2012.apostila microb experimental

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2012.apostila microb experimental

  1. 1. UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA DEPARTAMENTO DE QUIMICA MICROBIOLOGIA EXPERIMENTAL PROFESSORAS: Dra. ELIANE ROLIM FLORENTINO Dra. ISANNA MENEZES FLORÊNCIO CAMPINA GRANDE 2012
  2. 2. 2 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 1 Técnicas Básicas em Microbiologia e Segurança Laboratorial A finalidade das aulas práticas de microbiologia é demonstrar ao estudante as metodologias e princípios usados em laboratório de microbiologia, reforçando conceitos teóricos estudados. Nas aulas serão utilizados vários microrganismos, os quais são bastante vulneráveis e alguns patogênicos. Desta forma, é essencial observar normas de segurança no laboratório, para evitar principalmente contaminação dos estudantes, técnicos e professores e impedir a contaminação dos dispositivos experimentais por microrganismos estranhos ao estudo. I.1 Regras Gerais de Conduta e Segurança Laboratorial  O laboratório é um lugar que pode ter o seu potencial de risco de acidentes diminuído desde que certas regras de conduta e segurança sejam obedecidas.  É fundamental se ter critério, planejamento, conhecimento e calma no trabalho.  O uso de bata de algodão branco, comprido e abotoado, é essencial no laboratório de Microbiologia, pois o mesmo protege a roupa de contaminação. O aluno deve usar calças compridas e sapato fechado para evitar acidentes, e aqueles de cabelos compridos devem mantê-los presos.  Deixar os materiais como bolsas, pastas, livros e cadernos em local reservado e nunca sobre as bancadas de trabalho.  Não comer, não beber, nem fumar no laboratório.  Manter as mãos, canetas, lápis e quaisquer objetos sem contato com a boca, olhos ou ouvidos.  Lavar as mãos com detergente e secá-las com papel toalha antes e depois da aula prática.  Nunca tentar identificar substâncias pela textura, sabor ou odor.  Os extintores de incêndios e a caixa de primeiro socorros devem ser colocados em locais visíveis e de fácil acesso.  Manter as bancadas limpas e organizadas.  Ler com atenção o rótulo do produto a ser usado.
  3. 3. 3 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com  Rotular todas as amostras, reagentes, soluções, meios de cultura, etc.  Trabalhar apenas com instrumentos adequados, tomando cuidado especial com os vidros, que não dever conter pontas ou arestas cortantes.  Proteger o rótulo dos frascos ao verter o seu conteúdo.  Não debruçar sobre as bancadas.  Observar as propriedades dos reagentes, soluções e meios de cultura para um adequado acondicionamento e estocagem.  Não permitir a entrada de pessoas estranhas no laboratório.  Manter atenção constante nas ações executadas, evitando movimentação e conversas desnecessárias que possam causar distrações e provocar acidentes.  O aluno deve deixar o laboratório apenas após ter terminado o trabalho prático do dia, sem dúvidas nas técnicas realizadas. 1.2 Normas de Trabalho em Microbiologia  No inicio de cada analise traçar um plano de trabalho considerando o tempo necessário para cada analise e sua leitura.  Trabalhar sempre de maneira ordenada, tranqüila, constante e metódica, evitando movimentos desnecessários como troca de lugar, assento, etc.  Limpar e sanitizar a superfície de mesas e balcões antes e depois do trabalho de cada dia.  Efetuar registros de analises, anotando o tipo do produto, procedência, dia e hora da entrada no laboratório e qualquer outra observação previa á análise. Na análise propriamente dita anotar: método, meio de cultura empregado e resultados obtidos.  Identificar as amostras antes de iniciar a analise e em geral, não descartar até obter os resultados.  O material a ser analisado deve ser tocado exclusivamente com instrumentos estéreis e nunca com as mãos.  Não cheirar os meios de cultura inoculados  Evitar salpicar mesas e pisos com água ou soluções corantes.  Usar bico de Bunsen, entre o material e o analista.
  4. 4. 4 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com  Cuidado ao acender o bico de Bunsen. Observar se não existem produtos inflamáveis (álcool, éter, acetona etc.) nas proximidades da chama  No caso de derramamento do material inoculado, comunicar imediatamente ao professor ou ao pessoal técnico do laboratório, sanitizar e esterilizar imediatamente (cobrir a área com sanitizante adequado e deixar de 15 a 30 minutos antes de limpar).  Vidrarias e materiais devem ser colocados após o uso em recipientes adequados com soluções de desinfetante.  As pipetas devem colocar algodão na extremidade de sucção para evitar contaminação do material e do analista.  Os tubos de ensaios com cultura deverão ser colocados nas estantes ou suportes adequados, nunca nos bolsos do avental ou deitado sobre as bancadas.  Todo material contaminado (pipetas, bastões, lâminas, lamínulas etc.), deverá ser colocado em recipientes adequados (provetas, cubas, ou vidros com desinfetantes), para serem esterilizados posteriormente; nunca deixá-los sobre a mesa de trabalho ou pia.  O material utilizado deve receber a seguinte seqüência de tratamento: a) Esterilização – em autoclave a 121ºC durante 30 minutos b) Lavagem em água corrente e detergente c) Secagem em estufa d) Esterilização - em autoclave a 121ºC durante 15 minutos e) Armazenamento  Os cultivos após a leitura devem ser esterilizados.  As laminas e lamínulas usadas devem ser colocadas em recipientes com desinfetantes  Não retirar qualquer cultivo do laboratório.  Manter registro do controle diário de temperaturas das estufas.  Realizar o controle de temperatura ambiental em câmaras assépticas e fluxo laminar.
  5. 5. 5 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com  Analisar conservas e produtos esterilizados somente em câmaras assépticas ou fluxo laminar.  Ao final do experimento, deve-se limpar a bancada, desligar os aparelhos, fechar o bico de Busen e lavar as mãos antes de sair do laboratório 2 Limpeza de Vidraria O bom desempenho da prática laboratorial depende da máxima limpeza da aparelhagem usada. Para a limpeza da vidraria o ácido nítrico ou ácido clorídrico são meios eficientes. Os agentes de limpeza alcalinos tais como fosfatos tri-sódico e os detergentes sintéticos são muito úteis, mas requerem uma enxaguagem prolongada para eliminação completa de resíduos. A adição de algumas gotas de azul de bromotimol a 0,04g/L é uma maneira de se testar a presença de resíduos alcalinos ou ácidos. Este indicador oferece a vantagem de cor do amarelo ao azul esverdeado na faixa de pH 6,5 a 7,3. 2.1 Técnicas de Lavagem
  6. 6. 6 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com A lavagem deve ser realizada cuidadosamente para que não fiquem resíduos ácidos ou alcalinos no material. Toda a vidraria deve ser guardada limpa e seca. Materiais usados para análises microbiológicas devem ser esterilizados antes e após o seu uso. 2.1.1 Limpeza de Material em Uso  Esterilização em autoclave – 121ºC durante 30 minutos.  Retirar todo material lavar com água da torneira.  Deixar o material submerso em água mais detergente.  Escovar o interior de cada utensílio com solução detergente utilizando escova própria.  Enxaguar com água de torneira.  Verificar, após essa operação, se a água esta escorrendo livremente, sem que haja retenção.  Enxaguar com água destilada.  Secar em estufa – 160/170ºC durante 1 a 2 horas. 2.2 Preparo de Material Usado em Análises Microbiológicas  Preparo de Rolhas de Algodão As rolhas de algodão são empregadas no vedamento de tubos e frascos em microbiologia. O algodão utilizado é geralmente hidrófobo (não absorvente). Para se preparar uma rolha, corta-se um quadrado pequeno de algodão (cujo tamanho se determina pela prática), dobra-se no lado oposto para fazer um retângulo – mais ou menos 3,7 cm de largura e enrola-se formando um cilindro justo. A rolha deve entrar ajustadamente, devendo estar 1/3 fora da boca do tubo. A fim de se proteger a rolha de algodão permitindo sua múltipla utilização, é aconselhável envolver a extremidade da mesma com um pedaço de gaze. Uma rolha deve ser bem feita para poder ser empregada varias vezes.
