação segura dos meios, culturas bacterianas, etc, de modo a evitar qualquer tipo de contaminação. Tais procedimentos são denominados genericamente de técnicas de assepsia e incluem: Ä fazer a desinfecção da área de trabalho e a antissepsia das mãos sempre antes e depois de trabalhar (1); Ä trabalhar sempre na área de segurança (aproximadamente 10cm) em volta da chama do bico de Bunsen (2); Ä esterilizar adequadamente alças e agulhas de inoculação antes e depois do seu uso, evitando a criação de aerossóis, para isso aquecendo sempre da base para a ponta (3); Ä flambar a boca dos frascos e tubos antes e depois das inoculações (4). BACTÉRIAS NO AMBIENTE A presença de bactérias pode ser verificada em quase todos os ambientes, no solo, na água, no ar e colonizando o nosso corpo (ex: trato gastrointestinal, pele). A manipulação e conservação incorretas de medicamentos são fatores predisponentes à sua contaminação por microrganismos. Dentre estes podem estar presentes microrganismos patogênicos ou microrganismos deterioradores. Fundamentação Teórica A presença de bactérias é uma constante nos mais variados ambientes. Freqüentemente tais bactérias não estão associadas a nenhum prejuízo. A microbiota intestinal desempenha importante papel na defesa do organismo contra certas infecções; existem
  5. 5. 2 estudos que sugerem que a microbiota normal estimula o desenvolvimento das defesas imunológicas. Ao mesmo tempo que desenvolve atividades benéficas a microbiota pode ser responsável por uma série de doenças oportunistas que podem ser relacionadas, por exemplo, ao uso constante de drogas imunossupressoras, antibióticos e internações em UTI. Muitas infecções causadas por bactérias são adquiridas por contato direto ou veiculadas por alimentos. Ao contrário do que se pensava antigamente, a disseminação de bactérias patogências pelo ar e poeira não ocorre com grande freqüência, pois de um modo geral, não sobrevivem por longos períodos no ambiente externo. Entretanto, estas vias de transmissão podem ser de grande importância em determinadas situações. No caso de bactérias esporuladas a transmissão aérea é mais importante. No ambiente hospitalar deve ser feito o controle microbiano frequentemente para evitar contaminações. Os alimentos são uma importante via de transmissão de doenças bacterianas como a shigelose, salmonellose, cólera e várias outras. O farmacêutico deve estar atento sempre. OBJETIVOS: 1- Apresentar a vidraria e outros materiais de uso corrente em um laboratório de Microbiologia. 2- Executar técnicas de preparo de material e montagem para esterilização. 3- Treinar técnicas de distribuição asséptica. 4- Evidenciar a existência de bactérias no ar, roupas, etc. 5- Explanação sobre o microscópio. Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de constatar a presença de bactérias no ambiente; compreender a importância dos critérios básicos de higiene no ambiente hospitalar e, na produção e manipulação de medicamentos, visando evitar a contaminação dos mesmos por bactérias ambientais; MATERIAL: - Vidrarias. - Outros materiais de uso em um laboratório de Microbiologia. - Água peptonada. - Placas de Petri com Agar simples. - Pipetas e tubos de ensaio estéreis. - Papel, barbante, algodão cardado, gaze. PRÁTICA PARA EXECUTAR: a. Apresentação da vidraria e outros objetos de uso freqüente nos laboratórios de Microbiologia. b. Demonstração, pelo professor, de uma cadeia de assepsia nos trabalhos microbiológicos. c. Cada grupo de alunos treinar, com água peptonada, as técnicas de distribuição asséptica, usando pipetas. Deixar os tubos em temperatura ambiente por no mínimo 48 horas.
  6. 6. 3 d. Abrir as placas de Agar simples (1 por grupo), fora da área de segurança, deixando cada uma por 5’, 10’, 15’ e 20’, fechando quando atingido o tempo respectivo. Incubar a 37o C por 48 horas e analisar o crescimento obtido. e. Evidenciar bactérias da pele, roupa, bancada em meio Agar simples. Inocular em cada quadrante, respectivamente: - a impressão do dedo polegar - um “carimbo” do tecido do jaleco - alguns fios de cabelo - um swab previamente passado sobre a bancada de trabalho Incubar a 37o C por 48 horas e analisar o crescimento obtido ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ 5 min 10 min 15 min 20 min 1.º DEDO 2.º JALECO 3.º BANCADA 4.º CABELO
  7. 7. 4 ASSUNTO 2: - Meios de Cultura - Técnicas de Semeadura INTRODUÇÃO: O estudo das bactérias necessita normalmente do seu prévio isolamento e identificação. Para tanto diversos meios de cultura são utilizados. Define-se meio de cultura como uma mistura de nutrientes, incluindo fontes de carbono, nitrogênio, sais minerais e água, que propiciam o crescimento in vitro de bactérias. A maioria das bactérias cresce em meios de cultura. Exceções são as riquétsias e clamídias que por serem parasitas intracelulares obrigatórios só se desenvolvem in vitro em meios celulares (cultivo celular, ovos embrionados), Mycobaterium leprae e Treponema pallidum. A inoculação das bactérias em diferentes meios envolve várias técnicas de semeadura. Toda a manipulação de culturas bacterianas, meios e instrumental necessário deve ser feita seguindo-se procedimentos básicos de assepsia e antissepsia, visando evitar qualquer tipo de contaminação. MEIOS DE CULTURA Para uma melhor compreensão das diversas finalidades e usos dos meios de cultura, apresentamos a seguir uma breve classificação dos mesmos: A) Quanto à composição: A.1) Naturais – são aqueles de origem vegetal (um pedaço de batata, pão, frutas) ou animal (gema de ovo). A.2) Artificiais – são aqueles constituídos de substâncias químicas podendo ser definidos ou indefinidos (complexos). Ä Definidos: é sabido toda a sua composição. Ä Indefinidos ou Complexos: é desconhecido por si. Sabe-se apenas aproximadamente. Os meios utilizados na rotina são complexos. B) Quanto ao seu estado físico: Ä Líquido – são os caldos, desprovidos de agar. Ä Semi-sólido – são aqueles que apresentam em sua composição até 1% de agar. Ä Sólido – são aqueles que apresentam em sua composição 1,5 a 2,5% de agar. C) Quanto à finalidade e características: ÄSimples – contém apenas componentes básicos para o crescimento de uma bactéria. Ä Enriquecido – meio que tem aumentada a sua capacidade nutricional para a bactéria pela adição de substâncias como gema de ovo, sangue, plasma, soro,, leite. De uso freqüente para bactérias de difícil crescimento (fastidiosas). Ä De enriquecimento – meio seletivo que visa inibir o crescimento de bactérias acompanhantes e permitir o crescimento da bactéria alvo que pretende-se posteriormente isolar aumentando assim a proporção desta em relação às demais. Por ser um meio líquido não destina-se ao isolamento da bactéria.
  8. 8. 5 Ä Seletivo – contêm substâncias seletivas que inibem o crescimento de certas bactérias e permitem o crescimento de outras. São meios sólidos e têm como objetivo isolar culturas puras. Ä Indicadores – meios que permitem a diferenciação visual do crescimento bacteriano facilitando a sua identificação. Freqüentemente os meios seletivos são também indicadorese todos os meios utilizados na confirmação bioqumica dos isolamentos são indicadores. A indicação mais freqüente é a alteração de cor do meio por mudança no pH do mesmo, podendo ainda ser a produção de gás, precipitação de componentes do meio por atividade proteolítica e lipolítica, etc... Ä Estoque – são meios normalmente semi-sólidos com a finalidade de preservar uma cultura bacteriana pura para posteriores utilizações no laboratório. TÉCNICAS DE SEMEADURA MAIS EMPREGADAS NA ROTINA I- Semeadura em meios sólidos A. Meio Inclinado · Em estria sinuosa: semear com alça de platina, em ziguezague, partindo da base para a extremidade da superfície inclinada do meio Este tipo de semeadura permite a obtenção de melhor massa de microorganismos. · Em estria reta: semear com agulha de platina, em estria reta, partindo da base para a extremidade da superfície inclinada do meio, ou em profundidade e superfície. Este tipo de semeadura é utilizada em provas bioquímicas para identificação bacteriana. B. Meios em pé (camada alta) · Em picada: com agulha de platina fazer o inoculo penetrar de 0,5 a 1,0 cm no centro do meio de cultura. Este tipo de semeadura é bastante utilizado para conservação de bactérias no meio de cultura e quando o meio utilizado é semi-sólido, esta semeadura é utilizada para a verificação da motilidade. C. Em Placa de Petri: C.1. Em superfície: · Estrias múltiplas ou esgotamento: fazer o inoculo em um ponto da superfície do meio, flambar a alça, deixar esfriar e daí semear em ziguezague em toda a superfície do meio.
