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ISSN 2318-4752 – Volume 7, N1, 2019
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TESTE DE ANTAGONISMO IN VIVO DE UM Lactobacillus reuteri COM POTENCIAL
PARA USO PROBIÓTICO ISOLADO DE SUÍNO ADULTO FRENTE À Salmonella
enterica sorovar Typhimurium EM CAMUNDONGOS GNOTOXÊNICOS (GN)
IN VIVO ANTAGONISM TEST OF A Lactobacillus reuteri WITH POTENTIAL FOR PROBIOTIC USE
ISOLATED FROM ADULT SWINE AGAINST Salmonella enterica serovar Typhimurium IN
GNOTOXENIC (GN) MICE
FLÁVIO HENRIQUE FERREIRA BARBOSA1; FELIPE HENRIQUE SILVA BAMBIRRA2; LEANDRO
HENRIQUE SILVA BAMBIRRA3; RUBENS ALEX DE OLIVEIRA MENEZES4
RESUMO
A produção de alimentos saudáveis e nutritivos em grande quantidade tem se tornado um desafio para todos os profissionais
que trabalham com toda a cadeia produtiva alimentícia. A produção mundial de suínos cresceu e o Brasil teve um aumento
significativo nas exportações de carne suína. Para que a atividade de criação de suínos se mantenha produtiva, com a geração
de lucros, promotores de crescimento têm sido incorporados às rações, com objetivo de melhorar o processo digestivo e o
desempenho zootécnico dos animais, resultando em maior ganho de peso e redução do número de doenças. Entretanto, nos
últimos anos tem aumentado a conscientização sobre o uso excessivo destes produtos, bem como se tornado evidente os
possíveis transtornos à saúde destes animais e do homem, como consequências desta suplementação. As alternativas
disponíveis para substituição dos antimicrobianos na suinocultura incluem a utilização de probióticos, prebióticos, simbióticos e
agentes fitoterápicos. Seguindo esta linha de raciocínio, este trabalho se propôs a realizar um teste de antagonismo in vivo de
um Lactobacillus reuteri com potencial para uso probiótico isolado de suíno adulto frente à Salmonella enterica sorovar
Typhimurium em camundongos gnotoxênicos (GN). Conclui-se, até este momento, que este microrganismo possui capacidade
de colonização do trato gastrointestinal de camundongos gnotobióticos e que alcança níveis adequados à proteção nas diversas
porções estudadas. No experimento in vivo, não foi visualizado o efetivo antagonismo bacteriano, denominado de efeito barreira
do probiótico testado contra o patógeno em camundongos gnotobióticos, levando a drástica redução do microrganismo maléfico.
Neste caso, foi observada uma ligeira, porém visível, melhora dos animais do grupo experimental em relação aos animais do
grupo controle, mostrando então, a possível atuação de modo benéfico do microrganismo no trato gastrintestinal. Porém, para
que tal probiótico possa vir a ser aprovado, são necessários outros ensaios demonstrando outros efeitos protetivos, além de uma
avaliação de seu impacto no crescimento e ganho de peso dos animais.
PALAVRAS-CHAVE: Lactobacillus, suínos, probiótico, antagonismo.