  7. 7. 7 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com  Alças de Platina ou de Níquel-Cromo Empregada para transferência de um cultivo para um meio de cultura fresco. A alça é empregada para fazer streak (isolamento de culturas) e também para inoculação por meio de repique em tubos de ensaio contendo meio de cultura sólido. Quando utilizar alça de platina nas práticas, a mesma dever ser aquecida até o rubro, tanto antes do uso como depois dele. Antes de tocar o material de cultura, deve-se deixar a alça esfriar, mantendo-a próxima de chama. Alça de Platina  Pipetas A pipeta é empregada na microbiologia, para transferência de culturas liquidas e diluições sucessivas das amostras. O material deve ser aspirado lentamente, mantendo-se a pipeta com o dedo, médio e o polegar, com o indicador controlando a vazão do liquido. É importante manter o dedo indicador seco. Na transferência de culturas (principalmente em caso de tubos) deve-se evitar escorrer o liquido nas paredes internas do mesmo. No trabalho com placas, normalmente a ultima gota do liquido permanece na ponta da pipeta, devendo toca-la na região seca da placa. É comum colocar-se algodão na extremidade superior da pipeta, evitando à contaminação por bactérias das vias aéreas superiores e também a finalidade de impedir que o analista se contamine acidentalmente quando trabalhar com microrganismos patogênicos. Para a esterilização, as pipetas devem estar adequadamente limpas e secas. Deverão ser embaladas individualmente empregando-se o papel “Kraft” ou em conjunto utilizando pipetadores de inox e, em seguida, procede-se a esterilização.  Placas de Petri
  8. 8. 8 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com As placas de Petri são usadas para cultivar com meios de cultura sólidos. Essa vidraria deve estar lavada, seca e posteriormente embalada e esterilizada. As placas podem ser embrulhadas com papel “Kraft” individualmente ou em conjunto, de acordo com a rotina de trabalho. As placas de Petri com meios de cultura, com ou sem crescimento de microrganismos, só poderão ser abertos nas proximidades da chama, para evitar contaminação. No preparo da placa para contagem do tipo “pour plate” deve-se abrir à placa somente o necessário para permitir a introdução das pipetas. Placas de Petri 3 Esterilização Esterilizar um material é inativar todos os microrganismos nele existentes. Ao ato de esterilizar, dá-se o nome de ESTERILIZAÇÃO, ou seja, é o processo capaz de destruir ou eliminar todas as formas vivas de um material ou ambiente. Através da esterilização dos meios de cultura e dos instrumentos utilizados nos trabalhos de laboratório, é possível o isolamento e a manutenção de culturas puras. A esterilização pode ser feitas através de diferentes processos, empregando-se agentes físicos (calor, atrito, radiação, filtração) e agentes químicos. A esterilização pelo calor é de larga aplicação em microbiologia. Todo material para isolamento e cultivo de microrganismos no laboratório é, obrigatoriamente, esterilizado. 3.1 Métodos de Esterilização
  9. 9. 9 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 3.1.1 Calor seco Nos ambientes secos, eliminação dos microrganismos ocorre pela oxidação ou queima das proteínas presentes no material celular. Isso requer uso de temperaturas elevadas durante determinados períodos (160ºC ou 170ºC durante 1 a 2 horas). A utilização do calor seco como processo de esterilização demanda, geralmente, a utilização de estufas ou fornos apropriados (forno de Pasteur), ou a utilização direta da chama. O calor seco ( como forno ou estufa) penetra nas substâncias mais lentamente que o calor úmido (vapor) é geralmente usado para esterilizar objetos de metal e vidros. 3.1.1.1 Flambagem em chama direta A flambagem é realizada em chama direta com bico de Bunsen ou lamparina. Consiste em se passar a alça ou agulha de platina sobre a chama até o rubro, com a finalidade de esterilizá-las, ou então as bocas dos tubos de ensaio, ou outros frascos, para evitar possíveis contaminações pelo ar na transferência ou inoculação das células. As alças ou agulhas de platina devem ser mantidas em posição vertical ou ligeiramente inclinadas, de maneira que toda extensão da alça ou agulha fique demasiadamente rubra. É importante observar que deve-se introduzir a alça na parte mais quente da chama. Em relação aos frascos e tubos, deve-se evitar aquecê-los demasiadamente para evitar a quebra. Pipetas não devem ser flambadas, pois com o aquecimento pede ocorrer um dilatamento ocasionando diferenças no volume a ser medido. 3.1.1.2 Ar quente Empregado para a esterilização de placas de Petri, pipetas, tubos de diluição, tubos de ensaios e outras vidrarias. As vidrarias devem ser embaladas em papel apropriado que adquire cor parda, não devendo escurecer muito, nem se tornar quebradiço. 170 a 180ºc por 1 a 2 horas
  10. 10. 10 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com Deve-se deixar o forno ou estufas de esterilização esfriar por si, pois a abertura do forno ainda quente provoca variação brusca de temperatura, podendo-se levar à quebra do material. 3.1.2 Calor úmido Esse método de esterilização provoca a inativação ou coagulação de proteínas dos microrganismos. Embora a maioria dos microrganismos morra as temperaturas inferiores a 100º C, existem bactérias que produzem endósporos resistentes a essa temperatura. A utilização o calor úmido não é indicada para a esterilização de materiais que podem ser afetados pela umidade ou pelas altas temperaturas, como alguns açúcares, proteínas e vitaminas. Geralmente, na esterilização pelo calor úmido utiliza-se o vapor d´água sob pressão ( autoclavagem) ou a tindalização. 3.1.2.1 Temperatura a 100ºC A água fervente: a imersão de água fervente é empregada para a esterilização de instrumentos cirúrgicos, seringas ou injeção. A fervura destrói quase que instantaneamente os germes patogênicos não esporulados, todavia, não se deve esquecer que há esporos resistentes à ação da água fervendo, durante 15 minutos ou mais. 3.1.2.2 Vapor fluente Pode ser feito em autoclave com o orifício de escapamento aberto. 3.1.2.3 Tindalização Consiste num processo de esterilização fracionada, é efetuado o aquecimento a 100ºC por em intervalos de 24 horas em três vezes consecutivas. Tyndall (1877) verificou que repetindo o aquecimento 2 ou 3 dias consecutivos, consegue-se destruir todas as bactérias. Dá-se o nome de tindalização ou esterilização fracionada a esse aquecimento, com intervalo adequado.
  11. 11. 11 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 1º aquecimento: destrói apenas as formas vegetativas, não destruindo os esporos. Resfriamento: germinação. 2º aquecimento: morte das formas vegetativas dos esporos poupados no primeiro aquecimento. Resfriamento: germinação 3º aquecimento: morte dos possíveis sobreviventes. Este processo é freqüentemente empregado para esterilização de meios de cultura que se alteram a temperatura elevada, como soro, meios contendo açúcar e outros. 3.12.2 Temperatura superior a 100ºC – Vapor sob pressão É o meio mais eficaz de esterilização, realizado em autoclave. A autoclave consiste, essencialmente, de uma caldeira cilíndrica de paredes resistentes fechada superiormente, por uma tampa, que veda perfeitamente, devido à interposição de uma borracha e parafusos que se apertam. No interior da caldeira existe um suporte sobre o qual se coloca uma cesta metálica contendo o material a ser esterilizado. Entre o fundo da cesta metálica e o funda da caldeira fica um espaço que se enche de água. A tampa da autoclave possui um orifício de escapamento, uma válvula de segurança e um manômetro que indica pressão e a temperatura correspondente. 3.2 Eficiência Comparativa entre Calor Seco e Calor Úmido O calor úmido é mais eficiente, pois tem um poder de penetração maior que o calor seco. Foi verificado que em um fardo de flanela exposto ao calor seco a 150ºC/4 horas, a temperatura atingida no centro sobe apenas a 83ºC, ao passo que a temperatura de 120ºC em autoclave durante meia hora, a temperatura central chega a 117ºC. A razão da maior eficiência do calor úmido reside no fato que assim como outra reação química, a termo-coagulação das proteínas é também catalizada pela água.
  12. 12. 12 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 4 Filtração Na filtração empregam-se filtros que são utilizados no laboratório e na indústria para esterilizar materiais que não podem ser esterilizados por autoclavação, como vitaminas, proteínas termossensíveis. Inicialmente os filtros eram de cerâmica porosa ou de vidro sintético. Muitos deles foram substituídos por membranas filtrantes, filtros de membrana de celulose extremamente finos (150μm), com poros pequenos o suficiente para impedir a passagem de microrganismo.
  13. 13. 13 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com AULA PRÁTICA Nº 1 PREPARAÇÃO E ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA 1 INTRODUÇÃO 1 Meios de culturas O estudo dos microrganismos, sua identificação e a avaliação de suas populações nos diferentes materiais e ambientes requerem seu cultivo nas condições de laboratório. Meios de cultura são substratos adequados ao crescimento, multiplicação e desenvolvimento de microrganismos fora de seu habitat natural. Os primeiros meios utilizados foram naturais e líquidos como o caldo de pimenta, a urina, o sangue e o leite. O cultivo dos microrganismos exige que determinadas condições sejam atendidas. As exigências nutritivas e ambientais são viáveis como o tipo de microrganismo, tornando impossível a produção de um único meio que satisfaça todas as condições de todos os tipos de microrganismos. Por outro lado, é difícil e impraticável a formulação de um meio de cultura ideal para cada tipo de microrganismo. No cultivo de bactérias heterotróficas, o meio mais utilizado é o caldo nutriente (CN) e a sua respectiva forma sólida, o ágar nutriente (AN). Para fungos, o meio comumente utilizado é o ágar dextrose ou Sabouraud. No preparo de um meio de cultura é necessário conhecer as exigências nutricionais dos microrganismos. São considerados componentes essenciais do meio de cultura: a) Fonte de energia: no caso de microrganismos quimiotróficos, esta exigência é satisfeita pela presença de compostos orgânicos ou inorgânicos específicos a ser oxidados, como por exemplo o enxofre ou o amônio. Para os fotossintetizantes, há a necessidade de luz, que deve ser fornecida pelo ambiente. b) Fonte de carbono: para microrganismos heterotróficos, há a necessidade da presença de compostos orgânicos, enquanto que para os autotróficos é necessário CO2, que pode ser suprido pelo ambiente. c) Fonte de nitrogênio: proteínas, aminoácidos, nitrato, amônio ou N2.
  14. 14. 14 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com d) Fatores de crescimento: Vitaminas. e) Fonte de minerais: P, K, S, Ca, Fe, Mg, Mn, Zn, Cu etc. f) Água Devido às dimensões dos microrganismos, além dos nutrientes, o meio de cultura deve suprir algumas condições ambientais: a) pH: cada organismo exige um pH adequado para seu crescimento. A maioria das bactérias, por exemplo, exige um pH em torno de 7. b) Atmosfera: presença de O2,CO2; condições para o crescimento de aeróbios, anaeróbios, facultativos ou microaerófilos. c) Pressão osmótica: regulada pelos constituintes do meio. Para organismos marinhos e halofílicos, há necessidade da adição de uma certa quantidade de sal, de modo a obter a concentração adequada para seu crescimento. Nem todas as condições ambientais podem ser controladas no meio de cultura. Temperatura, luz, pressão hidrostática e, na maioria das vezes, a atmosfera devem ser controladas no ambiente (incubadora ou estufa). Alguns nutrientes, como as substâncias termolábeis (vitaminas, açúcares, aminoácidos e antibióticos), exigem cuidados especiais. Eles devem ser esterilizados por filtração, sendo adicionado aos meios após a autoclavagem e resfriamento acima do ponto de solidificação do meio. II.Classificação dos meios de cultura 2.1 Quanto à origem: a) Naturais: aqueles que já existem prontos na natureza. Ex: leite, sangue, caldo de frutas, caldo de cana e outros. b) Artificiais: aqueles que são elaborados. Ex: ágar nutriente. 2.2 Quanto à composição:
  15. 15. 15 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com a) Complexos: são aqueles que não apresentam uma composição química definida, como os que contêm extrato de carne ou extrato de levedura, sangue, leite, ovos e outros. b) Sintéticos: meios que têm a composição química definida. 2.3 Quanto ao estado físico: a) Sólidos: são meios que já existem na natureza no estado sólido, ou que foram tornados sólidos pela adição de uma substância solidificante como o ágar ( 1,5%), a gelatina ou a sílica-gel. São utilizados para o isolamento e avaliação de populações (contagens), ou mesmo para o cultivo normal. Ex: fatias de batata e ágar nutriente. O ágar-ágar é o solidificante mais utilizado em microbiologia. Ele é um polissacarídeo extraído de algas marinhas do gênero Gelidium, constituído de unidades monométricas de galactose e ácido galacturônio. Foi introduzido na microbiologia por Robert Koch e até hoje vem sendo utilizado devido a suas seguintes características:  É inerte para a maioria dos microrganismos;  É transparente;  É neutro;  Possui ponto de fusão a 100 ºC  Possui ponto de solidificação de 40-45ºC, o que permite a sua mistura com microrganismos ou com substâncias que se alteram em temperaturas elevadas (Ex: proteínas). b) Semi – sólidos: meios que apresentam consistência intermediária, como por exemplo o meio semi-sólido ( 0,5% de ágar) utilizado para a verificação da mobilidade ou para a caracterização de microrganismos microaerófilios. c) Líquidos: são meios utilizados na forma de caldo. Eles permitem obter maior concentração celular em menor tempo. O crescimento de microrganismos unicelulares pode ser avaliado nesses meios pelas mudanças de turvação. Ex: Caldo nutriente.