  9. 9. 6 Este tipo de semeadura é empregado para o isolamento bacteriano, obtenção de u.f.c. isoladas. Denomina-se técnica se esgotamento. · Por distensão: com pipeta, colocar no centro da superfície do meio 0,1 mL da suspensão e espalhar uniformemente com swab ou alça de Drigalski. Com swab, obteremos crescimento confluente e com alça de Drigalski, utilizamos para contagem. Utiliza-se este tipo de inoculação para realização de determinados testes, como por exemplo, o antibiograma. C.2. Em profundidade ou disseminação: · Pour plate: depositar na placa de Petri 0,1/ 1,0 mL da suspensão bacteriana. Adicionar 10 mL do meio fundido em tubo de ensaio e resfriado a 45-50º C. Homogeneizar com movimentos giratórios da placa sobre uma superfície plana. Utilizado, para isolamento, contagem e identificação bacteriana, conforme o meio de cultura utilizado. D. Repique por pescaria: colônia em placa de Petri retirada através de uma agulha para um meio de cultura líquido ou sólido Método empregado para isolamento bacteriano. II. Semeadura em meios líquidos · Procedimento para remover microorganismos da cultura em meio líquido2 :
  10. 10. 7 · Procedimento para inocular em caldo simples: · Difusão: com alça de platina ou pipeta, introduzir o inoculo ( ³ 0,1 mL) na massa do meio. Este tipo de semeadura é empregada para obtenção do crescimento bacteriano. É um repique normal. OBJETIVOS: 1- Explanação sobre os principais meios de cultura empregados em laboratórios de Microbiologia 2- Identificação das técnicas de semeadura mais empregadas na rotina bacteriológica 3- Cultivo de bactérias com finalidade de obtenção de cultura pura, ou seja, uma população onde todas as bactérias se originam de uma única célula bacteriana. MATERIAL: - tubos de ensaio com caldo simples, Agar simples e Agar semi-sólido. - Placas de Petri com Agar simples. - Culturas bacterianas em caldo simples, Agar simples (em placa de Petri). - Alça e agulha de platina. PRÁTICA PARA EXECUTAR: Definir meio de cultura, cultivo e condições necessárias ao crescimento de microorganismos (pH, pressão osmótica, temperatura de incubação, etc.). Classificação dos meios de cultura quanto a origem, estado físico, força seletiva. Seqüência da preparação dos meios. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
  11. 11. 8 ASSUNTO 3: - Esterilização e Desinfecção - Ação dos Agentes Físicos e Químicos sobre as Bactérias INTRODUÇÃO: As taxas de crescimento e morte microbianas são fortemente influenciadas por vários fatores ambientais. O controle microbiano compreende uma série de procedimentos com a finalidade de reduzir a quantidade, eliminar, diminuir ou impedir a multiplicação de microrganismos existentes em um determinado equipamento, ambiente, em alimentos ou em superfícies vivas. É de extrema importância apresentando inúmeras aplicações práticas na área médica e de alimentos. A conservação de medicamentos envolve sempre o uso de uma ou mais técnicas empregadas no controle microbiano. Fundamentação Teórica É importante inicialmente definir alguns termos utilizados no controle microbiológico: A) Desinfecção – significa redução do número de microrganismos em superfícies inanimadas (ambiente ou materiais) e conseqüente eliminação de sua potencialidade infecciosa. B) Sanitização – mesmo significado de desinfecção, porém utilizado rotineiramente em indústria de alimentos. C) Antissepsia – significa redução do número de microrganismos em tecidos vivos. D) Esterilização – destruição ou remoção completa dos microrganismos em ambientes ou materiais. E) Assepsia – significa ausência de microrganismos / as técnicas assépticas representam uma série de cuidados que previnem a contaminação. O controle de microrganismos pode ser feito por agentes físicos ou químicos. 1 – Controle Microbiano por Agentes Físicos · Calor É o método mais empregado para destruição de microrganismos por ser barato, eficaz e prático. Quando se tem finalidade esterilizante deve ser calculado para a destruição das formas esporuladas de bactérias, mais resistentes. Pode ser utilizado na forma de calor seco ou calor úmido em função da presença de água. O primeiro mata as bactérias por oxidação protéica, enquanto o segundo por desnaturação protéica. Além disso, o calor úmido é um método de maior eficiência devido à água ser um melhor condutor de calor do que o ar. Ä Calor seco: na ausência de água - Flambagem: contato direto do material a ser tratado com o fogo, é um tipo de esterilização. - Forno ou Estufa: material submetido a uma temperatura de 170 a 180o C por 1 - 2 horas, é um tipo de esterilização, porém não é qualquer material que pode ser submetido a esse tratamento. Utilizado principalmente para vidraria e metais (instrumentos cirúrgicos p. ex.) - Incineração: é a queima total de um material, método utilizado com materiais descartáveis, principalmente aqueles materiais hospitalares.
  12. 12. 9 Ä Calor úmido: na presença de água (ou vapor d’água) - < 100o C: pasteurização (método desinfetante). Muito utilizado para alimentos e bebidas. A pasteurização rápida do leite emprega uma temperatura em torno de 72o C por 15 a 20 segundos, seguida de resfriamento rápido. A pasteurização consegue eliminar cerca de 99,5% de microrganismos, aqueles esporulados são termoresistentes, conseguindo resistir a esse tratamento. Alimentos pasteurizados – leite, sucos industriais. - = 100o C: é a fervura (método desinfetante). O alimento é submetido a uma temperatura igual a 100o C por até 15 minutos. Eficiente contra as formas vegetativas bacterianas mas não destrói completamente as formas esporuladas. - > 100o C: é a autoclavação (método esterilizante). Os materiais e alimentos são submetidos a uma temperatura em torno de 121o C por 15-30 minutos, um tempo e temperatura bem inferiores àqueles empregados em calor seco. Isso é possível pelo emprego de alta pressão interna (1 ATM) na autoclave. A autoclave é similar a uma panela de pressão. · Ultravioleta (radiação não ionizante) Ä Possui uma atividade máxima num comprimento de onda de 260nm, geralmente são desinfetantes e usados em ambientes. - Limitação: não tem poder de penetração, tudo que estiver embalado ou protegido por vidro não é desinfetado, após umas 200 horas de uso da lämpada sua eficiência é diminuída. - Por que mata? ela penetra nos microrganismos e são captadas pelos seus cromossomos, causando mutação letal por serem absorvidos diretamente. · Radiação Gama (radiação ionizante) Ä É um método de esterilização, mais energético que as radiações UV com menor comprimento de onda e desequilibra quimicamente as células irradiadas, todos os seus componentes químicos podem ser alterados. Muito utilizado para esterilização de produtos hospitalares descartáveis em uso crescente em indústrias de alimentos (esterilização superficial). · Filtração Ä Clarificantes: são os filtros domésticos, retém as impurezas grosseiras, são desinfetantes. Ä Esterilizantes: possuem poros iguais ou menores a 1mm podendo reter inclusive alguns vírus. · Outros: Ä Pressão Osmótica (Salga); Dessecação (prod. Alimentícios em pó, liofilização); uso de baixas temperaturas (refrigeração, congelamento) 2 – Controle Microbiano por Agentes Químicos · Fenóis e derivados: é um desinfetante fraco, porém utilizado como um desinfetante de referência para ser comparado com outros produtos. Um coeficiente maior que 1 indica que o produto é mais ativo que o fenol. ® Atuação: fenóis/cresóis – desnaturam proteínas.
  13. 13. 10 OBS: Dos cresóis o mais importante é a creolina, utilizada para pisos e sanitários. O hexaclorofeno é muito usado na antissepsia cirúrgica. · Álcool Etílico: possui vários mecanismos de ação, sendo relativamente eficiente, são solventes de lipídios (ação detergente), são desidratantes (retiram a água das células) e desnaturam proteínas. O álcool etílico pode ser usado como desinfetante ou anti-séptico. O álcool absoluto (não hidratado) é fraco germicida. Um álcool parcialmente hidratado (60- 70%) é mais ativo que o absoluto, pelo maior poder de penetração e conseqüente desnaturação protéica mais rápida. · Cloro / Iodo (Halogênios) - O Cloro é desinfetante de águas, alimentos e pisos. Mecanismo de ação é oxidante. Cl2 + H2O ® HCl + HClO Ácido hipocloroso instável, espontaneamente forma mais HCl e oxigênio nascente, isso que matará os microorganismos. - O mecanismo de ação do Iodo é a sua combinação irreversível com proteínas através da interação com aminoácidos aromáticos, fenilalanina e tirosina, levando à desnaturação das mesmas. É um dos anti-sépticos mais utilizados na prática cirúrgica. · Detergentes catiônicos (agentes de superfície): alteram a permeabilidade de membrana ( ex: compostos quaternários de amônioÞ cloreto de benzalcônio). Mais ativo contra Gram negativos · Sais de Metais Pesados: - Mercúrio (Hg): anti-séptico . Em desuso pelo risco de intoxicação por absorção. - Sulfato de Cobre (CuSO4): desinfetante para águas de recreação. - Nitrato de Prata (AgNO3): anti-séptico, é altamente eficiente contra gonococos, que causam oftalmia em recém-nascidos e gonorréia em adultos com vida sexual ativa. ® Atuação: afinidade por proteínas, inativando enzimas, por isso é importante não ingeri-los. Uso tópico apenas. · Ácidos orgânicos e inorgânicos: Freqüentemente usados na conservação de alimentos. Exs.: ácidos acético, lático, benzóico. · Álcalis: Hidróxido de Sódio (NaOH)= presente nos sabões conferindo a estes a sua relativa ação anti-séptica. Outros: KOH, Ca(OH)2 · Corantes Básicos: mais eficientes contra Gram positivos. Ex.: Cristal Violeta, Azul de Metileno.
