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  1. 1. O ANTIBIOGRAMA NO LABORATÓRIO<br />Marilene Rodrigues Chang<br />&<br />Ana Cláudia Souza Rodrigues<br />
  2. 2. Métodos de Teste de Sensibilidade aosAntimicrobianos (TSA)<br />Dra. Marilene Rodrigues Chang<br />Departamento de Farmácia e Bioquímica da UFMS<br />Mestre em Análises Clínicas, área de Micologia, FCF/USP-SP<br />Doutora em Ciências, área de Bacteriologia, IOC/FIOCRUZ- RJ<br />
  3. 3. Resistência Bacteriana a Antimicrobianos<br />
  4. 4. Atividade Antimicrobiana: Primeira Observação<br />Alexander Fleming 1920<br />
  5. 5. Ensaios Biológicos<br />Reprodução da descoberta de Fleming<br />Reprodução da placa de Fleming para a prova de sensibilidade aos antibióticos<br /> Susceptibilidade Antimicrobiana<br />
  6. 6. Quando e porquê realizar o antibiograma?<br /><ul><li>Isolado requer terapia antimicrobiana
  7. 7. Isolado cuja susceptibilidade não é preditiva
  8. 8. Isolado capaz de exibir resistência
  9. 9. Orientação terapêutica
  10. 10. Permite individualizar padrões de resistência</li></li></ul><li>Importância e indicações do teste de sensibilidade<br />Avalia o padrão da resposta da bactéria diante de concentrações pré-estabelecidas de antibióticos correlacionadas com níveis séricos<br />O antibiograma reflete a bactéria e a droga, sem considerar aspectos clínicos <br />Deve ser realizado para microrganismos cujas técnica é referendada em consensos<br />Indicado para bactéria cujo padrão de resistência não é previsível Ex. Desnecessária para bactéria cuja sensibilidade é conhecida como a do S. pyogenes frente à penicilina<br />Não indicada para bactérias no seu sítio anatômico usual. Ex. E. coli de fezes e S. viridans do TRS.<br />A liberação de um resultado pode encorajar o clínico ao tratamento de uma condição normal e encobrir seu verdadeiro problema<br />
  11. 11. TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS<br />METODOLOGIAS<br />Avaliação QUALITATIVA<br /><ul><li>DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR (Kirby e Bauer, 1966)</li></ul>Avaliação QUANTITATIVA<br /><ul><li> DILUIÇÃO EM CALDO</li></ul>Macrodiluição<br />Microdiluição <br /><ul><li>DILUIÇÃO EM ÁGAR
  12. 12. ETEST
  13. 13. AUTOMATIZADOS</li></li></ul><li>CLINICAL and LABORATORY STANDARDS INSTITUTE<br />CLSI - antigo“NCCLS”<br />Organização internacional, interdisciplinar e educacional que promove o desenvolvimento de normas e procedimentos laboratoriais padronizados.<br />Composta de representantes da área da saúde, incluindo médicos, microbiologistas, educadores, farmacêuticos, representantes do governo e indústria, etc.<br />
  14. 14. TESTE DE SENSISIBILIDADE AOSANTIBIÓTICOS<br />Padronização<br /><ul><li>Controle de qualidade dos itens:</li></ul>meios<br />pH<br /> temperatura<br /> incubação<br /> discos (Cepas ATCC)<br />
  15. 15. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos<br />Bactéria e Preparo do Inóculo<br /><ul><li> Suspensão direta
  16. 16. Método de crescimento</li></ul>0,5 McFarland 1a 2x108 UFC/mL<br />
  17. 17. Teste de sensibilidade aos antimicrobianos<br />Procedimento<br />Bactéria e Inóculo<br />
  18. 18. TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS<br />Inóculo - Método do crescimento<br /><ul><li>“3 a 5” colônias 4 a 5 mL de Salina
  19. 19. Incubar 33 a 35oC - (2 a 6h)*
  20. 20. Ajustar a turbidez</li></ul> 0,5 McFarland<br />1 a 2x108 UFC/mL<br />
  21. 21. TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS<br />Inóculo - Suspensão direta<br /><ul><li> 3 a 5 colônias 4 a 5 mL de salina
  22. 22. Ajustar a turbidez</li></ul> 0,5 McFarland<br />1 a 2 x 108 UFC/mL<br /><ul><li> Estabilizar 15 min.</li></li></ul><li>TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS<br />Inóculo<br />
  23. 23. Confirme a Diferença!<br />
  24. 24. TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR<br /> Fácil execução<br /> Flexibilidade na escolha dos antibióticos <br />Padronização dos resultados<br /> Baixo custo<br />
  25. 25. TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR<br />Meios<br />Ágar Mueller-Hinton<br />Ágar Mueller-Hinton <br />suplementado<br />Reprodutibilidade do teste.<br /><ul><li> Baixo teor de inibidores de sulfonamidas, trimetoprim e tetraciclinas.