ABSTRACT
The production of healthy and nutritious food in large quantities has become a challenge for all professionals who work with the
entire food production chain. World swine production grew and Brazil saw a significant increase in exports. In order for the pig
breeding activity to remain productive, with the generation of profits, growth promoters have been incorporated into the rations,
with the objective of improving the digestive process and the zootechnical performance of the animals, resulting in greater weight
gain and reduced number of diseases. However, in recent years there has been an increase in awareness about the excessive
use of these products, as well as the possible health disorders of these animals and man, as consequences of this
supplementation, have become evident. The alternatives available to replace antimicrobials in pig farming include the use of
probiotics, prebiotics, symbiotics and herbal agents. Following this line of reasoning, this work proposed to perform an in vivo
antagonism test of a Lactobacillus reuteri with potential for probiotic use isolated from adult swine against Salmonella enterica
serovar Typhimurium in gnotoxenic (GN) mice. It is concluded, until now, that this microorganism has the capacity to colonize the
gastrointestinal tract of gnotobiotic mice and that it reaches levels adequate for protection in the various portions studied. In the
in vivo experiment, the effective bacterial antagonism, called the barrier effect of the probiotic tested against the pathogen in
gnotobiotic mice, was not visualized, leading to a drastic reduction of the harmful microorganism. In this case, a slight, but visible,
improvement was observed in the animals in the experimental group in relation to the animals in the control group, thus showing
the possible beneficial action of the microorganism in the gastrointestinal tract. However, for such a probiotic to be approved,
further tests are required demonstrating other protective effects, in addition to an assessment of its impact on the growth and
weight gain of the animals.
KEYWORDS: Lactobacillus, swine, probiotic, antagonism.
ISSN 2318-4752 – Volume 7, N1, 2019
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INTRODUÇÃO
A produção de alimentos saudáveis e
nutritivos em grande quantidade tem se
tornado um desafio para todos os profissionais
que trabalham com toda a cadeia produtiva
alimentícia. Estimativas indicam que o
suprimento de alimentos necessários para
atender aos requerimentos nutricionais da
população humana durante os próximos
quarenta anos equivale à quantidade
previamente produzida ao longo de toda a
história. Para atender a esta grande demanda
de alimentos de origem animal, os
pesquisadores têm se esforçado na busca de
novas tecnologias a fim de aumentar a
eficiência e a produtividade dos animais de
criação.
A suinocultura é um dos setores
agropecuários que mais tem crescido nas
últimas décadas. Segundo dados da
EMBRAPA, a produção de carne suína no
Brasil vem crescendo mais 5% ao ano desde
o ano de 2006. A produção mundial de suínos
cresceu sistematicamente nos últimos 30
anos e o Brasil teve um aumento significativo
nas exportações de carne suína, chegando à
quarta colocação mundial e, atualmente, esse
produto pode ser encontrado até na Rússia. A
este fato, associa-se um marcante aumento
no comércio e consumo de carne de suínos
em todo o mundo, sendo que sua produção
está rapidamente se expandindo em muitos
países em desenvolvimento, como o Brasil, o
que faz aumentar o rigor no manejo dos
animais e na produção da carne.
Para que a atividade de criação de
suínos se mantenha produtiva, com a geração
de lucros, muitos aditivos (incluindo
promotores de crescimento, como drogas
antimicrobianas) têm sido incorporados às
rações, com objetivo de melhorar o processo
digestivo e o desempenho zootécnico dos
animais, resultando em maior ganho de peso
e redução do número de doenças. Entretanto,
nos últimos anos tem aumentado a
conscientização sobre o uso excessivo destes
produtos, bem como se tornado evidente os
possíveis transtornos à saúde destes animais
e do homem, como consequências desta
suplementação (FULLER, 1989, 1992;
FULLER & COLE, 1988; SALMINEN, 1998;
TANNOCK, 1986, 1990, 1995 e 2003).
Os antimicrobianos promotores de
crescimento podem alterar a microbiota do
trato digestivo e deprimir os mecanismos de
defesa dos animais, além de deixar resíduos
indesejáveis à saúde do homem na carne.
Além disso, a presença de concentrações
baixas de antimicrobianos pode ser
responsável pelo aumento dos fenômenos de
resistência bacteriana aos mesmos.
Recentemente, novos microrganismos
resistentes a uma ou várias drogas
antimicrobianas têm surgido e sido motivo de
preocupação para a saúde pública mundial.
Estes microrganismos modificados podem se
difundir pelo meio ambiente e estarem
presentes na carne dos animais.
Por causa destas evidências, a
ausência de microrganismos potencialmente
patogênicos e a ausência de resíduos de
produtos químicos têm se tornado os
principais indicadores de qualidade da carne
de suínos, bem como de outros alimentos.