  14. 14. 11 · Oxidantes e Redutores - Oxidantes: oxidam componentes celulares levando à morte das células. Ex.: Ozônio (O3), água oxigenada (H2O2), permanganato de potássio, peróxido de zinco. Usados como anti-sépticos. - Redutores: reduzem compostos celulares levando à morte das células. ÞAldeídos e derivados: Formaldeído/ formalina: muito irritante / São usados para desinfectar paredes e pisos. Glutaraldeído: mais ativo e menos tóxico que o formaldeído; esporocida após 6 horas de contato) ÞÓxido de Etileno (gás): é um agente alquilante inativando proteínas e ácido nucléico. Usado em um recipiente fechado que recebe todo material a ser utilizado (contém algumas ampolas de óxido de etileno – líquido), à temperatura de 52o C, este líquido torna-se gasoso, assim, seus vapores são esterilizantes. Usado para esterilização de materiais de borracha ou plástico. A célula microbiana está em equilíbrio, oxidantes e redutores rompem esse equilíbrio, matando a célula. · Antimicrobianos: ao contrário dos anteriores possuem ação seletiva contra microrganismos por isso não serão discutidos neste assunto. OBJETIVOS: - Verificar a eficiência de agentes químicos e físicos sobre as bactérias. Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de conceituar e diferenciar os termos utilizados no controle microbiológico; descrever os agentes físicos e químicos utilizados no controle microbiano; entender o funcionamento de autoclaves e fornos de esterilização, diferenciando calor úmido de calor seco; compreender as diferenças encontradas na destruição de microrganismos esporulados e não esporulados frente à ação do calor; compreender as diferenças encontradas na ação dos diferentes métodos de antissepsia utilizados. MATERIAL: - Placas de Petri com agar simples ou caldo simples - Culturas de E. coli e Bacillus sp - Soluções antissépticas - Gaze - Tripé, tela de amianto e panela EXECUÇÃO: A – Agentes Químicos: observação da ação de antissépticos sobre bactérias a microbiota da pele. a) Numa placa de agar simples dividida em 4 quadrantes fazer a semeadura do 1º quadrante utilizando a ponta do polegar (fazer a impressão digital suavemente para não ferir a camada do meio de cultura); b) Um segundo aluno lava seu polegar com sabão e água por 1 minuto, seca com gaze estéril e inocula o segundo quadrante fazendo a impressão do dedo;
  15. 15. 12 c) Um terceiro aluno faz a antissepsia de seu polegar com gaze embebida no 1º antisséptico por 1 minuto, seca o dedo com gaze estéril e faz depois a impressão no terceiro quadrante; d) Um quarto aluno faz a antissepsia de seu polegar com gaze embebida no 2º antisséptico por 1 minuto, seca o dedo com gaze estéril e faz depois a impressão no quarto quadrante. - Incubar a placa a 37º C por 24 horas e analisar o crescimento. B – Agentes Físicos: calor a) Numa placa de agar simples dividida e marcada em 8 partes semear as culturas bacterianas de E. coli e Bacillus sp. no espaço respectivo ao tempo T0 ; b) Colocar as culturas em banho-maria fervente e reinocular os quadrantes T5, T10, T20 após 5, 10 e 20 minutos de tratamento térmico, respectivamente. - Incubar a placa a 37o C por 24 horas e analisar o crescimento. C – Atividade de Diferentes Agentes Químicos sobre bactérias in vitro (opcional, pois a metodologia é idêntica ao teste de sensibilidade a antimicrobianos) a) Semear uma cultura bacteriana com swab (para crescimento confluente) em uma placa de Petri com agar simples; b) Assepticamente, com pinça, embeber discos de papel de filtro com diferentes agentes químicos; c) Colocar os discos eqüidistantes na placa semeada; - Incubar a 37º C por 24 horas e analisar os dados obtidos. 1.º DEDO2.º DEDO + SABÃO 4.º DEDO + ANTIS. 2 3.º DEDO + ANTIS. 1 -- t0 t10 t5 t20 E B A B C D
  16. 16. 13 Importância da Aula de Controle Microbiano Esta aula é de extrema importância para a área farmacêutica, pois a contaminação microbiana de medicamentos e cosméticos podem causar alterações das suas características sensoriais, tornando-os impróprios para o uso; e promover a degradação de componentes da formulação, podendo comprometer a sua eficácia e segurança ou causar danos à saúde, dependendo do tipo do microrganismo presente, da via de administração utilizada e do estado de saúde do usuário do produto. Os microrganismos, de maneira geral, exigem condições favoráveis para seu crescimento, o que torna algumas matérias-primas livres de contaminação ou, pelo contrário, muito susceptíveis. Estas últimas podem tornar-se substrato para o crescimento microbiano, uma vez que podem ser utilizadas como fonte de carboidratos, proteínas, aminoácidos, vitaminas, sais orgânicos, água, entre outros. Além disso, muitos microrganismos requerem íons metálicos como coenzimas, os quais podem estar presentes nos insumos como impurezas2 . ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________
  17. 17. 14 ASSUNTO 4: - Diluição - Contagem de u.f.c.viáveis - Obtenção de Cultura Pura OBJETIVOS: 1. Metodologia de Diluições 2. Plaqueamento para contagem de u.f.c. viáveis 3. Contagem de u.f.c. viáveis 4. Obtenção de cultura pura MATERIAL: - Tubos com 9mL de salina - Placas de Petri com Agar simples - Alças de Drigalski - Cubas com álcool 70º - Agar inclinado - Caldo simples - Cultura bacteriana em caldo - Pipetas de 1mL PRÁTICA PARA EXECUTAR: a. Diluição A partir da cultura bacteriana, inocular 1mL em 9mL de salina, homogeneizar, retirar 1mL e transferir para outro tubo com 9mL de salina... Obtendo assim, as diluições 1/10, 1/100, 1/1000... b. De cada diluição inocular 0,1mL, em duplicata, na superfície do meio de Agar simples. Semear por distensão com alça de Drigalski. Incubar a 37ºC por 24 horas. c. Contagem da u.f.c. com diluição nº placa 1 + nº placa 2 aplicar na fórmula: 2 ® u.f.c. = nº encontrado x diluição x inoculo d. Repicar u.f.c. para Agar inclinado e caldo simples. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
  18. 18. 15 ASSUNTO 5: - Coloração Simples - Morfologia INTRODUÇÃO: Torna-se necessário fixar e corar as bactérias para o estudo exato da sua morfologia e citologia. Com efeito, a pequenez dos detalhes estruturais, a falta de contraste natural destes detalhes e o movimento das bactérias aliado à sua grande refringência, tornam impossível o estudo morfológico exato destes organismos nos simples exames a fresco. A fixação é a coagulação do protoplasma bacteriano e a sua colagem às lâminas, com o mínimo de deformação, quer dizer, imobilização dos microrganismos e das estruturas celulares. São agentes fixadores o calor, atuando em escala moderada, os vapores de ácido ósmico, o formol, o éter, os sais de mercúrio, etc. Os corantes são substâncias dotadas de cor própria e que uma vez dissolvidas comunicam essa cor às estruturas com as quais são postas em contacto. Os corantes usados em Bacteriologia são produtos artificiais ou sintéticos. Os corantes sintéticos, são compostos orgânicos de estrutura complexa em que um ou mais anéis benzênicos se encontram ligados a um grupo auxócromo e outro cromóforo. a. A função do grupo cromóforo é conferir ao composto a cor. b. A função do grupo auxócromo é permitir a dissociação iónica do corante, tornando-o apto a formar sais e a reagir quimicamente com os tecidos, células e estruturas celulares. Os corantes da Bacteriologia são sais e podem ser classificados em corantes ácidos e básicos. Os corantes básicos são corantes de eleição da Bacteriologia uma vez que as bactérias, possuem carga elétrica negativa. Deste modo, a afinidade eletroquímica torna possível a fixação do radical corado sobre as estruturas celulares das bactérias, o que não sucede com os corantes ácidos cujo radical corado é eletronegativo. Os mordentes são substâncias que reforçam a ação dos corantes, são principalmente usados como mordentes em Bacteriologia, o ácido tânico, o ácido crómico, o ácido fênico, o iodo (Soluto de Lugol), o calor, os alcalis; estas substâncias aumentam a energia de fixação das cores sobre as estruturas celulares. Classificação esquemática das técnicas de coloração 1. Colorações simples ou monocromáticas - em que actua apenas um soluto corante. 2. Colorações duplas ou policromáticas - em que actuam sucessivamente dois solutos corantes. Destas duplas colorações há duas que são de interesse fundamental em Bacteriologia Médica, a coloração de Gram e a coloração de Ziehl-Neelsen3 . OBJETIVOS: 1. Identificação dos vários tipos de corantes de acordo com os diversos métodos de coloração empregados em Bacteriologia. 2. Preparação de esfregaços partindo de meio líquido e de meio sólido. 3. Fixação de esfregaço por meios físicos e químicos.