  16. 16. 16 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 2.4 Quanto à finalidade a) Meios gerais ou básicos: são aqueles que permitem o crescimento de um grande número de espécie microbiana dentro de um grupo: ágar nutriente para bactérias, Sabouraud ou ágar dextrose para fungos. b) Meios enriquecidos: são meios de culturas adicionados de misturas complexas e naturais como leite, sangue, soro e extrato de tecidos animais ou vegetais, que permitem o crescimento de microrganismos nutricionalmente mais exigentes (fastidiosos). Ex: ágar sangue para isolamento e cultivo das bactérias dos gêneros Neisseria, Staphylococcus e Streptococcus. c) Meios seletivos: São aqueles que possuem uma composição ou uma ou mais condições que seleciona o tipo de microrganismo que vai crescer. São muito úteis no isolamento e na identificação. Ex: meio SS ágar para Salmonella e Shigella. d) Meios indicadores ou diferenciais: são aqueles que destacam (indicam) determinadas características metabólicas do microrganismo. São também muito úteis no isolamento e na identificação. Ex: meio Mac Conkey, para bactérias entéricas. e) Meios de enriquecimento: São aqueles que permitem o desenvolvimento diferenciado de microrganismos, favorecendo o crescimento de um grupo em detrimento de outros. f) Meios de dosagem: são empregados na dosagem de substâncias, tais como vitaminas, aminoácidos e desinfetantes. g) Meios de transporte, estocagem ou manutenção: mantêm a viabilidade dos microrganismos por mais tempo. Por exemplo, a presença de glicose no meio de cultura faz com que o microrganismo se multiplique mais rapidamente, exaurindo toda a fonte de energia. A mudança do tipo de açúcar permitirá um crescimento mais lento, e a cultura sobreviverá mais tempo.
  17. 17. 17 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com III.Meios desidratados A maior parte dos meios de cultura pode ser obtida na forma desidratada e neste caso alguns aspectos devem ser obtidos: 3.1 Armazenamento e conservação  Anotar em livro próprio a data da recepção dos meios de cultura e ingredientes empregados na formulação.  Armazena-lo de acordo com as especificações contidas no rotulo, em uma área de pouca umidade, afastada da luz direta do sol, das autoclaves, estufa de secagem e qualquer outra fonte de calor.  Quando especificado no rotulo, manter sob refrigeração.  Após o uso assegurar-se de que o frasco esta bem fechado e armazena-lo em local próprio.  Descartar o meio caso o pó não esteja fluindo facilmente ou se houver alterações na cor e/ou consistência. 3.2 Pesagem Ao preparar meios e cultura deve-se usar primeiro o estoque mais velho. Não se deve abrir um novo lote de meio ate que o anterior tenha esgotado. Usar uma balança cuja exatidão se verifique freqüentemente. Os meios desidratados são hidroscópicos e desta forma, a pesagem deve ser feita rapidamente e em local de pouca umidade. 3.3 Dissolução Usar vidros bem lavados e enxaguados. Não usar água suspeita de conter cloro, cobre ou detergentes. Usar água deionizada ou destilada. Antes a aplicar calor dissolver meios desidratados deve-se ler o rotulo. Alguns meios não devem ser submetidos a temperaturas acima de 55ºC, (Caldo urea, Agar urea)
  18. 18. 18 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com enquanto que outros meios desidratados devem ser aquecidos a fim de garantir a completa dissolução e distribuição uniforme dos ingredientes. O aquecimento deve ser feito sob agitação continua e suave, evitando que o mesmo se queime no fundo do frasco. A agitação do meio durante o aquecimento deve ser feita com cautela porque alguns meios, especialmente os que contém Agar, podem formar espuma e transbordar. Os meios que contém Agar devem permanecer, em geral durante 5 a 10 minutos em repouso na água, antes de serem aquecidos, para permitir que as partículas de Agar se reidratem adequadamente, elevando a solubilidade do Agar resultando em gel mais uniforme. O meio preparado deve ser distribuído em frasco ou tubo (permitindo uma pequena folga da tampa) apropriado e levado para esterilização. Ao distribuir o meio em recipientes adequados, não devemos colocar mais de 2/3 da capacidade do mesmo. 3.4 Esterilização Alguns meios não devem ser esterilizados em autoclave. Em alguns casos, os meios devem ser esterilizados por filtração, outros são tão seletivos que não necessitam de calor nem de filtro (Agar Salmonella-shiguella, Agar citrato desoxicolato, Caldo de tetrationato, Caldo de selenito). A atividade seletiva destes meios é destruída durante a autoclavação. O microbiologista dispõe de numerosos filtros de diferentes tipos e poros de tamanhos variáveis. Os filtros de membrana (Millipore, Belford, Mass) são provavelmente o sistema de filtro mais usado e podem ser empregados com adaptadores próprios permitindo a esterilização de grandes volumes. Na esterilização por autoclavação o meio não deve ser tratado deficientemente ou excessivamente. O excesso de tratamento em um meio pode acarretar um erro pior do que a subesterilização. É necessário pré-aquecer meios em volumes maiores, para evitar demora em alcançar a temperatura de esterilização. Nunca deve ser autoclavado mais de dois litros por recipiente. Antes de esterilizar o pH do meio deve ser comprovado em potenciômentro
  19. 19. 19 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com (ajustado com tampões). Esta medida deve ser tirada a 25ºC e normalmente não precisa ser ajustada. A adição de componentes pode afetar o equilíbrio do meio. 3.5 Armazenamento do meio pronto De forma geral, os meios prontos devem ser armazenados a temperatura entre 2 e 8ºC (geladeira). O efeito nocivo comumente associado ao armazenamento é a desidratação. Esta não será problema em meios líquidos e sim em meios em placas, principalmente em laboratórios pequenos onde certos meios são usados ocasionalmente. Estes meios em placas devem ser conservados em sacos plásticos, selados, para minimizar a perda de umidade, e estocados em posição invertida. Todos os meios devem ser levados a temperatura ambiente antes de seu uso. Meios como Agar padrão, Agar batata e outros, podem ser guardados em volumes para serem adicionados em placas (15 mL). No momento da analise serão fundidos e resfriados. IV. Objetivo: Familiarizar o aluno na preparação e esterilização de meios de cultura V. Procedimento 5.1 Preparo do meio líquido  Pesar o meio de cultura indicado pelo professor de acordo com as especificações do fabricante, em papel alumínio ou vidro de relógio e, transferi-lo para um becker;  Colocar a quantidade de água de acordo com a quantidade do meio a ser preparado.  Dissolver na chapa de aquecimento  Medir o pH e se necessário ajustar pela adição de NaOH ou HCl 1N  .Distribuir em tubos (na proporção de 5,0 ml)  Esterilizar em autoclave a 121ºC por 15 minutos;
  20. 20. 20 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 5.2 Preparo do meio sólido  Pesar o meio de cultura indicado pelo professor de acordo com as especificações do fabricante, em papel alumínio ou vidro de relógio e, transferi-lo para um frasco de Erlenmeyer;  Colocar a quantidade de água de acordo com a quantidade do meio a ser preparado.  Dissolver na chapa de aquecimento até completa dissolução do meio de cultura  Colocar a boneca (tampa) e a coifa de papel com nome do meio e a data do preparo  Medir o pH e se necessário ajustar pela adição de NaOH ou HCl 1N  Esterilizar em autoclave a 121ºC por 15 minutos;  Sequencia do preparo de meio de cultura para a produção de meio líquido (caldo), sólido (ágar) MEIO AGAR OU CALDO Água destilada Dissolver Corrigir pH Esterilizar em autoclave Armazenar Distribuir Agitação
  21. 21. 21 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 6 Instruções para o Manejo da Autoclave I. Adicionar a quantidade de água se necessário para evitar danos à resistência; Cesto de Inox Resistência coberta com água II. Colocar o material na cesta de inox devidamente acondicionado III. Tornear a tampa, apertar os parafusos por porcas sempre opostas, de forma que a tampa encaixe perfeitamente sobre o friso existente para isto. IV. Abrir a válvula de vapor e ligar a corrente elétrica ou ligar e aceder o gás. V. Ao sair vapor pela válvula de forma contínua, esperar 5 minutos para a expulsão de todo ar e só então fechar a válvula. VI. Vigiar o manômetro e a válvula de segurança. Quando a válvula deixar escapar vapor, verificar a pressão. VII. Quando a temperatura atingir 121º C, controlar para que permaneça estável (regular mediante válvula de escape do vapor). VIII. Inicia-se a contagem de esterilização, geralmente de 15 a 30 minutos. IX. Desligar o aparelho, deixar esfriar e diminuir a pressão. X. Esperar que o ponteiro do manômetro desça até o zero e então abrir a válvula de vapor Válvula de vapor Manômetro Parafusos
  22. 22. 22 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com XI. Terminando o tempo necessário para esterilização, pode-se abrir lentamente o orifício de escapamento, para a pressão descer mais rapidamente; XII. Abrir autoclave somente quando a pressão interna for igual à externa. A abertura antecipada da autoclave é muito perigosa. O líquido com temperatura acima de 100º C não evapora quando a pressão é elevada, baixando bruscamente a pressão, o líquido evapora rapidamente, podendo causar uma violenta explosão, fazendo saltar rolhas e meios, além de causar queimaduras no operador. Autoclave com tampa aberta 7 Importância da Eliminação do Ar Residual na Autoclave O ar é um mau condutor de calor. A ação esterilizante do vapor é devida à facilidade com que ele se condensa sobre as superfícies mais frias dos objetos a serem esterilizados, cedendo-lhes o seu calor latente. O ar interfere nessa condensação, formando um filme protetor em torno do material evitando assim a penetração do calor. Tampa Chave de controle do termostato
  23. 23. 23 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com AULA PRÁTICA Nº 2 PRESENÇA DE MICRORGANISMOS NO AMBIENTE 1 Introdução Os microrganismos são encontrados nos mais diversos ambientes, podendo estar em suspensão ou depositados com a poeira em várias superfícies, entre elas e as mucosas do homem. O meio aquático foi, provavelmente, o ambiente primordial para os diversos microrganismos, os quais se diversificam e colonizaram outros ambientes. Nas partículas de poeira, os microrganismos estão presentes em grandes quantidades e, portanto, são passíveis de entrar em nosso organismo através de diversos mecanismos. Os microrganismos presentes no ar depositam-se na superfície de nosso corpo, cabelos, pele e mucosas, bem como nos alimentos e bebidas. Vivemos, portanto, em completa interação com os microrganismos e precisamos aprender a conviver com eles. Felizmente, a maioria das espécies microbianas é benéfica ou inócua e uma baixa proporção de microrganismos causa prejuízos ao homem. As atividades no laboratório de microbiologia consistem no isolamento, conservação e manipulação de culturas de microrganismos A prática asséptica é de fundamental importância para prevenir que microrganismos contaminantes venham a crescer nos meios artificiais de estudo. Através de técnicas simples, é possível demonstrar a presença de microrganismos em diversos locais do ambiente onde nos encontramos. 2 Objetivos  Reconhecer materiais, equipamentos e normas do laboratório de microbiologia  Averiguar a presença de microrganismos no ambiente de trabalho, na pele.  Averiguar o efeito da higienização das mãos 3 Procedimentos: verificação de contaminação ambiental
  24. 24. 24 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 3.1 Ar  Expor uma placa de Petri contendo o meio de cultura (ágar nutriente):  Manter a placa aberta durante 15 minutos. 3.2 Pele  Tocar os dedos ou expor ao contato de materiais como fio de cabelo, solo etc. 3.3 Respiração  Falar ou tossir sobre o meio de cultura. 3.4 Importante:  Manter uma placa sem exposição ao ambiente, como testemunha.  Identificar as placas, anotando na tampa o tipo de exposição a que foram submetidas, data, nome do aluno, turma e disciplina.  Incubar as placas na posição invertida à temperatura de 35ºC durante 48 horas.  Avaliar a presença de colônias, sua abundância e diversidade.