Assim, a suinocultura brasileira precisará se
adaptar às futuras normas de comércio
internacional, pois alguns países
importadores, principalmente da União
Europeia, não mais aceitarão adquirir carne
de suínos oriunda de produtores que utilizam
antimicrobianos para aumentar os índices de
produtividade de seus plantéis (FULLER,
1989, 1992; FULLER & COLE, 1988;
SALMINEN, 1998; TANNOCK, 1986, 1990,
1995 e 2003).
Assim, tem gerado a necessidade de se
buscar alternativas que possam promover os
mesmos efeitos de produtividade
relacionados ao uso dos aditivos alimentares,
porém, sem causar as mesmas
consequências indesejáveis destes. Além
disto, ainda existem prejuízos relacionados ao
impacto econômico da retirada destas drogas
antimicrobianas da alimentação de suínos.
Isto representa aumento nos custos de
produção, sendo, principalmente, causados
por aumento no consumo de ração e no
período de ocupação dos galpões, menos
ciclos produtivos por ano, além de mais gastos
com a mão-de-obra.
ISSN 2318-4752 – Volume 7, N1, 2019
3
As alternativas disponíveis para
substituição dos antimicrobianos na
suinocultura incluem a utilização de
probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes
fitoterápicos. Dentre estas, a utilização dos
microrganismos probióticos constitui uma
perspectiva extremamente interessante, pois
as próprias bactérias benéficas da microbiota
intestinal dos animais poderiam ser
empregadas em substituição aos
antimicrobianos. Nestes casos, estes
microrganismos poderiam favorecer o
equilíbrio do ecossistema gastrintestinal, o
que seria refletido em melhoria da saúde e
boa produtividade. Trabalhos científicos têm
sido conduzidos tentando avaliar a eficiência
da utilização dos probióticos, em substituição
aos produtos químicos, para modular a saúde
de suínos comerciais e proporcionar um
ganho de peso adequado. Bactérias do
gênero Lactobacillus são os principais
microrganismos desejáveis encontrados em
grandes quantidades por todo o trato
gastrintestinal (TGI) de suínos, mostrando ser
fortes candidatas como probióticos para estes
animais (FULLER, 1989, 1992; FULLER &
COLE, 1988; SALMINEN, 1998; TANNOCK,
1986, 1990, 1995 e 2003).
Seguindo esta linha de raciocínio, este
trabalho se propôs a realizar um teste de
antagonismo in vivo de um Lactobacillus
reuteri com potencial para uso probiótico
isolado de suíno adulto frente à Salmonella
enterica sorovar Typhimurium em
camundongos gnotoxênicos (GN).
MATERIAL E MÉTODOS
1. Microrganismos
Características Morfo-tintoriais,
Bioquímicas e Fisiológicas dos
Microrganismos Isolados
Numa placa contendo em torno de 100
unidades formadoras de colônia (UFC), as
colônias morfologicamente diferentes e mais
significativas do ponto de vista populacional
foram repicadas, a partir do ágar MRS (Difco),
no mesmo meio. A partir de colônias, de cada
amostra, que apresentaram aspectos
morfológicos distintos foram feitos esfregaços
em lâminas para coloração pelo método de
Gram. Além disto, a partir dessas mesmas
colônias foram feitos testes de catalase em
lâmina, utilizando-se H2O2 (30%). Aqueles
que se apresentaram como Gram-positivo e
catalase negativa, sugestivos de pertencerem
ao gênero Lactobacillus, foram submetidos à
identificação, utilizando técnicas de biologia
molecular (PCR-ARDRA).