  19. 19. 16 4.Coloração simples - a coloração de microrganismo com uma única solução de corante3 . Ex: azul de metileno ou fucsina. 5. Observar formas e arranjos bacterianos através de preparações fixadas e coradas. MATERIAL: - Azul de metileno ou fucsina - Solução salina - Lâminas - Culturas em meios líquido e sólido - Alça e agulha de platina PRÁTICA PARA EXECUTAR: 1. Introdução da técnica sobre corantes, sua classificação (naturais, artificiais, básicos e neutros) e quanto ao veículo. Técnicas de coloração simples, duplas e mistas. 2. Preparo de esfregaços e fixação por meios físicos e químicos. a) Preparo das lâminas As lâminas novas oferecem maior garantia para a confecção de boas preparações coradas, não obstante as mesmas possam ser recuperadas depois de usadas. O processo de limpeza e esterilização dessas lâminas implica numa série de medidas que passaremos a enumerar: lavar com água e sabão, mergulhar em solução detergente e deixar em ebulição por cerca de 1 a 2 horas, lavar novamente em água corrente, escorrer e rinsar com água destilada, escorrer e secar. As lâminas devem ser colocadas em frascos fechados contendo álcool. As preparações coradas são feitas em 3 tempos: 1º esfregaço 2º fixação 3º coloração b) Esfregaço - Tirar do frasco uma lâmina esterilizada e enxugar bem - Flambar, rapidamente, nos dois lados da lâmina - Flambar a alça de platina ao rubro e deixá-la esfriar próximo à chama - Tomar o tubo de cultura (em caldo) com a mão esquerda e com os dedos médio e anular da mão direita remover o tampão de algodão da boca do tubo -Flambar a boca do tubo de cultura - A alça de platina, segura entre o polegar e o indicador da mão direita, será introduzida no interior do tubo até tocar no meio de cultura - Flambar novamente a boca do tubo - Fechar o tubo com o tampão de algodão e colocá-lo na estante - Tomar a lâmina com a mão esquerda e depositar no centro da mesma uma gotícula (uma ´alçada``) da suspensão bacteriana - Com movimentos de rotação da alça de platina, o material deve ser bem espalhado a fim de se obter um esfregaço de forma oval, bem fino e uniforme - Deixar secar ao ar e marcar com lápis dermatográfico do lado oposto onde se situa a preparação
  20. 20. 17 Em se tratando de material de cultura em meio sólido, deve ser observado o seguinte: - Depositar uma pequena gota de água destilada ou solução fisiológica estéril no centro da lâmina - Tocar a colônia com uma agulha de platina esterilizada e suspender a mesma na gotícula d`água, de forma a obter um esfregaço fino e uniforme c) Fixação do material A fixação evita que o material se desprenda no decurso das manipulações posteriores. Pode ser feita por: # Agentes Físicos (calor) – consiste em passar a lâmina, com a face onde se acha o esfregaço para cima, na chama do bico de Bunsen 2 a 3 vezes rapidamente # Agentes Químicos – utiliza-se uma substância química como álcool metílico, álcool etílico, álcool-acetona, éter-acetona, formol etc., deixando-se em contato com os esfregaços dessecados durante alguns minutos (2 a 10 minutos). O fixador pode ser posto sobre o esfregaço convenientemente protegido contra a evaporação rápida, ou então o preparado será mergulhado no fixador contido em recipientes apropriados. · Procedimento para preparação do esfregaço e fixação.2
  21. 21. 18 3. Coloração Simples , Método fixado e corado a. Preparo do esfregaço b. Fixação c. Coloração Cobrir o esfregaço com a solução de azul de metileno ou fucsina diluída durante 5 minutos . Lavar, secar com papel de filtro e observar com objetiva de imersão. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
  22. 22. 19 ASSUNTO 6: - Coloração de Gram INTRODUÇÃO: O método de coloração de Gram é o mais utilizado em Bacteriologia e permite a diferenciação da maioria das bactérias em 2 grupos pelas diferenças marcantes na parede celular que apresentam. Baseado nessas diferenças de parede celular os corantes utilizados coram as bactérias Gram-positivas em roxo e as Gram-negativas em vermelho. O método de Gram é utilizado na maioria das infecções bacterianas, permitindo o diagnóstico de algumas delas com bastante segurança. Porém não se aplica para micoplasmas, bactérias desprovidas de parede, micobactérias pela presença de muitos lipídios insolúveis na parede e espiroquetas pela estrutura muito delgada e pouco permeável aos corantes. Fundamentação Teórica A coloração pelo método de Gram é chamada de coloração diferencial porque são utilizados dois corantes e as bactérias ficam coradas em tonalidades diferentes. Isso é possível devido à composição da parede celular das mesmas. Essas bactérias podem ser aeróbias, anaeróbias facultativas e anaeróbias. Possuem a forma de cocos, bacilos ou víbrios (bacilos encurvados). Muitas são patogênicas e outras, membros da microbiota normal do corpo humano. A maioria dos cocos é Gram-positiva com exceção dos gêneros Neisseria e Veillonella que são os únicos Gram-negativos; entre os bacilos Gram-positivos incluem- se aqueles pertencentes aos gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium; os demais bacilos são Gram-negativos (a maioria); os víbrios são Gram- negativos. A investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) das bactérias é etapa inicial de grande importância no isolamento e identificação de bactérias de material clínico bem como de alimentos. No entanto, a identificação completa de uma bactéria sempre necessitará de dados fisiológicos ou genéticos da mesma. O mecanismo da coloração de Gram se refere à composição da parede celular, sendo que as G+ possuem uma espessa camada de peptideoglicano e ácido teicóico, e as G- , uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool (ou ácool-acetona) extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das G- . Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as G- são descoradas. A parede celular das bactérias G+ , em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode ser extraído. Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de bactérias. Nas bactérias G+ , o complexo CV-I é retido na parede após o tratamento pelo álcool, o que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de glicopeptídeo ou peptideoglicano da parede celular. Os poros da parede das bactérias G- permanecem suficientemente grandes, mesmo depois do tratamento pelo álcool, possibilitando a extração do complexo CV-I.
  23. 23. 20 Segundo Trabulsi, na etapa diferencial com álcool, as bactérias G- devido à pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada, em pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular, têm o complexo corado extraído pelo álcool que deixa as células descoradas. OBJETIVOS: 1. Observar e interpretar o mecanismo de reação de Gram como um método de coloração diferencial. 2. Discutir as várias etapas da metodologia e a importância taxonômica do método na Bacteriologia. MATERIAL: - Lâminas. - Culturas em meios líquido e sólido. - Alça e agulha de platina. - Cristal violeta. - Lugol. - Álcool etílico. - Fucsina de Ziehl. PRÁTICA PARA EXECUTAR COLORAÇÃO DE GRAM (MÉTODO CLÁSSICO) a. Preparar um esfregaço fino, secar a temperatura ambiente e fixar pelo calor. b. Cobrir o esfregaço seco e fixado com a solução de cristal violeta (corante) durante 1 minuto. c. Esgotar a lâmina e cobrir com lugol (mordente) durante 1 minuto. d. Inclinar a lâmina 45° e lavar em água corrente. e. Mantendo-a inclinada, diferenciar (lavar) com álcool 95° GL (diferenciador). f. Lavar e depois cobrir a preparação com solução diluída de fucsina de Ziehl (contra- corante) (15 a 30 segundos). g. Lavar e secar entre duas fitas de papel de filtro, delicadamente. h. Colocar uma gota de óleo de cedro no centro do esfregaço. i. Observar com a objetiva de imersão. Vi Lulu Ali A Fumar Algo Cristal Lugol Álcool Água Fucsina Água Violeta
  24. 24. 21 · Procedimento para coloração de Gram5 . Notas: 1. O etanol poderá ser usado como agente descorante fraco. 2. O material dos corantes empregados na técnica, principalmente sedimento do cristal violeta poderá aparecer como artefato. 3. O descoramento para mais ou para menos é resultante de incorreta diferenciação pelo álcool. 4. A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram. Em culturas envelhecidas, células Gram-positivas freqüentemente se tornam Gram- negativas. Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas podem causar danos à membrana da célula, como por exemplo, alterando a permeabilidade dos solventes. Conseqüentemente, o complexo iodo-cristal violeta poderá ser retirado da célula.
  25. 25. 22 5. Se houver um questionamento acerca da Gram-positividade ou Gram-negatividade da cultura, uma coloração de Gram paralela é aconselhável. Para isto, deve-se usar culturas bacterianas conhecidas como G+ (Staphylococcus aureus) e G- (Escherichia coli) como controle. Interpretação: Bactérias G+ coradas em roxo. Bactérias G- coradas em vermelho · Fotomicrografia representativa da coloração de Gram2 . ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
  26. 26. 23 ASSUNTO 7: - Cocos Gram-positivos INTRODUÇÃO: Identificação das bactérias de importância médica à material de colheita: secreções, líquidos biológicos e outros Cocos Gram positivos: Dentre as duas famílias conhecidas (Microcacceae e Streptococcaceae), trataremos dos gêneros e das espécies de interesse à patogênese das infecções. I. Staphylococcus Os estafilococos são cocos Gram-positivos, catalase positiva, que tendem a formar agrupamentos semelhantes a cachos de uva, devido aos seus arranjos irregulares. São bactérias anaeróbias facultativas de fácil crescimento. São amplamente distribuídos na natureza e fazem parte da microbiota normal da pele e mucosas de mamíferos e aves (encontrados principalmente na mucosa da nasofaringe). De todas as espécies existentes, se destacam em patologias humanas o Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus e Staphylococcus haemolyticus. Staphylococcus aureus representa a espécie que está geralmente envolvida em infecções humanas (de origem comunitária e hospitalar) e apresenta uma freqüência de 30 a 40% de portadores na população. Causam diferentes doenças supurativas tais como: furúnculo, impetigo, osteomielite, abcessos de tecidos, pneumonia, meningite, artrite purulenta, etc. Algumas amostras (S. aureus) produzem uma “enterotoxina” que provoca um quadro agudo de intoxicação alimentar, enquanto outros (S. aureus e S. saprophyticcus) causam infecções do trato urinário. São membros normais da microbiota anfibiôntica da pele e membranas mucosas. A colheita do material deve ser realizada com o máximo de assepsia: swab de nasofaringe, fezes, urina. Em se tratando de sangue, este deverá ser colhido com heparina, ou ser desfibrinado, nunca utilizar citrato de sódio, pois o sódio inibe G+ , principalmente em pH próximo a 6. São inibidos pela presença de corantes do tipo Azul de Metileno e Violeta de Genciana. Crescem em meio de Agar Simples, Agar Sangue e Chapman. Suas colônias são redondas, elevadas, opacas e de coloração amarelo-dourado a branco. Cresce em presença de altas concentrações de NaCl, sendo este um fator de estimulação da produção da enzima coagulase. O meio Chapman é seletivo, porque contém 7,5% de NaCl; é indicador porque possui manitol e o indicador Vermelho de Fenol, as UFCs fermentadoras do manitol apresentam-se com coloração amarelas após 24 – 48 horas de incubação a 37ºC. Após o crescimento de colônias típicas fazemos a coloração de Gram para observarmos a presença de cocos Gram + dispostos em grupos (cachos) ou isolados. Diferenciamos o gênero Staphylococcus do gênero Streptococcus através da prova da catalase. A diferenciação das espécies do gênero se dá através das provas de fermentação do manitol, da coagulase, da DNAse, da sensibilidade a novobiocina e da redução de nitratos.