  25. 25. 25 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com AULA PRÁTICA Nº 3 OBSERVAÇÕES E PREPARAÇÕES MICROSCÓPICAS 1 Microscopia A Microbiologia pode ser definida como o estudo de organismos muito pequenos para serem vistos claramente e individualizado pelo olho humano sem nenhuma ajuda. Para visualização de microrganismos, necessita-se de aumentos, os quais são conseguidos com o uso de um microscópio. O termo microscópio deriva do latim, micro, que significa pequeno; e, do grego Skopos, que significa olhar. O microscópio rotineiramente utilizado no laboratório é o microscópio óptico composto. Seu princípio de funcionamento baseia-se no aumento da imagem por um conjunto de lentes convergentes, associado a uma forte iluminação do campo de observação, fornecendo uma imagem translúcida dos microrganismos. O microscópio desse tipo é utilizado na microscopia de campo claro. Ele permite um aumento útil de aproximadamente mil vezes, e a maioria é equipada com quatro objetivas: a objetiva de imersão e objetivas a seco, sendo uma de grande, outra de médio e a última de pequeno aumento. A essas objetivas são suplementadas as oculares que, em geral, fornecem aumento de dez vezes. O aumento total fornecido pelo microscópio é obtido pela multiplicação do poder de aumento da objetiva pelo poder de aumento da ocular. Com o uso de oculares mais potentes, o aumento total pode ser ampliado de duas a três vezes. Contudo, o aumento de mil a duas mil vezes é o limite da ampliação útil obtido como microscópio óptico. A limitação não é uma questão de aumento, mas do poder de resolução, ou seja, da capacidade de distinguir e separar dois pontos adjacentes. O poder de resolução é função do comprimento de onda da luz utilizada e da abertura numérica, que é uma característica do sistema de lentes utilizado. O limite de máxima resolução é obtido com o menor comprimento de onda da luz visível e com a objetiva de maior abertura numérica.
  26. 26. 26 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 1.2 Partes do Microscópio O microscópio óptico é constituído de um sistema de lentes e de um suporte mecânico, cada um dos quais apresentando várias partes: I. Pé ou base: parte que sustenta todo o aparelho; II. Corpo ou braço: peça que faz a ligação entre o pé e a parte superior do aparelho; III. Platina: dispositivo retangular localizado paralelamente à base, destinado à recepção da lâmina, o qual uma perfuração central para dar passagem à luz; IV. Charriot: conjuntos de parafusos destinados à movimentação da lâmina no plano horizontal; V. Fonte de luz: lâmpada localizada na base do aparelho; VI. Filtro: placa de vidro colorida que pode ser encaixada sobre a fonte de luz para torná-la mais apropriada à observação do material; VII. Diafragma ou íris: dispositivo localizado acima do filtro para controlar a intensidade do feixe de luz que atinge o orifício da platina. VIII. Condensador: Conjunto de lentes localizado logo abaixo da platina, o qual serve para concentrar e tornar paralelo o feixe de luz, fornecendo a iluminação necessária e uniforme do objeto em estudo; IX. Parafuso do condensador: Localizado na lateral do braço, serve para controlar a posição do condensador; X. Revólver: peça circular na qual se inserem as objetivas, as quais podem ser trocadas através da rotação; XI. Objetivas: Os microscópios mais comuns possuem quatro objetivas, que proporcionem aumento de quatro, dez, quarenta e cem vezes; XII. Canhão: parte superior do microscópio onde são encaixadas as lentes oculares; XIII. Lentes Oculares: Lente superior do microscópio que se encaixa no canhão é através delas que o observador olha. A ocular geralmente produz aumentos de 10 vezes, entretanto, existem oculares de 5 e 15 aumentos; XIV. Parafuso macrométrico: parafuso situado na lateral do microscópio, que permite grandes avanços ou recuos da platina em relação à objetiva;
  27. 27. 27 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com XV. Parafuso micrométrico: geralmente encaixado sobre o parafuso macrométrico, de menor diâmetro, que permite pequenos avanços ou recuo da platina( ajuste fino); XVI. Trava: alavanca que fixa o movimento do parafuso macrométrico em uma determinada posição, impedindo a movimentação ascendente da palatina, protegendo as objetivas contra possíveis choques e a quebra de lâminas. 2 Preparações Microscópicas A perfeita visualização dos microrganismos e/ou de suas estruturas só é possível se, além da escolha do tipo mais eficiente de microscopia, a preparação estiver adequada. A escolha do tipo de preparação depende da informação desejada e do microrganismo a ser avaliado. Duas técnicas gerais são empregadas: a fresco e Fixados e corados.
  28. 28. 28 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 2.1 A fresco As preparações deste tipo permitem o exame de organismos nas condições “ normais” de vida. 2.2 Fixados e corados As preparações fixadas e coradas são usadas para verificar as características morfológicas dos microrganismos, sendo bastante utilizadas na identificação, pois tornam mais fácil a visualização das formas e permitem a verificação do comportamento tintorial do organismo em relação às colorações diferenciais. As etapas dessas preparações são:  Preparo do esfregaço;  Fixação;  Coloração 2.2.1 Preparo e fixação de esfregaço A preparação inicial do esfregaço do tipo de cultura disponível. Ele é constituído de uma camada muito fina de material sobre a lâmina e deve ser secado ao ar. A fixação do material na lâmina pode ser feita pela ação do calor, álcool, formol, ácido acético e outros produtos, e destina-se a imobilizar os constituintes celulares, fixando o esfregaço na lâmina, através de precipitação ou coagulação do material protéico. 3 Objetivo  Identificar as diferentes partes do microscópio e manuseá-lo adequadamente;  Aprender a focalizar preparados no microscópio;  Compreender o princípio do funcionamento do microscópio óptico composto;  Aprender a utilizar a técnica de preparação microscópica a fresco entre lâmina e lamínula.  Preparar e fixar esfregaços de culturas em meios sólidos e líquidos. 4 Materiais  Cultura de microalgas em meio líquido  Lâminas para microscopia
  29. 29. 29 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com  Alça de platina  Microscópio óptico  Óleo de imersão  Bico de Bunsen 5 Procedimentos Para Preparação a Fresco I. Coloca-se uma ou duas gotas no centro da lâmina de cultivo de microalgas, recobrindo-se em seguida com uma lamínula e levando-se ao microscópio para a focalização; II. Coloca-se a lâmina preparada a fresco sobre a platina, fixá-la e, com o auxílio do charriot, ajustar o campo a ser observado sobre a abertura que existe na platina; III. Focalizar, com o auxílio do macrométrico, aproximando a objetiva de menor aumento o máximo possível da lâmina. Observa-se, através da ocular, a imagem obtida e, a partir deste ponto, usa-se o macrométrico afastando-se a objetiva da lâmina até a observação da imagem procurada. Em seguida, usa-se o micrométrico para focalizar e obter melhor nitidez da imagem. Necessitando-se de um aumento maior, gira-se o revólver para a objetiva seguinte e torna-se a focalizar com micrométrico, e assim sucessivamente. IV. Para observar a preparação com objetiva de imersão, colocar uma gota de óleo de cedro sobre a lâmina e girar o revolver para colocar a objetiva de imersão em foco; V. Olhando pelo lado, fazer descer o canhão como parafuso macrométrico, até que a lente frontal da objetiva fique encostada no óleo de imersão; VI. Mover o parafuso micrométrico até conseguir uma boa focalização.
  30. 30. 30 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com Preparação de lâmina a fresco 5.1 Procedimentos para preparo e fixação de esfregaço a) Culturas em meio líquido  Retirar uma gotícula da cultura com alça de platina esterilizada e colocar no centro da lâmina, tomando cuidado para não atingir as bordas. Esterilizar a alça de platina na chama.  Secar o esfregaço ao ar.  Fixar o esfregaço passando a lâmina, com o lado do esfregaço virado para cima, três vezes sobre a chama do bico de Bunsen. Após resfriamento, procede-se à coloração. b) Culturas em meio sólido Colocar uma gotícula esterilizada na lâmina.  Colocar uma gotícula de água esterilizada na lâmina;  Retirar uma pequena quantidade da cultura e misturar com á água;  Espalhar o material no centro da lâmina, tomando cuidado para não atingir as bordas. Esterilizar a alça de platina na chama.  Fixar o esfregaço passando a lâmina, com o lado do esfregaço virado para cima, três vezes sobre a chama do bico de Bunsen.