  26. 26. Permite crescimento satisfatório da maioria dos patógenos</li></li></ul><li>TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR<br />O que devemos saber sobre os meios?<br /><ul><li> Umidade
  27. 27. Efeito da Timidina ou Timina</li></ul>Inibidores das sulfonamidas e trimetoprim.<br /><ul><li> Teste de esterilidade
  28. 28. Efeitos da variação de Magnésio e Cálcio </li></li></ul><li>TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR<br />Discos <br /><ul><li>Conservação 8oC ou </li></ul> freezer(não “frost free”)<br />Imipenem, Ertapenem, Cefaclor e combinações de ác.clavulânico<br /><ul><li>Retirar do refrigerador ou do freezer até 2 horas antes do uso
  29. 29. Evitar umidade
  30. 30. Data de validade</li></li></ul><li>TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR<br />Inoculação<br /><ul><li>Superfície do ágar não deve estar úmida
  31. 31. Inoculação homogênea
  32. 32. Esperar diminuir a umidade antes da aplicação dos discos </li></li></ul><li>Cuidado na distribuição do inóculo<br />Inadequado<br />Adequado<br />
  33. 33. TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR<br />Aplicação dos discos<br /><ul><li> Bateria pré determinada
  34. 34. Aplicar e pressionar o disco
  35. 35. Aplicar no máximo</li></ul> 12 discos na placa de 150mm<br /> 5 discos na placa de 90mm<br /><ul><li> Inverter a placa e incubar 15 minutos após a aplicação </li></li></ul><li>TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR<br />Incubação<br /><ul><li> Temperatura 33 a 35oC
  36. 36. Atmosfera atm ambiente</li></ul>exceção Haemoplilus spp., N. gonorrhoeae<br /> e estreptococos:  CO2<br />Obs.<br /><ul><li>P/ S. maltophilia, B. cepacea, Streptococcus spp, Leitura de OXA e VAN para Staphylococcus – 20 a 24h de incubação</li></li></ul><li>TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR<br />Princípio do método<br />
  37. 37. TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGAR<br />Leitura e Interpretação<br />mm<br />
  38. 38. TESTE de MACRODILUIÇÃO<br />g/mL<br /> 100 50 25 12.5 6.25 3.12 .16 .8 .4 controle <br />Método quantitativo MIC<br /><ul><li>Conceito
  39. 39. Precisão
  40. 40. Vantagens
  41. 41. Desvantagens</li></ul>É a menor concentração da droga que inibe completamente o crescimento bacteriano.<br />
  42. 42. MIC<br />g/mL<br />100 50 25 12.5 6.25 3.12 .16 . 8 .4 controle <br />• • •<br />• • •<br />• • • •<br />• • • • •<br />• • • •<br />MBC<br />Concentração Bactericida Mínima<br />MACRODILUIÇÃO<br />
  43. 43. MICRODILUIÇÃO<br />Conc. decrescente do antimicrobiano<br />Antimicrobianos testados<br />
  44. 44. DILUIÇÃO EM ÁGAR<br />VANTAGENS:<br />Utilizado em estudos epidemiológicos<br /> Fácil execução<br /> Permite testar vários isolados simultaneamente<br /> Promove resultados quantitativos<br /> Permite o teste de bactérias fastidiosas<br /> Baixo custo (relativo)<br /> Preparo das placas e estocagem<br />DESVANTAGENS<br /><ul><li>Muito trabalhoso, tanto a preparação das placas quanto a preparação do inóculo, especialmente quando vários antimicrobianos devem ser testados
  45. 45. As placas de ágar não podem ser armazenadas por muito tempo</li></li></ul><li>Etest<br />Princípio do método<br />
  46. 46. Interpretação do Etest<br />
  47. 47. Interpretação do Etest<br />
  48. 48. MÉTODOS AUTOMATIZADOS<br />Painel<br />Sistema WalkAway(Dade Behring™) <br /><ul><li> Incuba automaticamente a</li></ul>suspensão bacteriana, <br /><ul><li> Adiciona reagentes e executa a </li></ul>leitura dos painéis.<br /><ul><li> Determina CIM</li></ul>Dupla metodologia:<br />Colorimétrica e <br />Fluorogênica.<br />Tem capacidade de processar,<br />simultaneamente,<br />40 painéis (WalkAway® 40) ou<br />96 painéis (WalkAway® 96).<br />
  49. 49. Sistema Automatizado<br />Limitações<br /><ul><li>Custo elevado
  50. 50. Antibiograma não padronizado para todas as bactérias
  51. 51. Mudança de MIC, software novo demora chegar
  52. 52. Falsa sensibilidade
  53. 53. Falsa resistência</li></li></ul><li>Interpretação do Resultado<br />Susceptível (S)<br />A categoria susceptível implica que a infecção causada pela cepa bacteriana isolada pode ser adequadamente tratada com a dosagem do antimicrobiano recomendada para o tipo de infecção e o agente infeccioso. <br />Desde que não haja contra indicação.<br />
  54. 54. Interpretação do Resultado<br />Intermediária (I)<br />A categoria intermediária inclui isolados cujos MICs são próximos aos do sangue e tecidos. Ela permite a aplicabilidade do antimicrobiano em infecções em sítios onde as drogas são fisiologicamente concentradas ou quando doses maiores podem ser utilizadas. <br />
  55. 55. Interpretação do Resultado<br />Resistente (R)<br />A categoria resistente inclui isolados que não são inibidos pelas concentrações usuais do antimicrobiano na dosagem padrão e/ou falha quando um específico mecanismo de resistência é expressado. <br />
  56. 56. CONSIDERAÇÕES FINAIS<br /><ul><li>A avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos representa uma das tarefas mais importantes do laboratório de microbiologia.
  57. 57. O constante aparecimento de novos mecanismos bacterianos de resistência e novos antimicrobianos tornam os testes cada vez mais complexos
  58. 58. É necessário uma atualização constante dos protocolos e a freqüente implementação de novos testes e metodologias.
  59. 59. Microbiologistas, patologistas clínicos e médicos assistentes são obrigados a estarem em constante atualização</li></li></ul><li>Referências<br />1. The MASTER website (self-training) for AST:http://www.phppo.cdc.gov/dls/master/default.aspx<br />2. Fact sheets from CDC on laboratory issues, including AST:http://www.cdc.gov/ncidod/hip/Lab/LAB.HTM<br />3. www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/clsi.asp<br />4. Koneman et al. Diagnóstico microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 6a. Ed., 2008.<br />

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