  27. 27. 24 Provas bioquímicas - Prova da Catalase: A prova da catalase se destina a verificação da presença da enzima catalase. A prova pode ser efetuada com o crescimento bacteriano obtido em qualquer meio de cultura, exceto meios com sangue pois este possui catalase, levando a resultados falso- positivos. A catalase é uma enzima que decompõe o peróxido de hidrogênio com formação de água e oxigênio molecular. A verificação da produção dessa enzima por determinada bactéria pode ser feita adicionando-se peróxido de hidrogênio (H2O2 a 30%) a cultura em meio sólido ou líquido, e verificando-se desprendimento de bolhas gasosas (O2). Na ausência de catalase, não há decomposição do peróxido. Uma leitura da prova de catalase pode ser feita de maneira cuidadosa a partir de um crescimento em agar-sangue da seguinte maneira: adiciona-se primeiramente uma gota de peróxido em uma área do meio desprovida de crescimento e em seguida sobre uma colônia a ser testada. Considera-se positivo apenas se o borbulhamento foi mais rápido e intenso sobre a colônia. - Fermentação do Manitol: O manitol é um açúcar que alguns microorganismos são capazes de utilizar como fonte de energia através da fermentação. A prova se baseia na alteração do pH do meio, graças a produção de ácidos durante o processo de fermentação. Essa mudança de pH pode ser observada pela viragem de cor do meio devido a presença do indicador de pH Vermelho de Fenol. A prova pode ser realizada em meios de cultura líquidos ou sólidos. Após a semeadura, o meio deve ser incubado a 37ºC por 18 – 24 horas. Interpretação: à positivo: amarelo à negativo: não há alteração da cor - Prova da coagulase: A coagulase estafilocócica se apresenta em duas formas: coagulase ligada e coagulase livre. A coagulase ligada, presente na parede da célula bacteriana, converte o fibrinogênio em fibrina diretamente, sem o envolvimento dos fatores de coagulação, e pode ser detectado em teste direto em lâmina, utilizando-se da suspensão de Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma citratado, fazendo movimentos circulares e observando-se a formação de coágulo no tempo de 1-2 minutos. Pode-se tornar mais sensível o teste em tubo, por este detectar tanto a coagulase livre quanto a ligada, sendo a prova de escolha. A coagulase livre é produzida e liberada pelo microorganismo, reagindo com o fator de coagulação do plasma, CRF, formando uma substância semelhante, mas não idêntica, à trombina, que converte fibrinogênio em fibrina. Para o teste, utiliza-se plasma citratado humano ou de coelho, estéril, diluído em solução salina na proporção de 1:5. a reação ocorre volume a volume a 37ºC. Estudos recentes demonstraram que a produção da enzima coagulase se intensifica quando o microorganismo é crescido e meio contendo alta concentração de NaCl. Desta forma, aconselha-se a utilização de colônias para a prova, crescidas em Agar Manita (Agar Manitol Salgado) contendo NaCl e Vermelho de Fenol. Este procedimento aumentaria a sensibilidade do teste.
  28. 28. 25 A prova consiste da semeadura de uma alçada do microorganismo em estudo em tubo contendo o plasma diluído e incubação a 37ºC. A menor coagulação é considerada positiva. Devem ser feitas leituras periódicas a cada 1-2 horas, por até 24 horas, pois algumas espécies produzem fibrinogênio, que dissolve o coágulo formado. Aconselha-se também utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S. aureus. - Prova da DNAse: Alguns microorganismos são capazes de utilizar o DNA presente no meio como fonte de energia, através da produção da enzima DNAse. No meio com DNA deve ser feita uma estria simples (reta) ou um spot (ponto de semadura) central com o microorganismo em estudo. Incubar a 37ºC por 24 horas e adicionar ao meio HCl 1N e aguardar a turvação do meio. Lembrando que o DNA é material protéico e que o HCl, como ácido, tem poder desnaturante sobre as proteínas, a turvação do meio é apenas a precipitação do DNA desnaturado. Se a bactéria produzir DNAse, todo o DNA ao seu redor terá sido degradado, então ao adicionar o HCL não haverá turvação nesta área. Portanto, se houver um halo claro ao redor do crescimento bacteriano, o resultado é positivo. - Sensibilidade a Novobiocina: Semear o microorganismo suspeito em placa de Agar simples ou Mueller Hinton com swab, para obtenção de crescimento confluente, e adicionar o disco de novobiocina (5mg/ml). Incubar a 37ºC por 24 horas. As bactérias resistentes não apresentarão halo de inibição, enquanto as sensíveis sim. Interpretação das provas bioquímicas Provas bioquímicas S. aureus S. epidermidis S. sapophyticus Catalase + + + Fermentação do manitol + - - Coagulase +/- - - DNAse + - - Sensibilidade a novobicina R S R Redução de nitratos + - II. Streptococcus Os estreptococos são cocos Gram-positivos, catalase negativo, que tendem a formar agrupamentos em cadeia. Fazem parte da microbiota normal (sendo encontrados principalmente na orofaringe), apesar disso, muitos deles são responsáveis por uma variedade de manifestações clínicas, sendo considerados importantes agentes infecciosos tanto para o homem quanto para os animais. A maioria necessita de meios enriquecidos, geralmente pela adição de sangue para o crescimento. O sistema de nomenclatura é baseado principalmente em características hemolíticas, de acordo com o tipo de hemólise observada em meios contendo sangue (existindo também outros testes para a classificação). Nesse sentido verificam-se três tipos de hemólise: alfa, beta e gama. O gênero apresenta espécies de interesse médico como: Streptococcus viridans, Streptococcus beta hemolíticos do Grupo A (S. pyogenes) e do grupo B (S. agalactiae) e Streptococcus pneumoniae. Os enterococos pertencem atualmente a um
  29. 29. 26 gênero separado e possuem características peculiares. Apresentam-se em forma de cadeia ou em pares, e são Gram positivos. Para o isolamento pode-se recorrer previamente ao uso de meios seletivos ou de enriquecimento. O meio de seletivo específico para estreptococos mais usado é o caldo Hitchens-Pike, seletivo por apresentar azida sódica e cristal violeta. Um meio alternativo para enriquecimento é o caldo tioglicolato de sódio, adequado para o crescimento de bactérias, inclusive aquelas microaerófilas e anaeróbias. O meio clássico de isolamento de estreptococos é o agar sangue aonde pode-se observar o perfil hemolítico dos mesmos. Os Streptococcus foram descritos em 1874 por Billroth, causando exsudato purulento em lesões de erisiplela e em feridas infectadas. Em seguida, foram isolados do sangue de pacientes em estado febril, e da garganta de crianças com escarlatina. Em 1903, Schottmuller propôs que os estreptococos fossem classificados conforme a capacidade de lisar hemácias “in vitro”. Em 1919, Brown chamou de a, b e g as lises observadas nas hemácias em placas de Agar sangue. Os estreptococos a hemolíticos apresentam zonas de hemólise parciais, com hemácias integras na parte mais interna (junto à colônia) e hemólise maior na parte mais externa. Frequentemente aparece uma coloração esverdeada na área de hemólise (devido a alteração da hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da célula bacteriana), que originou a qualificação “estreptococos do grupo esverdecente” ou Streptococcus viridans. O Streptococcus pneumoniae apresentam hemólise a e colônia puntiforme com aprofundamento no ápice da colônia (parecendo um pequeno vulcão) Os estreptococos b hemolíticos produzem uma zona de hemólise total,, não se observando hemácias íntegras (microscópio óptico com objetiva de 10x). O Streptococcus pyogenes apresenta dois tipos de hemolisinas: O e S a hemolisina O é destruída pela ação do oxigênio atmosférico, e, portanto, só demonstrada em colônias crescidas em profundidade no Agar Sangue. A hemolisina S é estável ao oxigênio do ar e produz hemólise mesmo nas colônias crescidas na superfície do meio de cultura. Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam hemolisina O, se torna necessária a semeadura do microorganismo pela técnica do pour-plate. Os estreptococos g são anemolíticos, ou seja, não produzem hemólise nomeio. Muitas das espécies saprófitas são deste grupo. As colônias de estreptococos isoladas em agar sangue são puntiformes (< 1mm de diâmetro), transparentes à luz transmitida e peroladas à luz refletida. Os estreptococos são negativos na prova de catalase o que os diferencia dos estafilococos.
  30. 30. 27 Na identificação de estreptococos além do perfil hemolítico, a determinação do Grupo Lancefield (carboidrato antigênico de parede) é importante. No entanto, em função do custo desta investigação outras provas auxiliares são realizadas para a identificação das principais espécies. O esquema abaixo apresenta estas provas: Cultura (“pour plate”) Fazer uma suspensão do material colhido em um tubo contendo 1 ml de solução fisiológica estéril e adicionar a uma placa de Petri estéril. Juntar o Agar Sangue fundido e resfriado e promover a difusão do inóculo no meio através de movimentos circulares. Incubar a 37ºC por 18 horas em atmosfera de microaerofilia ara melhor rendimento, ou jarra com vela. Leitura: Observação do tipo de hemólise em Agar Sangue. · Beta hemólise produzida por Streptococcus viridans em Agar Sangue4 . Provas bioquímicas - Prova da optoquina: Colocar um disco de optoquina na superfície do Agar Sangue (pode-se incluir no antibiograma). Havendo impedimento do crescimento das colônias ao redor do disco de optoquina (2 cm de diâmetro), trata-se de teste positivo.
  31. 31. 28 - Bile solubilidade: A prova é realizada conforme esquema que se segue: à a 1,0 ml de cultura em calo, adicionar uma gota de vermelho de fenol; à acertar o pH em aproximadamente 7,5 com NaOH 0,1N (cor rósea); à adicionar aproximadamente 4 gotas de desoxicolato de sódio ou bílis; à incubar juntamente com o tubo sem bílis a 37ºC por 3 horas. * clareamento: positivo * inalterado: negativo - Bacitracina: Utilizar discos impregnados com bacitracina (0,04 U) colocados na superfície do meio de cultura semeado com o microorganismo em estudo (pode-se incluir no antibiograma) e incubar a 37ºC por 24 horas em microaerofilia. * Grupo A: sensível a bacitracina * demais grupos: resistentes - Crescimento a 56ºC: Para evitar dúvidas entre estreptococos e enterococos (Streptococcus faecalis), submeter a cultura a um aquecimento a 56ºC por 30 minutos. Somente os enterococos resistem a este tratamento. - Crescimento em Agar Chapman: Os enterococos toleram altas concentrações de NaCl, como acontecem com Staphylococcus. - Crescimento em Agar EMB: Os enterococos suportam a presença de corantes, como o azul de metileno OBJETIVOS: 1. Isolamento de bactérias das vias aéreas superiores. 2. Identificação bioquímica através da interpretação do metabolismo microbiano. MATERIAL: - cultura de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis 1a aula: swabs estéreis, tubo com solução salina, Agar Chapman, Meio de Tioglicolato (ou de Hitchens-Pike). 2a aula: Agar sangue, Caldo simples ou BHI, Agar inclinado, Agar DNAse, dessecador com vela. 3a aula: reativo para catalase (H2O2), reativo para DNAse (HCl 1N), reativo para coagulase (plasma sangüíneo), tubo controle positivo, lâminas e conjunto de coloração de Gram. PRÁTICA PARA EXECUTAR 1º DIA: a. inocular swab de orofaringe em Caldo Hitchens-Pike ou Tioglicolato.