  31. 31. 31 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com AULA PRÁTICA Nº 4 COLORAÇÃO DE GRAM 1 Introdução As colorações podem ser simples (azul de metileno, Giemsa) ou diferenciais (Gram, Ziehl-Neelsen). As simples são efetuadas pela aplicação de um único corante, sendo as células geralmente coloridas de maneira uniforme. Nas diferenciais entre elas ou entre estruturas de uma mesma célula. A coloração com azul de metileno é utilizada principalmente na avaliação da morfologia, pois os danos causados à célula são menores devido ao menor número de manipulações. Ela é realizada colocando-se o corante sobre o esfregaço previamente fixado. Deixa-se corar por 3-5 minutos, escorre-se o corante, lava-se em água corrente e deixa-se secar para posterior observação ao microscópio. A coloração de Giemsa é utilizada em células que não possuem parede celular e a Ziehl- Neelsen para a identificação de microrganismos ácido- resistentes. A Coloração de Gram é a técnica de coloração diferencial mais importante e mais utilizada em bacteriologia, foi introduzida pelo dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, em 1884. É muito utilizado até hoje na sistemática bacteriana. Além das características morfológicas, este método permite evidenciar determinadas propriedades das bactérias, as quais são classificadas em Gram – positivas e Gram –negativas, de acordo com diferenças na composição e estrutura da parede celular. 1.1 Finalidades da coloração de GRAM A parede celular de bactérias Gram- positivas é composta basicamente por peptídeoglicano, que constitui uma espessa camada ao redor da célula. Imersos nesta camada, podem estar presentes outros polímeros, como ácidos lipoteicóicos e polissacarídeos. Nas bactérias Gram – negativas o peptideoglicano constitui uma camada basal delgada, sobre a qual se encontra uma outra camada, composta por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopossacarídeos, denominada membrana externa. A coloração
  32. 32. 32 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com de Gram consiste, basicamente, em tratar bactérias sucessivamente com cristal violeta, lugol, álcool e Safranina ou fucsina. O cristal violeta e o lugol penetram tanto nas bactérias Gram- positivas quanto nas Gram- negativas, formando um complexo de cor roxa. O tratamento com álcool é a etapa diferencial; nas Gram- positivas, o álcool não retira o complexo cristal violeta+ lugol, pois a sua ação desidradante faz com que a espessa camada de peptídeoglicano se torne menos permeável, retendo o corante. Nas Gram-negativas, devido à pequena espessura da camada de peptídeoglicano, o complexo corado é extraído pelo álcool, deixando as células descoradas. O tratamento com safranina ou fucsina não altera a cor roxa das Gram- positivas, ao passo que as Gram- negativas, descoradas pelo álcool tornam-se avermelhadas. A diferença de comportamento das bactérias frente à coloração de Gram significa a existência de diferenças marcantes e fundamentais entre as bactérias Gram- positivas e negativas:  Na permeabilidade da parede celular;  Na composição química e estrutura bacteriana;  No metabolismo. Estas diferenças que refletem na patogenicidade. Gram- Positiva Gram - Negativa 2 Objetivo:  Discutir o mecanismo da reação de Gram; peptídeoglicano Membrana citoplasmática Membrana citoplásmatica Membrana externaEspaço periplásmatico
  33. 33. 33 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com  Familiarizar o estudante com as várias etapas da técnica de coloração;  Caracterizar as diferentes espécies bacterianas de acordo com sua reação à coloração de Gram. 3 Material: Lâmina; Bico de Bunsen; Estufa; Microscópio; Cristal violeta; Lugol; Safranina e Álcool. 4 Procedimento I. Lavar a lâmina com água e sabão e/ou álcool e éter. Secar a lâmina e verificar se toda gordura foi removida. II. Colocar uma ou duas gotas do liquido contendo a suspensão na lâmina. Espalhar sobre uma área de cerca de 1,5 cm de diâmetro. III. Deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente ou em estufa. IV. Passar o esfregaço 3 vezes sobre a chama do bico de Bunsen para fixação do mesmo. V. Adicionar o Cristal violeta, aguardar 1 minuto. VI. Aplicar solução de Lugol esperar 60 segundos. Lavar com água. VII. Descorar com álcool absoluto até que todo o corante seja removido. VIII. Corar com Safranina esperar por 30 segundos. Lavar e secar. IX. Examinar ao microscópio com a objetiva de imersão. OBSERVAÇÕES: I. Quando o material a ser analisado for viscoso, deve-se proceder à diluição usando- se uma gota de água destilada. II. A fixação do esfregaço faz-se necessária para manter o microrganismo aderido à lâmina. III. O Lugol é uma substancia mordente empregada com o objetivo de fixar o corante à célula. IV. O álcool é agente descorante que remove o corante de certas bactérias. V. Cultivos antigos de algumas bactérias Gram positivas podem perder a propriedade de reter o Cristal violeta, e, conseqüentemente, poderão se corar com a safranina.
  34. 34. 34 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com Gram – positiva (roxa) Gram – negativa (vermelha) ____________________________________________________________ Exercício Com os conhecimentos que você adquiriu, indique a coloração de cada tipo de célula bacteriana após o uso de cada reagente, durante o procedimento de coloração: PROCEDIMENTO GRAM + GRAM - Cristal de violeta Lugol Álcool Safranina Esquematizar os preparados observados: a)Bactérias Gram- positivas b) Bactérias Gram- negativas
  35. 35. 35 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com AULA PRÁTICA Nº 5 PREPARO DE DILUIÇÃO 1 Introdução Para utilizar os métodos para efetuar a contagem de microrganismos geralmente utiliza-se diluição em série por ser difícil realizar a contagem de milhares ou centenas de colônias. Assim sendo, efetua-se a diluição da cultura que se pretende contar antes de plaquear (transferir) um volume conhecido de cultura para a placa sólida. Para se fazer uma diluição em série, começa-se com organismos em meio líquido. Acrescentando 1 ml deste meio a 9ml de água diluição, cria-se uma diluição de 1:10; acrescentando 1 ml da diluição 1:10 a 9ml de água de diluição , cria-se uma diluição de 1:100, e assim por diante. O número de bactérias por mililitro de fluido é reduzido em 9/10 a cada diluição. IMPORTANTE: Para se determinar o número de unidades formadoras de colônias na cultura original, deve-se multiplicar o número de colônias encontradas na placa pelo o fator de diluição; se esta for uma fração deve-se usar o denominador. Um fator de diluição de 1000 seria expresso por 1:1000. 2 Objetivo Familiarizar o estudante coma técnica de diluição, para utilizar nas técnicas de contagem de microrganismos. 3 Procedimento I. Preparar uma série de tubos estéries contendo 9 mL de liquido de diluição estéril. II. Com uma pipeta estéril, transferir 1 mL da amostra ao primeiro tubo contendo 9mL do liquido de diluição estéril, esta diluição é 1/10. Etiquetar o tubo com a diluição correspondente. III. Agitar a amostra energicamente para obter uma boa distribuição das bactérias na massa liquida.
  36. 36. 36 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com IV. Descartar a pipeta usada V. Usando nova pipeta estéril, transferir assepticamente 1 mL da diluição 1/10, esta é a diluição 1/100. Etiquetar o tubo. VI. Descartar a pipeta usada. VII. Agitar o tubo de diluição 1/100 VIII. Usando nova pipeta estéril, transferir assepticamente 1 mL da diluição 1/100 a outro tubo de diluição com 9 mL diluição, esta é a diluição 1/1000. Etiquetar o tubo. IX. Da mesma forma, segue-se preparando maiores diluições 1/10.000; 1/100,000 quantas forem precisas. 3.1 Líquido de Diluição Utilizar solução Ringer diluída a ¼. A composição é a seguinte  Cloreto de sódio 9,0 g  Cloreto de potássio 0,42 g  Cloreto de cálcio anidro 0,24 g  Bicarbonato de sódio 0,20 g  Água destilada 1000 mL Antes do uso, selecionar parte da solução acima à três partes da água destilada. O líquido de diluição deve ser acondicionado em garrafas apropriadas que contenham 99; 90 ou 9mL após esterilização. OBSERVAÇÕES  Todo material usado deve ser esterilizado.  Em cada diluição, deve-se descartar a pipeta usada. O uso da mesma pipeta no preparo de duas diluições consecutivas implica incorporar à diluição maior, bactérias provenientes de diluição anterior que, por exemplo ficaram nas pipetas. O erro assim causado é altamente significativo e a contagem final não terá validade.
  37. 37. 37 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com
  38. 38. 38 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com AULA PRÁTICA Nº 6 CONTAGEM DE MICRORGANISMOS EM PLACAS 1 Técnicas de contagem O crescimento de microrganismo é medido através da estimativa do número de células que foram geradas por divisão binária durante uma fase de crescimento. Esta medida é expressa como o número de organismos viáveis (vivos) por militro de cultura. Existem vários métodos para contagem de microrganismos que são aplicados nas analises de alimentos e em analises de água. 1.1 Contagem direta ou microscópica Com a ajuda de uma câmara de contagem são contados o numero de células existentes em um determinado volume do material. Um exemplo é o método de Breed utilizado freqüentemente na analise de leite cru e que preconiza a contagem do numero de células em vários campos microscópicos na quantidade de amostra. Através da relação existente entre a área do estendido e a área do campo microscópico é possível se calcular o numero de bactérias por mL. 1.2 Contagem metabólica Método baseado no aproveitamento de uma dada atividade metabólica especifica das bactérias sobre um dado substrato. Por exemplo: a prova de redução do azul de metileno que é também praticada na análise do leite cru. 1.3 Contagem de microrganismos viáveis em placa Semeaduras de material contaminado em placa (pour-plate ou superfície) respeitando as condições ótimas do microrganismo que se procura, isto é, meio de cultura adequado, temperatura, oxigênio e tempo necessário para favorece seu crescimento e permitir ao final, a contagem das colônias formadas.