Purificação e Manutenção dos
Microrganismos Isolados
Os microrganismos isolados e
avaliados pelas características morfo-
tintoriais, bioquímicas e fisiológicas e pelo
teste respiratório foram inoculados em 5 mL
de caldo MRS (Difco), sendo em seguida
incubados em anaerobiose, à 37ºC durante 48
horas. Após o crescimento, uma alíquota de
500 µL de cada tubo foi transferida para tubo
eppendorf e adicionada de glicerol esterilizado
(50 µL), sendo, em seguida, congelados a -
18ºC e -86ºC, para posterior utilização,
quando necessário. O restante dos cultivos foi
destinado às análises baseadas em técnicas
de biologia molecular, com a finalidade de
identificação das espécies isoladas.
Ativação das culturas
Amostras de Lactobacillus spp.
isoladas a partir do TGI dos suínos (Sus scrofa
domesticus), oriundos de criação intensiva, e
pré-identificadas pelo perfil de fermentação de
carboidratos (kit API 50 CHL, BioMérieux,
Marcy l’Etoile, France), foram descongeladas
e inoculadas (200 µL) em caldo MRS (Difco).
O meio foi incubado, sob condições de
anaerobiose, a 37ºC, durante 48 horas. Após
cinco passagens em caldo, 50 µL de cada
amostra foram repicados em ágar MRS
(Difco), por três métodos diferentes: pour-
plate, espalhamento com auxílio da alça de
Drigalski e estria. Então, as placas foram
incubadas em anaerobiose, sendo mantidas a
37ºC, durante 48 horas.
Para a realização do teste a seguir, foi
escolhido o microrganismo entre o grupo de
ISSN 2318-4752 – Volume 7, N1, 2019
4
doze os quais apresentaram crescimento
satisfatório em aerobiose dos trinta e um
isolados e identificados como Lactobacillus,
sendo três originados de animais recém-
desmamados (21 dias) e três originados de
animais jovens/terminados (140 dias). Sendo
assim, a amostra L. reuteri - 11 A, foi a
escolhida para a realização dos testes in vivo,
tanto em camundongos por apresentar as
seguintes características relacionadas nos
itens abaixo:
- Apresentar menor sensibilidade ao
cultivo em vinhoto, conseguindo manter-se
viável e em concentrações mais elevadas por
maior tempo.
- Quando foi verificado o seu
crescimento, este microrganismo se
apresentou com boa capacidade de
multiplicação no vinhoto, destacando a
necessidade do incremento de nutrientes para
potencializar este resultado.
- Nas avaliações de adesão da
superfície celular o microrganismo
demonstrou possuir maiores probabilidades
de se fixar ao epitélio intestinal e maior
resistência à acidez.
- Em relação ao antagonismo in vitro, o
mesmo demonstrou-se eficaz contra os
microrganismos reveladores, tanto patógenos
como contra espécie relacionada
(Lactobacillus acidophilus), sugerindo a
produção de substâncias antagonista além do
antagonismo proveniente da produção de
ácidos.
- Mostrou-se bom colonizador do TGI
de camundongos, sendo que a colonização se
manteve estável por todo o período analisado.
- Não altera a estrutura histológica dos
órgãos analisados em camundongos, com os
mesmos se apresentando com aspectos
normais e se mostrando mais efetivo em
melhorar a lesão das vísceras (baço e fígado)
e de porções do trato digestivo (cólon, ceco e
íleo) induzida pela infecção.
Conclui-se, até este momento, que este
microrganismo poderia ser utilizado para a
elaboração de probiótico para suínos, visando
substituir, mesmo que parcialmente, os
promotores de crescimento antimicrobianos,
atualmente empregados nesta atividade
produtiva. Porém, para que tal probiótico
possa vir a ser aprovado, são necessários
ensaios demonstrando seus efeitos in vivo,
além de uma avaliação de seu impacto no
crescimento e ganho de peso dos suínos.