  32. 32. 29 b. inocular swab de nasofaringe em Agar Chapman pela técnica de esgotamento. c. Incubar a 37°C por 24 horas. 2º DIA: a. semear material do crescimento em Tioglicolato em placa de Agar Sangue, pela técnica de esgotamento e incubar em microaerofilia pela técnica da vela. b. inocular a UFC típica de Staphylococcus nas provas bioquímicas (catalase, coagulase e DNAse) c. realizar a coloração de Gram 3º DIA: a. leitura e interpretação da placa de Agar Sangue, caracterizar a presença de colônias típicas de Streptococcus e seu eventual padrão hemolítico no meio de Agar Sangue. d. leitura e interpretação das provas bioquímicas, usando os reativos próprios. Importância da Aula: É de suma importância para o profissional farmacêutico o conhecimento dos cocos Gram positivos, pois eles são responsáveis por diversas infecções humanas. Staphylococcus aureus (o + importante representante) causa abcessos, endocardites e osteomielites, intoxicação alimentar e síndrome do choque tóxico. S. epidermidis pode causar endocardites e S. saprophyticus causa infecções do trato urinário. Os estreptococos produzem uma grande variedade de infecções como faringite e infecções celulares à septicemia (Streptococcus agalactiae causa infecção urinária em gestantes). Tb podem causar desordens imunológicas como febre reumática e glomerulonefrite aguda (causada por Streptococcus pyogenes). ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
  33. 33. 30 ASSUNTO 8: - Colimetria. INTRODUÇÃO A água é elemento fundamental para a sobrevivência humana. Sua grande utilização no abastecimento público, na recreação, na industria, no uso domestico atesta essa importância vital. As águas para abastecimento podem ser poluídas por servir de reservatório para espécies microbianas patogênicas e permitir a sobrevivência das mesmas, e é reconhecida desde os primórdios da civilização. Várias doenças podem ser veiculadas pela água, tais como cólera, febre tifóide, disenterias, leptospirose, tuberculose, hepatite, poliomielite, doenças parasitárias e fúngicas. Essas doenças são resultantes da ingestão de água e alimentos contaminados ou do emprego de água poluída pela irrigação, pesca, lazer, piscicultura, cultura de marisco. Em cidades onde existe um sistema eficiente de esgotamento sanitário, o esgoto doméstico é um dos principais responsáveis pela poluição das águas, estimulando o crescimento de microrganismo. A assimilação destes contaminantes orgânicos biodegradáveis é realizada com o concurso de bactérias presentes, por meio de um processo, que consome o oxigênio dissolvido na água dos rios ou reservatórios. Quando a carga de matéria orgânica biodegradável presente na água, e o OD (Oxigênio Dissolvido), que mede a concentração de oxigênio disperso na água (Soares, 1999). Além dos esgotos domésticos, os efluentes industriais e o escoamento superficial urbano contribuem grandemente na poluição dos corpos d’água. Os efluentes industriais contem grandes números ou metais pesados. O escoamento superficial urbano contém todos os poluentes que se depositam na superfície do solo na ausência de chuvas, como lixo e matéria orgânica. Estes acumulados no solo, valas e bueiros são arrastos quando da estação chuvosa para os cursos d’água superficiais, constituindo-se numa outra fonte de poluição (Soares, 1999). Os microrganismos dotados de potencial patogênico chegam às extensões hídricas procedentes das excreções intestinais do homem e de outros animais. Embora já existam métodos desenvolvidos para a detecção de vários organismos patogênicos de veiculação hídrica, os mesmos não são aplicáveis na rotina devido ao alto custo e necessidade de pessoal especializado (CETESB, 1993). Uma alternativa para a avaliação da qualidade sanitária da água é a pesquisa de organismo não patogênicos constituintes da microbiota normal das fezes de animais de sangue quente, que quando encontrados indicam a ocorrência de contaminação fecal, evidenciando o risco da presença de patógenos. Fezes humanas contém de 20-30 % de resíduos alimentares não digeridos, sendo o restante constituído de água e bactérias. NO indivíduo saudável essas bactérias constituem os habitantes normais do intestinos onde a Escherichia coli é a representante característica. O número desses microrganismos pode atingir XXXXcélulas/g de fezes. Assim a presença da Escherichia coli em alimentos e água é indicativo de contaminação fecal e possibilidade de presença de patógenos entéricos. Microrganismos indicadores de poluição de água são utilizados para monitorar, classificar e restringir o uso das águas. Um indicador ideal deveria preencher os seguintes critérios: 1. Ser aplicável a todo tipo de água; 2. Estar presente simultaneamente com os microrganismos patogênicos, com um tempo de sobrevivência igual àquele patógeno entérico mais resistente; 3. Não se reproduzir em águas contaminadas, para não resultar em valores aumentados ( HAGLER E MENDONÇA- HAGLER, 1998 ).
  34. 34. 31 Não se conhece nenhum microrganismo ou grupo de microrganismo que atenda a todos esses requisitos, mas há vários que se aproximam das exigências referidas e que são muito úteis. As bactérias empregadas como indicadores de poluição fecal em águas são: os coliformes totais, coliformes fecais, estreptococos fecais e o Clostridium perfringens. Contagens de Salmonella e de bactérias do gênero Bifidobactérias têm sido propostas. O Indicador microbiológico mais empregado é o grupo dos coliformes. Este e outros indicadores de poluição orientam a margem de segurança sanitária de água potável, da água utilizada para fins recreativos e dos cultivos de organismos marinhos comestíveis. A Organização Mundial de Saúde (OMS) recomenda para águas recreacionais um máximo de 100 coliformes fecais por 100ml de água. COLETA DE AMOSTRAS A coleta de amostras para exame microbilógico deve ser feita em garrafas esterilizada que tenham sofrido tratamento prévio de limpeza e rinsagem com água destilada. → Água clorada: adiciona-se 0,1 ml de tiossulfato de sódio 10% para cada 250ml de água para neutralizar-se o cloro livre presente, impedindo que continue com propriedades desinfetantes entre o período da coleta e o momento da inoculação, impedindo que continue com propriedades desinfectantes entre o período da coleta e o momento da inoculação. →Água com alto teor de cobre e zinco: coleta na presença de um agente quelante, de forma a reduzir a toxicidade provocada pelos metais ( 0,3 ml de EDTA a 15%, ph = 6,5para cada 120mL de água ). Quando a amostra for coletada, deve ser deixado um espaço livre na garrafa (cerca de 2,5 cm) para facilitar a homogeneização antes da inoculação. As garrafas devem ser mantidas vedadas até o momento da coleta da amostra e devem ser tomados todos os cuidados de assepsia no momento da coleta, de forma a evitar contaminações secundárias. *PONTO DE COLETA 1. Água da torneira a. Abrir a torneira e deixar correr por 5 minutos, para eliminar as impurezas e a água na acumulada nas tubulações. b. Com algodão embebido em álcool, passar na abertura e internamente e em seguida flambar. c. Abrir a torneira novamente por mais 1 a 2 minutos. d. Abrir o frasco esterilizado e coletar a água. Introduzir água no frasco até cerca de três quartos do seu volume. e. Tampar o frasco e transportar imediatamente ao laboratório. 2. Poços e Cisternas a. Preparação do frasco – amarrar o frasco e uma pedra como contrapeso com um barbante para facilitar a descida no poço. b. Descer o frasco dentro do poço sem permitir que o mesmo toque nos lados. c. Submergir o frasco completamente na água.
  35. 35. 32 d. Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da água para criar um espaço de ar e colocar a tampa no frasco imediatamente. 3. Rios, Lagoas e Mares a. Coleta da amostra de água de rios e lagoas – nestes casos deve-se mergulhar o frasco até uma profundidade de 20cm, com abertura voltada em direção contrária a corrente, a fim de evitar a contaminação da água com as mãos. b. Coleta da água do mar – a coleta deve ser feita na região onde as pessoas costumam banhar-se, que corresponde à profundidade aproximadamente de 1,0 m, que é a região das praias mais utilizada para a recreação de contato primário, na maré baixa e 24 horas sem chuvas. ACONDICIONAMENTO E TRANSPORTE DA AMOSTRA PARA O LABORATORIO O ideal é a análise iniciar-se até 1 hora após a coleta. Caso isto seja impossível, a amostra deve ser transportada sob refrigeração. A amostra deve ser mantida entre 4 a 10 graus Celsius no prazo máximo de até 30 horas após a coleta. Amostras presumivelmente poluídas têm de ser inoculadas no máximo após 6 horas da coleta. Entre o recebimento da amostra e o inicio da inoculação, a mesma deve ser mantida em geladeira (cerca de 5 graus Celsius). EXAMES BACTERIOLÓGICOS DA ÀGUA O exame bacteriológico da água é feito através de dois processos: Contagem de bactérias heterotróficas viáveis na água e determinação ou estimativa do número de bactérias coliformes. A metodologia padrão empregada no exame bacteriológico da água, para medida do grupo coliforme, inclui dois procedimentos: a técnica dos tubos múltiplos e a técnica da membrana filtrante (“Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater” -APHA, 1980). A. Determinação de coliformes pela técnica dos tubos múltiplos – NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) A técnica do número mais provável consiste no exame de uma série de tubos onde foram inoculados volumes diferentes de amostra. O valor obtido resulta da consulta da tabela que foram estimuladas com base em fórmulas de probabilidade. Considerações teóricas e determinações repetidas em grande escala indicam que este tipo de técnica tende a fornecer valores mais elevados do que o número real. As disparidades tendem a diminuir quando se adota séries com maior número de tubos em cada diluição. Portanto, a sensibilidade do teste depende do número de tubos adotados. Existem várias tabelas de NMP e a escolha da série a ser adotada é função das características microbiológicas da amostra.