  39. 39. 39 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 1.4 Semeadura em placas O método de contagem de microrganismos em placas é um método geral, que pode ser utilizado tanto para a contagem de grandes grupos microbianos, como os aeróbios mesófilos, os aeróbios psicrotróficos, os bolores e leveduras e os clostrídios sulfitos redutores, como também para a contagem de gêneros e espécies em particular como Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Clostridium perfringens, por exemplo. Esta versatilidade é decorrente do principio do método que se baseia na premissa de que cada célula microbiana presente em uma amostra irá formar, quando fixada em um meio de cultura sólido adequado, uma colônia visível e isolada. Variando o tipo de meio (meio de enriquecimento, meio seletivo, meio diferencial) e as condições de incubação ( temperatura e necessidade de oxigênio), é possível selecionar o grupo, gênero ou espécie que se deseja contar. Como as células microbianas muitas vezes ocorrem em agrupamentos (pares, tétrades, cachos, cadeias, etc), não é possível estabelecer uma relação direta entre o numero de colônias e o numero de células. A relação correta é feita entre o numero de “Unidades Formadoras de Colônias” (UFC), que podem ser tanto células individuais como agrupamentos característicos de certos microrganismos. 1.4.1 Semeadura em profundidade ou pour-plate Consiste em colocar 1,0 ou 0,1 mL do material, objeto de exame nas placas, agrega- se 15-20 mL do meio de cultura fundido e resfriado a temperatura de ± 45ºC agitando-se com movimentos rotativos por pelo menos 5 vezes, nos dois sentidos, isto é, a favor dos ponteiros do relógio e contra os mesmos. As placas assim preparadas devem ser incubadas a temperatura e condições recomendadas pelo método e classe de contagem realizada. Incubar as placas invertidas e após incubação proceder à contagem das mesmas com ajuda de um contador de colônias. Trabalhar sempre com 2 placas para cada diluição. 1.4.2 Semeadura em superfície Consiste em distribuir o meio de cultura a se trabalhar em prepara placas (15-20 mL) esperar solidificar e uma vez preparada as diluições semeia-se 0,1 mL das diluições escolhidas utilizando-se também duas placas para cada diluição. Estender toda alíquota semeada com uma alça de Drigalski. Ressalte-se que o Agar preparado e distribuído nas
  40. 40. 40 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com placas para este procedimento deve ser usado imediatamente ou no máximo em 24 horas. Para contagem procede-se da mesma forma do método anterior. 1.4.3 Semeadura por gota (em superfície) Após preparar o meio e distribuí-lo em placas, esperar solidificar e dividir a placa em 3 segmentos iguais conforme desenho abaixo: Em seguida, utilizando-se de uma pipeta especialmente calibrada, depositar 2 gotas (0,04 mL) de cada diluição sobre a superfície do meio. Desta forma logramos semear 6 diluições com o uso de apenas duas placas. 1.4.4 Técnica da membrana filtrante Baseia-se na filtração de um volume conhecido da amostra, através de uma membrana estéril de poros de 0,45mm de diâmetro, que retém os microrganismos. Após a filtração, a membrana é transferida para uma placa de Petri contendo meio de cultura adequado e incubado a temperatura, oxigênio e tempo necessário para favorece seu crescimento e permitir ao final, a contagem das colônias formadas. A filtração é feita em um aparelho que consta de funil com tampa (para preservar a esterilidade da amostra), suporte de membrana e frasco receptor. O frasco receptor conecta-se a uma bomba de vácuo, o funil é esterilizado por água fervura em água destilada durante 5 minutos. Vantagens da técnica  Permite a filtração de grandes volumes de amostra. É ideal para amostra que contenham de 1 a 2 bactérias por litro.  Períodos de incubação mais curtos  É fácil de se utilizar, permitindo análise de um numero grande de amostra em pouco tempo.  Apresenta alta precisão e reprodutibilidade. Desvantagem  Alto custo da membrana  As membranas ficam entupidas com amostras que possuam abundantes materiais em suspensão.
  41. 41. 41 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 2 Objetivo: Familiarizar o estudante com uma das técnicas de contagem, para avaliação do crescimento de bactérias. 3 Procedimento: A) Contagem em superfície I. Preparar diluições decimais da cultura transferindo1 ml para o tubo contendo 9ml de água de diluição, diluição de fator 10 (concentração 1:10 ou1/10) II. Homogeneizar a suspensão. III. Transferir, a partir da diluição anterior, 1 ml para outro tubo contendo 9 ml de água de diluição, homogeneizar a suspensão, e assim sucessivamente, de modo a obter as diluições: 102 ; 103 ;104 ;105 ;106 ;107 . IV. Colocar o meio de cultura nas placas e deixar solidificar; V. Identificar as placas marcando o nome, turma, data, diluição (105 ;106 ;107 ) e repetição (I, II e III); VI. Inocular as placas, previamente identificadas com 1ml das respectivas diluições; VII. Espalhar rapidamente líquido, com alça de Drigalski, até que este seja absorvido pelo meio. VIII. Colocar as alças em solução desinfetante; IX. Incubar as placas na posição invertida à temperatura adequada no mínimo 24 horas. X. Escolher a diluição cujas placas apresentem de 30 a 300colônias. XI. Proceder a contagem das colônias; XII. Calcular o número de bactérias ( UFC – unidades formadoras de colônias) /ml da cultura original utilizando a seguinte fórmula. XIII. Nº de bactérias ( UFC)/mL = média do nº de colônias x fator de diluição
  42. 42. 42 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com B) Contagem pelo método pour plate I. Preparar as diluições e identificar as placas conforme descritos no procedimento de contagem “em superfície”. II. Inocular as placas com 1 ml das respectivas diluições. III. Verter o meio de cultura a ±50ºC e misturar realizando movimento de rotação no sentido horário e no sentindo anti- horário durante alguns segundos. IV. Deixar solidificar. V. Incubar as placas na posição invertida à temperatura adequada durante no mínimo 24 horas. VI. Escolher a diluição cujas placas apresentem de 30 a 300 colônias. VII. Proceder a contagem das colônias. VIII. Calcular o número de bactérias (UFC)/mL da cultura original utilizando a seguinte fórmula: IX. Nº de bactérias ( UFC)/mL = média do nº de colônias x fator de diluição
  43. 43. 43 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com Esquema de contagem em placa Repetições Diluição utilizada Contagem 1 2 3 Média =
  44. 44. 44 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com II UNIDADE TEMÁTICA AULA PRÁTICA Nº 7 ANÁLISE MICROBIOLOGICA DE ÁGUA – TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS 1 Número mais provável – tubos mais provável /NMP Neste método em um meio de cultura liquido, a partir de uma amostra representativa, se colocam varias series de diluições (série de 3 ou 5 tubos) paralelas e observar o crescimento bacteriano. Este se manifesta através de turbidez e gás evidenciado nos tubos de Durham colocados previamente dentro dos tubos de ensaios. Assim os tubos devem ser incubados a temperatura e condições recomendadas pelo método. Após incubação a partir dos tubos onde houve crescimento evidenciado pela presença de turbidez e/ou gás se determina o numero mais provável (NMP) consultando a tabela de McCrady onde este número estará referido como sendo N.M.P./100ml ou grama da amostra analisada. 2 Coleta de Amostras As águas a serem coletadas para o exame bacteriológico devem ser colhidas com esterilidade e em pontos representativos da planta de tratamento, do sistema de distribuição ou do manancial. A análise deve ser feita através dos métodos padrões a fim de poder comparar os resultados obtidos em diferentes épocas e em diferentes regiões. 2.1 Frascos de Coleta Deve-se utilizar frascos escuros com tampas de boca larga e capacidade mínima de 120 mL. O frasco será esterilizado, com tiossulfato de sódio (100mg de tiossulfato por 1 litro de água), se é destinado à água clorada ou sem tiossulfato para outros tipo de água. A tampa e o gargalo do frasco devem ser protegidos com papel tipo Kraft ou papel alumínio. 2.3 Coleta de Amostra de Torneira
  45. 45. 45 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com Não deve fazer coletas em torneiras com vazamento. Abre-se a torneira, deixa-se correr a água para eliminar a que ficou retida na tubulação. Fecha-se, seca-se com um pano limpo. Esteriliza-se a torneira com um cotonete grosso de algodão embebido em álcool e aceso. Abre-se novamente a torneira deixa-se sair um pouco de água. Abre o frasco, enche deixando 2 cm de ar para poder agitar a amostra antes da análise. Fecha o frasco e a torneira. 2.4 Coleta de Amostra de Piscina Recomenda-se coletar água da superfície e a 30 cm de profundidade. Na superfície forma-se um filme de gorduras proveniente do corpo do banhista, e o número de bactérias é maior e não necessariamente representativo da massa de água restante. O frasco deve conter tiossulfato e as coletas deverão ser feitas na hora de maior concorrência. 2.5 Coleta de Amostra de Rios, Lagos, etc. O ponto de amostragem dependerá do que se deseje pesquisar. Em reservatórios naturais utilizados como fonte de água potável, os pontos de coleta serão próximo ao ponto de captação e na mesma profundidade que este. Não devem coletar-se amostra nas bordas dos reservatórios, rios, etc, porque nesta região a água é mais poluída e há acúmulos de matéria orgânica e crescimento de plantas e insetos o que eleva o teor bacteriológico e o resultado não seria representativo. 2.6 Balneários Os pontos de coleta são os lugares mais concorridos; amostras devem ser tomadas na hora de pico, a freqüência de coleta será aumentada na época de chuva. Todos os fracos com amostras devem ser etiquetados com data, hora lugar e profundidade da coleta. Outros parâmetros que são úteis na analise dos resultados são temperatura da água no momento da coleta e pH. Às vezes precisa-se de barcos, frascos para coleta em profundidade, etc. Para mergulhar frascos em rios, lagos etc, passa-se arame pelo gargalo, deixando-se um extremo comprido, sustenta-se a garrafa pela base e coloca-se na água e se mexe em contra-corrente desde o extremo do arame.
  46. 46. 46 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 2.7 Conservação da Amostra As amostras devem chegar ao laboratório sem modificação de sua população bacteriana. A situação ideal é proceder nas amostras 2 horas seguintes à coleta. Quando não é possível, deve-se conservar em isopor com gelo para manter a temperatura inferior a 10ºC. Nestas condições a amostra se preserva durante 6 horas e deve ser processada nas 2 horas seguintes (ou seja, em um total de 8 horas após a coleta). 3 Procedimento das Análises: 3.1 Ensaio Presuntivo I. Semear três series de 5 tubos, utilizando 10mL;1mL e 0,1mL em caldo lactosado (CL) ou caldo lauril triptose (CLT), contendo tubos de fermentação (Duhan) invertido. Para inoculações das porções de 10 mL da amostra, usar o CL ou o CLT em concentração dupla. II. Identificar os tubos anotando a amostra a data e as porções da amostra. Identificar também os frascos de diluição. III. Homogeneizar a amostra IV. Preparo de diluições: Com uma pipeta estéril de 1 mL e obedecendo aos cuidados de assepsia, transferir 1 mL da amostra para um frasco contendo 9 mL do liquido de diluição, antecipadamente identificado. Prepara-se assim, a primeira diluição decimal (10-1 ), sendo que 1 mL da mesma corresponde a 0,1mL da amostra. Homogeneizar. V. Com uma pipeta estéril transferir 10 mL da amostra para os 5 tubos da primeira serie contendo o meio CL ou CLT de concentração duplo. Desprezar a pipeta, homogeneizar os frascos. VI. Com uma pipeta estéril transferir 1 mL da amostra para os 5 tubos da segunda serie contendo o meio CL ou CLT. Desprezar a pipeta, homogeneizar os frascos. VII. Com uma pipeta estéril transferir 1 mL da diluição 10-1 para os 5 tubos da terceira serie contendo o meio CL ou CLT. Desprezar a pipeta, homogeneizar os frascos. VIII. Colocar a estante contendo os tubos inoculados na estufa a 35ºC durante 24-48 horas.