2. Animais
Animais Isentos de Germes (IG)
Foram usados camundongos isentos
de germes (NIH) de 21 dias de idade, de
ambos os sexos, derivados de um núcleo de
reprodução de camundongos provenientes da
Taconic Farms (Germantown, USA),
propagados no biotério de Gnotobiologia do
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG,
mantidos em isoladores flexíveis do tipo
Trexler (Standard Safety Equipment
Company, McHenry, USA) e manuseados de
acordo com técnicas já estabelecidas
(PLEASANTS, 1974) e adaptadas às nossas
condições (SILVA, 1986). Para os
experimentos, os animais foram mantidos em
microisoladores (UNO Roestvaststaal BV,
Zevenaar, Netherland) e receberam “ad
libitum”, ração “Nuvilab” comercializada pela
Nuvital (Curitiba, PR) e água esterilizados por
calor úmido.
Manejo dos Animais
A manutenção, e o manejo dos animais
nos experimentos foram conduzidos
respeitando-se o “Guide for the care and use
of laboratory animals” – National Research
Concil, Institute of Laboratory Animal
Resources, Washington, D.C., National
Academy Press, 1996.
3. Teste de Antagonismo in vivo
Tratamento e Desafio dos Animais
Quando tratado com a bactéria láctica
(Lactobacillus reuteri) (grupo experimental),
os camundongos dos grupos IG receberam
um inóculo único de 108 células (0,1 mL de
uma cultura contendo 109 UFC/mL),
ressuspensas no vinhoto, por inoculação
intragástrica, dez dias antes do desafio com a
ISSN 2318-4752 – Volume 7, N1, 2019
5
bactéria patogênica. Os animais IG dos
grupos controle receberam inóculos de
vinhoto de acordo com o esquema descrito
para os respectivos grupos experimentais,
conforme descrito por Rodrigues et al. (1996).
Após o desafio com a bactéria patogênica, os
animais GN do grupo experimental não iriam
receber mais inóculos, pois se esperava,
neste caso, que viesse a ocorrer colonização
microbiana do TGI devida à ausência de
competição.
Desafio
A linhagem de Salmonella enterica
subsp. enterica sorov. Typhimurium de origem
humana utilizada nos experimentos pertence
ao Laboratório de Ecologia e Fisiologia de
Microrganismos do Departamento de
Microbiologia do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas
Gerais, Belo Horizonte, MG.
A linhagem bacteriana (S.
Typhimurium) foi conservada em 0,2 mL de
glicerina, esterilizada por calor seco, com 1
mL da cultura de 18 horas crescida em caldo
BHI (Brain Heart Infusion, Difco, Detroit, USA)
a 37ºC. Todas as amostras foram estocadas
em tubos criogênicos de 2 mL a -86ºC. Os
inóculos da Salmonella Typhimurium foram
preparados a partir da seleção de uma colônia
lisa crescida em ágar MacConkey (Difco,
Detroit, USA) e posteriormente repicada para
caldo BHI e mantida, a 37ºC, por 18-24 horas.
A cultura pura foi submetida a diluições
sucessivas em salina tamponada esterilizada,
para obtenção da concentração de células
desejada. A confirmação da viabilidade do
inóculo e as contagens bacterianas foram
feitas em ágar MacConkey após 24 horas de
incubação a 37ºC. Os camundongos GN
(controle e experimental) receberam inóculos
de 0,1 mL, contendo 102 UFC, por via oral
através de uma agulha de inoculação
intragástrica em dia pré-estabelecido.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Quando tratados com a bactéria láctica
L. reuteri – 11 A, os camundongos dos grupos
IG receberam um inóculo único de 108 células
(0,1 mL de uma cultura contendo 109
UFC/mL), por inoculação intra-gástrica, dez
dias antes do desafio com a bactéria
patogênica, conforme descrito por Rodrigues
et al. (1996). A linhagem de Salmonella
enterica sorov. Typhimurium, utilizada como
desafio para os camundongos GN (controle e
experimental) foi fornecida em inóculos de 0,1
mL, contendo 102 UFC, por via oral através de
uma agulha de inoculação intra-gástrica em
dia pré-estabelecido.