  36. 36. 33 Tabelas de NMP/100 ml de amostra: a. 5 X 10 ml ----- 2,2 > NMP 16 b. 5 X 10 ml ----- 2,2 > NMP > ou = 240 1 X 1 ml 1 X 0,1 ml 3) 3 X 10 ml ----- 3 > NMP > ou = 2400 3 X 1 ml 3 X 0,1 ml 4) 1 X 50 ml ------ 1 > NMP > ou = 240 5 X 10 ml 5 X 1 ml 5) 5 X 10 ml ----- 2 > NMP > ou = 2400 5 X 1 5 X 0,1 ml 6) 5 X 50ml ----- 1 > NMP > ou = 240 →OBS: nos tubos onde o inoculo é de 10 ou 50 ml, usar concentração dupla do meio e volume igual ao inoculo. TABELA DOS PADRÕES MICROBIOLÓGICOS DE PROBABILIDADE VIGENTES TUBOS POSITIVOS POR: Nmp PARA 100 ml 10 ml 1 ml 0,1 ml 3 tubos 0 0 0 < 3 0 0 1 3 0 1 0 3 0 2 0 6 1 0 0 4 1 0 1 7 1 1 0 7 1 1 1 11 1 2 0 11 2 0 0 9 2 0 1 14 2 1 0 15 2 1 1 20 2 2 0 21 2 2 1 28 2 3 0 30 3 0 0 23 3 0 1 39 3 0 2 64 3 1 0 43
  37. 37. 34 3 1 1 75 3 1 2 120 3 2 0 93 3 2 1 150 3 2 2 210 3 3 0 240 3 3 1 460 3 3 2 1100 3 3 3 2400 Água potável: Ausência de coliformes totais Ausência de coliformes fecais Teste Presuntivo Inocular, após a escolha da tabela, dem tubos contendo caldo lauril sulfato triptose ou caldo de lacose em concentrações dupla ou simples. Os tubos devem conter tubinhos de Durham. Ocriscimento com formação de gás significa teste presuntivo positivo para coliformes totais. Os tubos que não apresentarem formação de gás com 24 horas de incubação devem ser incubados até 48 horas. Os tubos positivos com 24 horas devem ser imdiatamente inoculados nos meios de confirmação para se evitar que um crescimento muito abundante provoque o abaixamento do pH, o que pode provocar resultados falsamente negativos. Teste de Confirmação Coliformes Totais A partir dos tubos dom formação de gás, semear por alçada (diâmetro=3 mm) em tubos contendo caldo de bílis para igual número de tubos contendo caldo EC. Incubar os tubos a 35 ± 0,5º por 48 ± 3 horas. A formação de qualquer quantidade de gás constitui teste positivo para coliformes totais. Coliforems Fecais Dos tubos positivos do teste presuntivo, transferir com uma alça de platina uma pequena porção do meio para igual número de tubos contendo caldo EC. Incubar os tubos a 44,5 ±0,2 ºC por 24 horas. A presença de gás no interior dos tubinhos de Durhan é considerada reação positiva, indicando contaminação de origem fecal. A ausência de gás mesmo com evidência de crescimento indica a presença de coliformes de outra fonte que não seja de intestinos de animais de sangue quente.
  38. 38. 35 Teste complemento A partir dos tubos positivos de caldo bílis verde brilhante, semear por estrias em placa contendo endo agar ou azul de metileno agar (agar EMB). Incubar a 35 ± 0,5ºC por 24 ± 2 horas. Colônias típicas: Meio endo agar - colônias vermelhas Meio agar EMB - colônias verdes com centro escuro. De cada placa, escolher uma ou mais colônias típicas e bem isoladas; transferir cada colônia para tubos contendo caldo de lactose ou caldo lauril triptose e para um tubo inclinado de agar nutriente. Incubar a 35 ± 0,5ºC por 24 ± horas, prosseguindo a incubação atë 48 ± 3 horas caso não tenha ocorrido formação de gás após a primeira incubação. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
  39. 39. 36 B. TÉCNICA DE FILTRAÇÃO EM MEMBRANA A técnica de filtração na membrana para análise da água passou a ser recomendada pelo "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater", ao lado da ténica de NMP, após a 13ª edição . A recomendação afirma que a técnica popde ser adotada para determinar a potabilidade de qualquer água, desde que, após uma série de exames paralelos, obtenha-se com as duas técnicas, resultados compatíveis. Entretanto, deve ser observado, quanto a técnica de filtração em membrana: Vantagens: - Os resultados são obtidos após 22-24 horas. - Podem ser analizados volumes maiores e mais representativos das amostras. - Os resultados em membrana têm maior grau de precisão, em relação à técnica dos tubos mútiplos, proporcionado também maior reprodutibilidade. - Um maior número de amostras pode ser processado com um mínimo de espaço e equipamentos. Limitações: - As amostras com alta densidade de bactérias não coliformes, porém capazes de se desenvolverer sobre o meio de cultura, pois os coliformes poderão ser impedidos de se desenvolverem ou senão a densidade de coliformes poderão ser impedidos de se desenvolverem ou senão a densidade de coliformes pode ser menor do que a obtida pela técnica do NMP. - äguas com alta turbidez devido as alfgas ou substâncias em suspensão, pois estas podem formar uma película na superfície da membrana e interferir no desenvolvimento de colônias característica de coliformes. Técnica Um volume de 100 ml de amostra é filtrada a vácuo através de uma membrana de 0,45 µ de diâmetro de poro. As bactérias ficam retidas na membrana e esta é transferida para placas apropriadas contendo almofadas de papel absorventes embebidas nos meios adequados. Meio para coliformes totais: Endo (caldo ou agar) Incubação 35 ± 0,5 ºC por 22-24 horas. Colônisa Típicas: cor rosa ou vermelha escura com brilho metálico característico. Meio para coliformes fecais: M-FC-Broth Incubação: 44,5 ± 0,2º por 24 horas. Colônias Típicas: or azul. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
  40. 40. 37 ASSUNTO 9: - Provas Bioquímicas para a Identificação de Bacilos Gram-negativos OBJETIVO Identificar enterobactéria em gêneros ou espécies, utilizando-se para isso vários meios de cultura especiais, de acordo co o esquema a seguir: 1. Plaqueamento Seletivo Etapa de isolamento bacteriano a partir de espécies clínico, utilizando meios seletivo-indicadores como o Agar EMB. Neste meio as bactérias Gram positivas são inibidas pela presença de eosina e azul de metileno. As bactérias Gram negativas fermentadoras de lactose ( LAC + ) apresentam-se como colônias rosa-avermelhadas com ou sem centro negro, enquanto as não-fermentadoras ( LAC - ) formam colônias transparentes. Plaqueamento Seletivo - Agar EMB6 . 2. Triagem Conjunto de provas bioquímicas realizadas simultaneamente em 1 ou 2 meios, permitindo uma diferenciação inicial dos isolamentos e direcionamento da contaminação bioquímica. Quando realizada em meio TSI, podemos observar: - Fermentação de glicose e produção de gás - Fermentação de lactose e/ou sacarose - Produção de H2S Bactérias que utilizam apenas glicose provocam acidificação (de coloração amarela) apenas na base, permanecendo o ápice alcalino (de cor avermelhada). Bactérias fermentadoras de lactose e/ou sacarose acidificam todo o meio. A formação de gás é evidenciada pelo rompimento ou descolamento do meio. A produção de H2S se manifesta pelo escurecimento do meio.
  41. 41. 38 Triagem – Meio TSI7 3. Confirmação Bioquímica Conjunto de provas necessárias para a identificação bioquímica das colônias suspeitas. Algumas dessas provas estão descritas abaixo: a. Fermentação de Carboidratos: glicose, lactose, manitol, sacarose. A utilização dos carboidratos leva à formação de ácidos, com viragem do indicador (vermelho de fenol) para cor amarela. A partir da glicose podemos observar também a produção ou não de gás (CO2, H2) no interior do tubo de Durham. A inoculação é realizada a partir de cultura bacteriana overnight (+/- 18h) em Agar. Incubar por 24 horas a 37ºC. Leitura: cor amarelada = + (positivo) sem alteração = - (negativo) Fermentação de Carboidratos7 b. VM: Verifica a ocorrência de fermentação ácido-mista ( glicose→ ácidos estáveis). Meio: Clark & Lubs. Inoculação: idem ao item a. Após incubação ( 48 h ), adicionar 3 – 5 gotas do reativo de VM ( vermelho de metila → alcalino = amarelo pálido / ácido = vermelho). Leitura: Cor vermelha = + Cor amarela = - c. VP ( Voges & Proskauer ): verifica a ocorrência de fermentação acetoínica (glicose→acetoína).
  42. 42. 39 Meio: Clark & Lubs (meio glicosado e tamponado). Inoculação: idem ao item a. Após inoculação (48 h), adicionar os reativos: VP I (Barrit I): alfa-naftol (0,6 mL) VP II ( Barrit II): KOH 40% (0,2 mL) Leitura (após 10 – 15 minutos): *observar o aparecimento de anel vermelhos na superfície do tubo (resultado positivo) *sem alteração: resultado negativo d. Citrato: verifica a utilização do citrato como única fonte de carbono. Meio: Citrato de Simmon. Inoculação: idem ao item a. Leitura: meio azulado = + meio sem crescimento = - Utilização do citrato como fonte de energia – Meio Citrato de Simmon e. Indol: verifica a produção de triptofane, que quebra triptofano, liberando indol, este é revelado com o reativo de Kovacs, observa-se a formação de um anel escarlate na superfície do meio. Meio: Caldo semi-sólido (SIM). Inoculação: idem ao item a. após a inoculação, adicionar 5 gotas do Reativo de Kovacs. Leitura: cor rosa = + sem alteração = - Figura: Caldo SIM, verificação da liberação de Indol. f. Mobilidade: verifica se a bactéria é móvel ou imóvel.