  47. 47. 47 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com IX. Após esse período de incubação, retirar os tubos da estufa para efetuar a primeira leitura dos resultados. Para isso, agitar cada tubo e verificar a presença de turbidez e/ou gás nos tubos. Descartar os tubos negativos. 3.1.1 Ensaio Confirmativo para Coliformes a 35ºC O ensaio confirmativo é efetuado utilizando-se o caldo lactosado verde bile brilhante 2% (CLVBB) para determinação de coliformes totais e caldo EC para coliformes termotolerante. I. Identificar os tubos de CLVBB, contendo tubos de Duhan invertido, correspondente respectivamente a cada tubo de CL ou CLT com resultado presuntivo positivo. II. Agitar bem o tubo de CL ou CLT com resultado presuntivo positivo e, com uma haste de madeira ou alça de platina, repicar o material e inocular no tubo correspondente de CLVBB. Agitar. III. Incubar os tubos de CLVBB inoculados, durante 24-48 horas a 35ºC. IV. Proceder a leitura após o tempo de incubação, considerando como teste confirmativo para coliformes totais todos os tubos que apresentarem gás nos tubos de Duhan invertido com ou sem turbidez. Anotar os resultados e verificar o NMP de coliformes totais na tabela em anexo. EXEMPLO: TUBOS 1 2 3 4 5 TUBOS + 10 mL + + - - - 2 1 Ml + - - - + 2 0,1mL (10-1 ) - - - - - 0 De acordo com a tabela o NMP de CT = 21g/100mL 3.1.2 Diferenciação para Termotolerantes Esta diferenciação, feita a partir dos tubos positivos de CL ou CLT. I. Identificar os tubos com caldo EC, contendo tubos de Duhan invertido, correspondente respectivamente a cada tubo de CLVBB com resultado presuntivo positivo.
  48. 48. 48 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com II. Agitar bem o tubo de CLVBB com resultado presuntivo positivo e, com uma haste de madeira ou alça de platina, repicar o material e inocular no tubo correspondente de caldo EC. Agitar. III. Incubar os tubos de caldo EC inoculados, durante 24 horas a 44,5ºC. IV. Proceder a leitura após o tempo de incubação, considerando como teste confirmativo para coliformes termotolerantes todos os tubos que apresentarem gás nos tubos de Duhan invertido com ou sem turbidez. Anotar os resultados e verificar o NMP de coliformes termotolerantes na tabela em anexo. V. Se a finalidade do ensaio for o exame completo, prosseguir a partir dos tubos CLVBB com resultado positivo no ensaio confirmativo. 3.1.3 Ensaio Completo (Opcional) I. Identificar placas contendo o meio solidificado Agar eosina azul de metileno (EAM), correspondendo a cada uma, a um tubo de CLVBB com resultado positivo. II. Flambar e resfriar uma alça de platina. III. Agitar e inclinar o tubo de CLVBB e mergulhar a extremidade da alça de platina no liquido do tubo a uma profundidade de, aproximadamente, 1 cm. IV. Depositar o inóculo em um ponto das bordas da placa de Agar EAM, gira-la e iniciar seu espalhamento na superfície do primeiro quadrante, tomando cuidado para que a parte encurvada da alça toque apenas a superfície do meio, evitando racha-lo. V. Girar novamente a placa e continuar o espalhamento no segundo quadrante. VI. Proceder dessa maneira ate completar a semeadura em toda superfície do Agar. VII. Fechar e incubar a placa em posição invertida durante 24 horas a 35ºC. VIII. Após o período de incubação, efetuar a leitura, considerando as colônias típicas de coliformes as colônias nucleadas, com ou sem brilho metálico. IX. Considerar como colônias atípicas de coliformes as colônias rosas, mucoides, opacas e sem núcleo e, como colônias negativas, todos os outros tipos de colônias. 3.2 Contagem total de microrganismos heterótrofos aeróbios Meio de cultura: Agar padrão para contagem(APC)
  49. 49. 49 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com I. Pipetar assepticamente porções de 1mL das diluições selecionadas, transferindo-as para as placas de Petri devidamente identificadas. Semear em duplicatas, utilizando no mínimo duas diluições diferentes. Adicionar a cada placa aproximadamente 15mL do meio previamente fundido. II. O espaço de tempo decorrido entre a semeadura e a adição do meio não deve utrapassar a 20 minutos. III. Homogeneizar cuidadosamente, em movimento de vai-vem, sentido horário e ante- horário. IV. Como prova de esterilidade, adicionar 15mL do meio previamente fundido em placa sem amostra. Deixar solidificar em superfície plana V. Incubar As placas invertidas em estufa a 35ºC por 48 horas VI. Após o período de incubação selecionar as placas que contenha entre 30 e 300 colônias Cálculo Calcular a média aritmética dos resultados encontrados em uma mesma diluição e multiplicar pela diluição Exemplo: Diluição 10 -2 placa 1 = 36 colônias Diluição 10 -2 placa 2 = 39 colônias 36 + 39 = 37,5 x 100 = 3750 colônias Nº de bactérias = 3,7 x 103 UFC/ mL da amostra
  50. 50. 50 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com AULA PRÁTICA Nº 8 ANÁLISE MICROBIOLOGICA DE ÁGUA – TÉCNICA COLILLERT 1 COLILERT – tecnologia de substrato definido O Colilert usa uma tecnologia chamada Defined Substrate Technology (DST) para analisar simultaneamente coliformes totais e E. coli. Dois nutrientes indicadores, ONPG e MUG são as principais fontes de carbono no Colilert e são metabolizados pelas enzimas β- D-Galactosidase e β-D-Glucoronidase indicando as bactérias coliformes e E. coli respectivamente. Os coliformes se desenvolvem no Colilert usando a Galactosidase para metabolizar o ONGP e com isso a amostra incolor passa a amarela. A E. coli usa a Glucoronidase para metabolizar o MUG e gerar fluorescência quando a amostra é exposta à luz UV de 365 nm. Como a maior parte dos microrganismos não coliformes não possuem essas enzimas, a interferência desses é muito menor se comparados aos métodos tradicionais. Os poucos não coliformes que possuem essas enzimas são inibidos pela matriz antibiótica especifica do Colilert. Assim essa forma de detecção é muito diferente dos métodos tradicionais, não há formação de colônias. Aos açucares usados no Colilert permitem que coliformes estressados sejam recuperados mais facilmente, pois exigem menor nível de energia para ser metabolizados. Isso não ocorre nos métodos tradicionais, pois os meios de cultura nesses métodos utilizam açucares comuns como a lactose e também, utilizam altos níveis de sais e detergentes a fim de inibir os não coliformes e por isso prejudicam a recuperação de coliformes principalmente os injuriados. 2 Teste de presença / ausência » Passo 1 Adicione o reagente na amostra, homogeneíze e incube a 35 °C por 24 horas.
  51. 51. 51 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com » Passo 2 Interpretação dos resultados: Incolor = resultado é negativo. Amarelo = resultado é positivo para Coliformes Totais. Amarelo / Fluorescente = resultado é positivo para E.coli. 3 Teste quantitativo » Passo 1 Adicione o reagente na amostra, e agite levemente para dissolver o reagente. » Passo 2 Adicione toda a amostra com o Colilert dentro da cartela Quanti-Tray® (contagem de 1 a 200 NMP) ou Quanti-Tray® / 2000 (contagem de 1 a 2419 NMP) . » Passo 3 Sele a cartela na Seladora Quanti-Tray. Incube a cartela por 24 horas 35 ºC. » Passo 4 Interpretação dos resultados: Cavidades amarelas = Coliformes Totais. Cavidades amarelas / fluorescentes = E. coli.
  52. 52. 52 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com AULA PRÁTICA Nº 9 ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS FRESCOS CARNES/QUEIJOS/LINGUIÇAS A qualidade global de um alimento é determinada por diversos fatores de natureza física, química nutricional e microbiológica. 1º DIA DE TRABALHO 1 Procedimento I. Pesar 25 ou 10 gramas da amostra II. Emulsionar as 25 gramas da amostra em 225 mL ( 10 gramas da amostra em 90mL) do liquido de diluição estéril (diluição 1/10) III. Homogeneizar IV. Pipetar 9 mL em frascos de diluição V. Preparar diluições 1/100; 1/1000 e 1;10.000 VI. Trabalhe sempre junto a chama do bico de Bunsen e não esquecer de agitar e flambar os tubos antes de pipetar. 2 Determinação das Bactérias do Grupo Coliformes Meios de cultura utilizados: Verde Bili Brilhante 2%; (CLVBB); Caldo EC e Eosina Azul de Metileno I. Organize seu material de trabalho. Identifique os tubos segundo o esquema Amostra: Diluição: Data: II. Organize em uma estante 3 séries de 3 tubos cada um contendo o meio de cultura Verde Bili Brilhante 2%; (CLVBB);
  53. 53. 53 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com III. Inocule : 1 mL da diluição 1/10 na primeira serie. Agite 1mL da diluição 1/100 na segunda serie. Agite 1 mL da diluição 1/1000 na terceira serie. Agite. IV. Incube a 35ºC por 24 horas. 3 Contagem de Staphylococcus I. Identifique as placas. A identificação deve ser feita na tampa das placas: Amostra: Diluição: Data: II. Preparação das placas: Para o plaqueamento em superfície, as placas devem ser previamente preparadas, adicionando 15 a 20 mL do meio adicionado de telurito de potássio nas placas. Antes de usar o meio deve estar solidificado III. Preparar 3 diluições adequadas da amostra. IV. Inocular 0,1 mL de cada diluição na superfície das placas, previamente preparadas, e usando uma alça de Drigalski, espalhar o inóculo por toda superfície do meio, até que todo o excesso de liquido seja absorvido. Nota 1. Usar pipeta de no Maximo 1,0 mL para a transferência do inoculo de 0,1 mL. Não assoprar a pipeta nem mudar a ponta de posição para liberar a ultima gota. Nota 2. Fazer o espalhamento da placa de maior para a placa de menor diluição, flambando a alça de Drigalski com etanol 70%, entre uma placa e outra. Resfriar a alça na parte interna da tampa da placa antes de coloca-la em contato com o inóculo. V. Aguardar que as placas sequem (mínimo 15 minutos). VI. Incubar as placas não invertidas a 35ºC durante 48 horas. Todas as análises serão feitas em duplicatas.
  54. 54. 54 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 4 Contagem total de bolores e leveduras I. Selecionar 3 diluições adequadas da amostra e inocular 1,0 mL de cada diluição em placas de Petri estéreis e vazias, abrindo as placas apenas o suficiente para inserir a pipeta, próximo ao bico de Busen. II. Nota 1: depositar o inóculo fora do centro da placa, pois isso facilitará a posterior mistura com o meio de cultura. III. Verter nas placas inoculadas, 15 a 20 mL de Agar Batata, previamente fundido e resfriado a 45C. Misturar o inoculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas, numa superfície plana, em movimentos em forma de oito e/ou em movimentos circulares, 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 vezes no sentido anti horário Nota 2: o meio de cultura deve ser resfriado em água corrente a 45ºC, secar o frasco, para evitar respingos de água nas placas, no memento do plaqueamento. Evitar agitação com movimentos bruscos para que não haja formação de bolhas no meio. Nota 3: A mistura do meio com o inoculo deve ser feita imediatamente após a adição do meio, para não haver risco de solidificação do agar. A movimentação das placas deve se feita cuidadosamente, para evitar respigos de mio nas bordas ou nas tampas das placas. IV. Aguardar a completa solidificação do meio de cultura, nas placas. Após solidificação inverter as placas e incubar a 25ºC por 3 dias. 2º DIA DE TRABALHO 1 Determinação das Bactérias do Grupo Coliformes I. Após as 24 horas separe os tubos positivos (aparecimento de turbidez e gás nos tubos de Duhan). II. Fazer leitura na tabela do NMP e multiplique o resultado por 10. Descarte os tubos negativos. Você tem os resultados para coliformes a 35ºC.