Neste experimento, em 10 dias de
monoassociação com o L. reuteri – 11 A,
observou-se o mesmo resultado do
experimento de colonização do TGI e do
experimento ex vivo, com a linhagem
instalando-se em altos níveis no trato
digestivo dos animais gnotobióticos e mais
uma vez, destacando-se a capacidade de
sobreviver à passagem através do trato
gastrointestinal (Figuras 1 e 2).
Diferentemente do que foi mencionado
para os experimentos in vitro e ex vivo, a
atividade antagonista nesta etapa não foi
observada. Dentre estas formas de inibição
esperada para este teste, a produção de ácido
láctico talvez fosse a mais importante no caso
do microrganismo estudado neste ensaio,
pois a bactéria avaliada é produtora deste
ácido. Dessa forma, quando ácido láctico e
outros ácidos são produzidos por este
microrganismo, eles alteram o metabolismo
das bactérias sensíveis, causando um efeito
bacteriostático ou bactericida (SALMINEM,
1998).
No experimento in vivo, não foi
visualizado, como demonstrado em outros
trabalhos (NICOLI & RAIBAUD, 1990;
RAMARE et al., 1993), o efetivo antagonismo
bacteriano, denominado de efeito barreira do
probiótico testado contra o patógeno em
camundongos gnotobióticos, levando a
drástica redução do microrganismo maléfico.
Neste caso, foi observada uma ligeira, porém
visível, melhora dos animais do grupo
experimental em relação aos animais do
grupo controle, mostrando então, a possível
atuação de modo benéfico do microrganismo
no trato gastrintestinal seja quanto à produção
de substâncias inibitórias já citadas, ou a
ISSN 2318-4752 – Volume 7, N1, 2019
6
outros fatores como competição por sítios de
adesão para a eliminação ou controle do alvo
patogênico. Após este período os animais
foram sacrificados.
Alguns autores também sugerem que
microrganismos exercem sua atividade
antagonista in vivo através da produção de
bacteriocina. Isto lhes confere uma habilidade
ecológica para exercer um papel de
modulação do crescimento dos indivíduos que
compõem a microbiota intestinal. Desta forma,
mesmo não tendo sido observada a atividade
antagonista in vivo exercida pela linhagem de
L. reuteri estudada no presente experimento,
não está descartada a possibilidade de
pesquisas visando à comprovação da
produção de bacteriocina.
Figura 1. Níveis populacionais de Salmonella
Typhimurium detectados nas fezes de camundongos
gnotobióticos. Foram realizadas colheitas de fezes para
análises nos dias 1, 2, 5, 6, 8, 10 e 11.
Figura 2. Níveis populacionais de Lactobacillus reuteri
- 11 A e Salmonella Typhimurium detectados nas fezes
de camundongos gnotobióticos. Foram realizadas
colheitas de fezes para análises nos dias 1, 2, 5, 6, 8,
10 e 11. Os animais receberam S. Typhimurium
(desafio) no dia 5 após a monoassociação com o L.
reuteri - 11 A.
CONCLUSÃO
Conclui-se, até este momento, que este
microrganismo possui capacidade de
colonização do trato gastrointestinal de
camundongos gnotobióticos e que alcança
níveis adequados à proteção nas diversas
porções estudadas. No experimento in vivo,
não foi visualizado o efetivo antagonismo
bacteriano, denominado de efeito barreira do
probiótico testado contra o patógeno em
camundongos gnotobióticos, levando a
drástica redução do microrganismo maléfico.
Neste caso, foi observada uma ligeira, porém
visível, melhora dos animais do grupo
experimental em relação aos animais do
grupo controle, mostrando então, a possível
atuação de modo benéfico do microrganismo
no trato gastrintestinal. Porém, para que tal
probiótico possa vir a ser aprovado, são
necessários outros ensaios demonstrando
outros efeitos protetivos, além de uma
avaliação de seu impacto no crescimento e
ganho de peso dos animais.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Appl. Bacteriol., v. 66, p. 365-378, 1989.
FULLER, R. Probiotics. The scientific basis,
London: Chapman & Hall, 328 p., 1992.