  43. 43. 40 meio: Agar semi-sólido (SIM). Inoculação: utilizar agulha bacteriológica, fazendo uma picada central até ¾ da profundidade do tubo. Leitura: crescimento fora do local da picada = + (móvel) crescimento somente ao redor da picada = - (imóvel) g. Nitrato: verifica a capacidade de redução do nitrato ( NO3) à nitrito (NO2). Inoculação: idem ao item a. Após incubação, adicionar 3 a 5 gotas dos reativos: Nitrato A: alfa naftilamina Nitrato B: ácido sulfanílico Leitura: cor vermelha (violácea, escarlate) = + (liberação de NH3) sem alteração = - h. Uréia: meio contendo uréia para verificar a produção da enzima uréase. Inoculação : idem ao item a. Leitura: cor vermelha (violácea, escarlate) = + (liberação de NH3) sem alteração = - RESULTADO ESPERADOS NOS TESTES BIOQUÍMICOS CARACTERÍSTICA E. coli Salmonella Klebsiella Proteus EMB Lac + Lac - Lac + Lac – TSI ác/ác alc/ác ac/ac álc/ác ou ac/ac H2S - + - + Glicose + + + + Gás + + + + Lactose + - + - Sacarose V - + V Manitol + + + V VM + + + + VP - - - - Citrato - V + (5 dias) - Indol + - - V Mobilidade V + - + Nitrato + + + + Uréia - - V + Tabela 1 – Identificação bioquímica de alguns gêneros de enterobactérias. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
  44. 44. 41 ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
  45. 45. 42 ASSUNTO 10: - Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos (TSA) Método de Kirby-Bauer OBJETIVOS: 1. Determinar a sensibilidade de uma bactéria frente a antimicrobianos, para a escolha da droga mais adequada no tratamento de uma doença. 2. Interpretar um antibiograma. MATERIAL: - cultura recente do microorganismo em teste - discos com antimicrobianos - placas com Agar Mueller-Hinton - swabs estéreis - pinças, régua graduada PRÁTICA PARA EXECUTAR: 1. Inóculo: Cultura pura, em fase log, padronizado, diluída até obtenção de turvação semelhante ao tubo nº 0,5 da escala de McFarlnd (1,0x108 ) 2. Meio Mueller-Hinton, recente, em camada de 4 – 5 mm, pH = 7,2 – 7,4, com umidade adequada. Em alguns casos pode ser enriquecido com 5% de sangue, etc. 3. Semeadura Inocular a cultura a ser testada na superfície do agar, com o auxílio de um swab, para um crescimento confluente (1). 4. Antimicrobianos Com o auxílio de uma pinça flambada, aplicar os discos com antimicrobianos sobre o meio recém-semeado de modo eqüidistante (3). Identificar a placa e incubar a 37°C por 18 – 24 horas em posição invertida. Ocorrerá difusão das substâncias e suas concentrações diminuem gradativamente a medida que se afastam do disco. A eficiência de uma droga é demonstrada pelo aparecimento de um halo de inibição do crescimento do microorganismo. 5. Leitura Com o auxílio de uma régua graduada, medir o diâmetro dos halos de inibição, incluindo o diâmetro do disco (4).
  46. 46. 43 Figura: Teste de sensibilidade a antimicrobianos2 . 6. Interpretação Interpretar a sensibilidade aos antimicrobianos de acordo com o diâmetro do halo de inibição encontrado em tabelas padronizadas que contém os valores em mm, para as drogas disponíveis comercialmente. 7. Controle Usar como controles os seguintes microorganismos, de acordo com as drogas utilizadas: - Staphylococcus aureus ATCC 25923 - Escherichia coli ATCC 25922 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Diâmetro do halo de inibiçãoAntimicrobiano Potência R I S Ampicilina (AM) 0,01 mg ≤ 11 12 – 13 ≥ 14 Ácido Nalidíxico (NA) 0,03 mg ≤ 13 14 – 18 ≥ 19 Cloranfenicol (C) 0,03 mg ≤ 12 13 – 17 ≥ 18 Sulfa-Trimetropim (STX) 0,03 mg ≤ 10 11 – 15 ≥ 16 Cefoxitina (CT) ≤ 14 15 – 17 ≥ 18 Eritromicina (ERI) ≤ 13 14 – 22 ≥ 23 Estreptomicina ≤ 11 12 – 14 ≥ 15
  47. 47. 44 Cefalotina ≤ 14 15 – 17 ≥ 18 Polimixina ≤ 8 09 – 11 ≥ 12 Sulfazotrim ≤ 10 11 – 15 ≥ 16 Notas: 1. leituras de 4 e 6 horas poderão ser feitas em caso de emergência, mas leituras definitivas deverão ser feitas somente após o tempo estipulado (18 – 24 horas) 2. Não usar sinais para expressar os resultados. Usar as letras “S” para os microorganismos sensíveis e “R” para os microorganismos resistentes. 3. Lembrar que um halo de inibição maior que outro não indica propriamente uma maior atividade do antibacteriano sobre o microorganismo em teste. Outros fatores, como carga antibiótica, difusibilidade, etc., intervêm na formação dos halos. Portanto, deve ser utilizada a tabela na interpretação dos resultados. 4. Atualmente, no intuito de minimizar erros de interpretação, considera-se a sensibilidade intermediária como resistente. ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________
  48. 48. 45 ANEXO I TÉCNICAS DE COLORAÇÃO A utilização de corantes em microbiologia é atribuída a Goeppert e Cohn (1849). Os corantes empregados, geralmente derivados da anilina, têm fórmula quimicamente complexa, e são obtidos por síntese; quase sempre são sais de potássio ou de sódio, sendo classificados em: naturais, entre os quais podemos citar o carmim e a hematoxilina, e artificiais, que se dividem em: básicos ou nucleares, ácidos ou citoplasmáticos e neutros. As células bacterianas são ricas em ácido nucléico, conduzindo cargas negativas sob a forma de grupamentos fosfato, e estes se combinam com os corantes básicos, que são carregados positivamente. Os corantes ácidos não coram as células bacterianas, e por isso podem ser utilizados para corar o material de fundo com uma cor contrastante. As soluções corantes são classificadas quanto ao veículo nos seguintes grupos: soluções aquosas, soluções hidroalcoólicas e soluções hidroalcoólicas mordentes. Utilizam-se as soluções aquosas quando se quer preservar a vitalidade dos microorganismos. A adição de substâncias mordentes tem a vantagem de preservá-las da contaminação mais ou menos estável entre ambas, como exemplos de substâncias que funcionam como mordentes citamos o fenol, iodo, formol e tanino. As colorações podem ser simples, quando utilizamos um só corante, duplas e mistas. Assim podemos ter uma noção da morfologia dos germes utilizando uma coloração simples, e de outras informações com o emprego de técnicas especiais de coloração, como por exemplo para diferenciar flagelos, cápsulas, paredes celulares, membranas celulares, grânulos, núcleos e esporos. I. MÉTODO DE GRAM (DIFERENCIAL) Esse método de coloração é importante em taxonomia bacteriana. Desde sua descoberta (1884) foi intensamente estudado e muitas modificações propostas sem, contudo, modificar a idéia original. A reação de Gram depende do estado fisiológico da célula, enquanto que as culturas jovens respondem melhor a diferenciação tintorial, as culturas velhas tendem a perder a capacidade de retenção do corante, levando um Gram positivo a se apresentar como Gram variável. A explicação do mecanismo de coloração de Gram baseia-se em diferenças existentes na composição da parede celular das bactérias Gram positivas e Gram negativas. As bactérias Gram positivas contém, na parede celular, glicopeptídeos e ácido teicóico, enquanto que as bactérias Gram negativas possuem glicopeptídeos e lipopolissacarídeos, lipoproteínas e fosfolipídeos. A coloração de Gram inicia-se com a aplicação de cristal violeta, a seguir aplica-se lugol (solução de iodo), que sendo um mordente, fixa o cristal violeta a célula formando com ele um complexo denominado iodopararosanilina. Até esta etapa, todas as bactérias estão roxas.
  49. 49. 46 Ao lavarmos as células com a solução de álcool-acetona, álcool-éter ou ainda álcool puro, as bactérias G- são descoradas, enquanto que as G+ retêm o complexo iodopararosanilina, devido a sua parede celular funcionar como uma barreira a eluição do complexo corante pelo álcool. Aparentemente, o álcool dissolve os lipídeos da parede das bactérias G- aumentando a sua permeabilidade e facilitando a saída do complexo iodopararosanilina, enquanto que nas bactérias G+ o álcool age como desidratante, diminuindo a porosidade e a permeabilidade e, consequentemente, retendo o complexo. Essa explicação é apoiada na observação de que protoplastos obtidos no tratamento de bactérias G+ por lisozima não retêm o complexo corante. A menor espessura da parede celular das bactérias G- também pode facilitar; porém é importante a observância do tempo de uso do diferenciador neste método, pois um descoramento de tempo superior a 15 segundos acarreta o descoramento, inclusive, das bactérias G+ . Em geral, todos os cocos são G+ , com exceção do gênero Neisseria e todos os bastonetes são G- , exceto o gênero Bacillus (aeróbio, esporulado), Clostridium (anaeróbio), Corynebacterium, Listeria e Lactobacillus. O gênero Mycobacteriaceae, embora sendo considerado G+ por alguns autotes, cora-se irregularmente. Os vibriões são G- e as leveduras coram-se como as bactérias G+ . O método de Gram não se aplica as bactérias espiraladas. Este método é de grande importância na sistemática bacteriana, pois através dele podemos classificar as bactérias em dois grupos: bactérias Gram positivas (roxas) e bactérias Gram negativas (rosas). OBJETIVOS 1. Avaliação da importância taxonômica do método de Gram; 2. Interpretação da ação e função dos reagentes. Técnica: A. Preparação do esfregaço: · Lâmina nova ou estocada em álcool. · Flambar no bico de Bunsen. · Deixar esfriar. Ø Cultivo em meio líquido · Transferir assepticamente com alça os microorganismos, colocando o inoculo no centro da lâmina e espalhar (aproximadamente 1,0 a 1,5 cm); · Secar ao ar livre até evaporação total (ou na chama sem aquecer em demasia); · Fixar a preparação passando a lâmina na chama do bico de Bunsen 3 vezes (repetir esta etapa quantas vezes forem necessárias, sem aquecer a lâmina em demasia); · Deixar a lâmina esfriar antes de iniciar a técnica de coloração.

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