  55. 55. 55 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com III. Identificar os tubos com caldo EC, contendo tubos de Duhan invertido, correspondente respectivamente a cada tubo de CLVBB com resultado positivo. IV. Agitar bem o tubo de CLVBB com resultado positivo e, com uma haste de madeira ou alça de platina, repicar o material e inocular no tubo correspondente de caldo EC. Agitar V. Incubar os tubos de caldo EC inoculados, durante 24 horas a 44,5ºC 3º DIA DE TRABALHO 1 Determinação das Bactérias do Grupo Coliformes I. Proceder à leitura após o tempo de incubação, considerando como teste confirmativo para coliformes a 45ºC todos os tubos que apresentarem gás nos tubos de Duhan invertido com ou sem turbidez. Anotar os resultados e verificar o NMP de coliformes a 45ºC na tabela em anexo, MULTIPLIQUE O RESULTADO POR 10. 2 Contagem de Staphylococcus I. Selecionar as placas que contenham de 50 a 150 colônias, multiplicar o resultado por 10 para levar em conta o volume 10 vezes menor inoculado na placa. II. Nº de Staphilococcus = media das colônias contadas nas placas x10 / diluição
  56. 56. 56 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 4º DIA DE TRABALHO 1 Contagem total de bolores e leveduras I. Contar as colônias com auxilio de uma lupa, em um contador de colônias. Calcular o número de unidades formados de colônias (UFC) por mL da amostra multiplicando o numero de colônias pelo inverso da diluição inoculada. Usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula na apresentação dos resultados.
  57. 57. 57 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com AULA PRÁTICA Nº 10 ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS PROCESSADOS LEITES / SUCOS / NECTAS / REFRIGERANTES Sob o aspecto microbiológico, o exame de um determinado alimento fornecerá informações importantes sobre a qualidade da matéria prima utilizada, higiene e sanitização da manipulação do alimento. 1° DIA DE TRABALHO 1 Procedimento I. Preparação da amostra II. Abertura da embalagem: III. Homogeneizar bem a amostra IV. Antes de abrir as embalagens, deve-se desinfetar a área externa com álcool a 70% . Flambar a tesoura que vai se utilizada para cotar a ponta da embalagem. V. Pipetar 9 mL do liquido de diluição em frascos de diluição VI. Preparar diluições 1/10; 1/100; 1/1000 e 1/10.000. VII. Trabalhe sempre junto a chama do bico de Bunsen e não esquecer de agitar e flambar os tubos antes de pipetar. 2 Determinação das Bactérias do Grupo Coliformes Meios de cultura utilizados: Verde Bili Brilhante 2%; (CLVBB); Caldo EC e Eosina Azul de Metileno I. Organize seu material de trabalho. Identifique os tubos segundo o esquema Amostra: Diluição: Data:
  58. 58. 58 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com II. Organize em uma estante 3 séries de 3 tubos cada um contendo o meio de cultura Verde Bili Brilhante 2%; (CLVBB); III. Inocule: 1 mL da amostra na primeira serie. Agite 1 mL da diluição 1/10 na primeira serie. Agite 1mL da diluição 1/100 na segunda serie. Agite IV. Incube a 35ºC por 24 horas. 3 Contagem total de bactérias aeróbios mesofilos I. Selecionar 3 diluições adequadas da amostra e inocular 1,0 mL de cada diluição em placas de Petri estéreis e vazias, abrindo as placas apenas o suficiente para inserir a pipeta, próximo ao bico de Busen. Nota 1: Depositar o inóculo fora do centro da placa, pois isso facilitará a posterior mistura com o meio de cultura. II. Verter nas placas inoculadas, 15 a 20 mL de Agar Padrão para Contagem (APC), previamente fundido e resfriado a 45C. Misturar o inoculo com o meio de cultura movimentando suavemente as placas, numa superfície plana, em movimentos em forma de oito e/ou em movimentos circulares, 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 vezes no sentido anti horário Nota 2: O meio de cultura deve ser resfriado em água corrente a 45ºC, secar o frasco, para evitar respingos de água nas placas, no memento do plaqueamento. Evitar agitação com movimentos bruscos para que não haja formação de bolhas no meio. Nota 3: A mistura do meio com o inoculo deve ser feita imediatamente após a adição do meio, para não haver risco de solidificação do agar. A movimentação das placas deve se feita cuidadosamente, para evitar respigos de mio nas bordas ou nas tampas das placas. III. Aguardar a completa solidificação do meio de cultura, nas placas. Após solidificação inverter as placas e incubar a 35ºC por 48 horas.
  59. 59. 59 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com 2º DIA DE TRABALHO 1 Determinação das Bactérias do Grupo Coliformes I. Após as 24 horas separe os tubos positivos (aparecimento de turbidez e/ou gás nos tubos de Duhan). Fazer leitura na tabela do NMP. Descarte os tubos negativos. Você tem os resultados para coliformes a 35ºC. II. Identificar os tubos com caldo EC, contendo tubos de Duhan invertido, correspondente respectivamente a cada tubo de CLVBB com resultado positivo. III. Agitar bem o tubo de CLVBB com resultado positivo e, com uma haste de madeira ou alça de platina, repicar o material e inocular no tubo correspondente de caldo EC. Agitar IV. Incubar os tubos de caldo EC inoculados, durante 24 horas a 44,5ºC V. Proceder à leitura após o tempo de incubação, considerando como teste confirmativo para coliformes a 45ºC todos os tubos que apresentarem gás nos tubos de Duhan invertido com ou sem turbidez. Anotar os resultados e verificar o NMP de coliformes a 45ºC na tabela em anexo, 2 Contagem total de bactérias aeróbios mesofilos I. Contar as colônias com auxilio de uma lupa, em um contador de colônias. Calcular o número de unidades formados de colônias (UFC) por mL da amostra multiplicando o numero de colônias pelo inverso da diluição inoculada. Usar notação exponencial e apenas uma casa decimal depois da vírgula na apresentação dos resultados.
  60. 60. 60 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com
  61. 61. 61 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com AVALIAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLOGICA DOS ALIMENTOS A qualidade global de um alimento é determinada por diversos parâmetros físico, químico, nutricional, organoléptico e microbiológico. O exame microbiológico de um alimento nos fornecerá informações sobre a qualidade da matéria prima utilizada, sanitização da manipulação e, ao longo do processamento, adequação das técnicas utilizadas na preservação do produto e a eficiência das operações de transporte e armazenamento do produto final. Nestas condições, em função da avaliação microbiológica do produto, será possível uma estimativa da sua vida útil ou sua vida de prateleira, bem como, pela pesquisa de patógenos ou indicadores de poluição fecal, será evidenciado os riscos à saúde publica proveniente de seu consumo. No caso de contaminações e as condições que permitam a ocorrência da deterioração. PADRÕES MICROBIOLÓGICOS Os padrões microbiológicos estabelecem os limites máximos toleráveis de contaminação de um grupo ou espécie de microrganismo para cada tipo de alimento. Esses limites são determinados por metodologias estipuladas, visando proteger a saúde publica e/ou o alimento contra deterioração (aumentando seu tempo de prateleira). Os padrões têm caráter legal podendo ser federal, estadual ou municipal. INDICADORES DE CONDIÇÕES HIGIENICAS DO ALIMENTO As contagens refletem a contaminação ambiental do próprio alimento, bem como as condições de higiene e cuidados durante a produção, são eles: a) Contagem padrão em placas (CPP) – também chamada de contagem total de mesofilos (20 e 37º) ou de psicrotróficos (5 a 10ºC). Essa contagem traduz o somatório de uma serie de fatores: grau de contaminação das matérias primas usadas; higiene ambiental; cuidados no processamento para evitar multiplicação; eficiência de tratamentos utilizados
  62. 62. 62 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com para redução de contagem. Uma CPP acima do normal pode significar um menor tempo de prateleira. A contagem de psicrotróficos é mais adequada para produtos mantidos sob refrigeração. É utilizada quando as bactérias são os principais agentes de deterioração, como nos casos de produtos de origem animal ( leite e derivados, carnes e derivados, etc). b) Contagem de bolores e leveduras – essas contagens representam a somatória desses dois grupos e tem a mesma finalidade da CPP nos alimentos em que eles constituem os principais deteriorantes. É usada para frutas, sucos; doces; farinhas e para alguns produtos de origem animal para os quais os grupos são importantes (Ex. iogurtes). c) Coliformes a 35ºC– contagem usada para certos alimentos, tais como leites pasteurizados, sucos, etc, para indicar as condições higiênicas em que foram produzidos. d) Indicadores de contaminação fecal – grupo de bactérias pertencentes ao grupo coliformes, utilizam a lactose a 44,5ºC com produção de gás. Os microrganismos mais importantes desse grupo é a Escherichia coli, fazendo parte exclusiva do intestino do homem e animais de sangue quente. Indicam uma possível presença de microrganismos patogênicos. São também denominadas de coliformes termotolerantes ou coliformes a 45ºC. Como são expelidas em grandes quantidades nas fezes ( > 106 por gramas) e por terem resistência semelhante aos patógenos entéricos, sua presença indica que houve contaminação fecal no alimento, e que, por isso, existe a possibilidade de haver patógenos, como Salmonella. As fontes dessa contaminação podem ser: mãos, matéria prima, contaminação cruzada, insetos, utensílios e equipamentos contaminados. Existem outros microrganismos que não fazem parte de padrões microbiológicos e podem ser pesquisados em caso de surtos Em alimentos manipulados realiza-se também análises de Salmonella sp e Staphylococcus aureus.
  63. 63. 63 Prof.a Dra. Eliane Rolim Florentino – elianerf@yahoo.com.br Profa Dra. Isanna Menezes Florêncio – isannamenezes@hotmail.com Remoção de sujidades ou resíduos Lavar com água e detergente neutro, com auxílio de escovas ou esponjas. Utilizar solução sanificante (Ex: Solução clorada (100-200 ppm) ou álcool 70% ou Quaternário de amônio) Elimina ou reduz microrganismos patogênicos, sem risco à saúde. Lavagem + Sanificação

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