FULLER, R.; COLE, C.B. The Scientific Basic
of the Probiotic Concept. In: Probiotic: Theory
and Applications. Marlows: Chalcombe
Publications, p. 1-14, 1988.
NICOLI, J.R.; RAIBAUD, P. In vivo and in vitro
antagonistic effect against Clostridium
perfringens of a diffusible compound produced
by a Peptostreptococcus sp from human
intestinal flora in mice. Microecol. Therap., v.
20, p. 141-146, 1990.
PLEASANTS, J.R. Gnotobiotics. In: Melby Jr.,
E.C., Altmann, N.H. Handbook of Laboratory
ISSN 2318-4752 – Volume 7, N1, 2019
7
Animal Science, Cleveland: CRC Press, p.
119-174, 1974.
RAMARE, F.; NICOLI, J.; DABARD, J.;
CORRING, T.; LADIRE, M.; GUEUGNEAU,
A.; RAIBAUD, P. Trypsin-dependent
production of an antibacterial substance by a
human Peptostreptococcus strain in
gnotobiotic rats and in vitro. Appl. Environ.
Microbiol., v. 59, p. 2876-2883, 1993.
RODRIGUES, A.C.; NARDI, R.M.;
BAMBIRRA, E.A.; VIEIRA, E.C.; NICOLI, J.R.
Effect of Saccharomyces boulardii against
experimental oral infection with Salmonella
typhimurium and Shigella flexneri in
conventional and gnotobiotic mice. J. Appl.
Bacteriol., v. 81, p. 251-256, 1996.
SALMINEN, S. Clinical applications of
probiotic bacteria. Int. Dairy J., v. 8, p. 563-
572, 1998.
SILVA, M.E. Modelos experimentais para o
estudo de doença de Chagas, camundongos
e ratos isentos de germes e convencionais,
Belo Horizonte: Universidade Federal de
Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas,
1986, Dissertação (Mestrado).
TANNOCK, G.W. Microbial interactions and
influences in gastrointestinal tract. Lactobacilli
and the gastrointestinal tract. Proc. IV ISME,
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TANNOCK, G. W. More than a smell: the
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TANNOCK, G. W. (Ed.). Normal Microflora. An
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TANNOCK, G.W. Probiotics and prebiotics:
where we are going? Wymondham: Caister
Academic Press. 54 p., 2003.
TANNOCK, G.W.; FULLER, R.; PEDERSEN,
K. Lactobacillus succession in the piglet
digestive tract demonstrated by plasma
profiling. Appl. and Environ. Microbiol., v. 56,
p. 1310-1316, 1990.
____________________________________
1 - Graduação em Ciências Biológicas.
Professor Adjunto do Departamento de
Morfologia (DMO – CCBS) da Universidade
Federal de Sergipe - UFS, Brasil.
E-mail: flaviobarbosaufs@gmail.com
2 - Graduação em Fisioterapia. Mestrado em
Microbiogia. Departamento de Microbiologia
(ICB) da Universidade Federal de Minas
Gerais - UFMG, Brasil.
3 - Graduação em Medicina Veterinária.
Departamento de Microbiologia (ICB) da
Universidade Federal de Minas Gerais -
UFMG, Brasil.
4 - Graduação em Enfermagem. Professor
Adjunto do Curso de Enfermagem da
Universidade Federal do Amapá (UNIFAP),
Brasil.

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Artigo abmba v7_n1_2019_01

  • 1. ISSN 2318-4752 – Volume 7, N1, 2019 1 TESTE DE ANTAGONISMO IN VIVO DE UM Lactobacillus reuteri COM POTENCIAL PARA USO PROBIÓTICO ISOLADO DE SUÍNO ADULTO FRENTE À Salmonella enterica sorovar Typhimurium EM CAMUNDONGOS GNOTOXÊNICOS (GN) IN VIVO ANTAGONISM TEST OF A Lactobacillus reuteri WITH POTENTIAL FOR PROBIOTIC USE ISOLATED FROM ADULT SWINE AGAINST Salmonella enterica serovar Typhimurium IN GNOTOXENIC (GN) MICE FLÁVIO HENRIQUE FERREIRA BARBOSA1; FELIPE HENRIQUE SILVA BAMBIRRA2; LEANDRO HENRIQUE SILVA BAMBIRRA3; RUBENS ALEX DE OLIVEIRA MENEZES4 RESUMO A produção de alimentos saudáveis e nutritivos em grande quantidade tem se tornado um desafio para todos os profissionais que trabalham com toda a cadeia produtiva alimentícia. A produção mundial de suínos cresceu e o Brasil teve um aumento significativo nas exportações de carne suína. Para que a atividade de criação de suínos se mantenha produtiva, com a geração de lucros, promotores de crescimento têm sido incorporados às rações, com objetivo de melhorar o processo digestivo e o desempenho zootécnico dos animais, resultando em maior ganho de peso e redução do número de doenças. Entretanto, nos últimos anos tem aumentado a conscientização sobre o uso excessivo destes produtos, bem como se tornado evidente os possíveis transtornos à saúde destes animais e do homem, como consequências desta suplementação. As alternativas disponíveis para substituição dos antimicrobianos na suinocultura incluem a utilização de probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes fitoterápicos. Seguindo esta linha de raciocínio, este trabalho se propôs a realizar um teste de antagonismo in vivo de um Lactobacillus reuteri com potencial para uso probiótico isolado de suíno adulto frente à Salmonella enterica sorovar Typhimurium em camundongos gnotoxênicos (GN). Conclui-se, até este momento, que este microrganismo possui capacidade de colonização do trato gastrointestinal de camundongos gnotobióticos e que alcança níveis adequados à proteção nas diversas porções estudadas. No experimento in vivo, não foi visualizado o efetivo antagonismo bacteriano, denominado de efeito barreira do probiótico testado contra o patógeno em camundongos gnotobióticos, levando a drástica redução do microrganismo maléfico. Neste caso, foi observada uma ligeira, porém visível, melhora dos animais do grupo experimental em relação aos animais do grupo controle, mostrando então, a possível atuação de modo benéfico do microrganismo no trato gastrintestinal. Porém, para que tal probiótico possa vir a ser aprovado, são necessários outros ensaios demonstrando outros efeitos protetivos, além de uma avaliação de seu impacto no crescimento e ganho de peso dos animais. PALAVRAS-CHAVE: Lactobacillus, suínos, probiótico, antagonismo. ABSTRACT The production of healthy and nutritious food in large quantities has become a challenge for all professionals who work with the entire food production chain. World swine production grew and Brazil saw a significant increase in exports. In order for the pig breeding activity to remain productive, with the generation of profits, growth promoters have been incorporated into the rations, with the objective of improving the digestive process and the zootechnical performance of the animals, resulting in greater weight gain and reduced number of diseases. However, in recent years there has been an increase in awareness about the excessive use of these products, as well as the possible health disorders of these animals and man, as consequences of this supplementation, have become evident. The alternatives available to replace antimicrobials in pig farming include the use of probiotics, prebiotics, symbiotics and herbal agents. Following this line of reasoning, this work proposed to perform an in vivo antagonism test of a Lactobacillus reuteri with potential for probiotic use isolated from adult swine against Salmonella enterica serovar Typhimurium in gnotoxenic (GN) mice. It is concluded, until now, that this microorganism has the capacity to colonize the gastrointestinal tract of gnotobiotic mice and that it reaches levels adequate for protection in the various portions studied. In the in vivo experiment, the effective bacterial antagonism, called the barrier effect of the probiotic tested against the pathogen in gnotobiotic mice, was not visualized, leading to a drastic reduction of the harmful microorganism. In this case, a slight, but visible, improvement was observed in the animals in the experimental group in relation to the animals in the control group, thus showing the possible beneficial action of the microorganism in the gastrointestinal tract. However, for such a probiotic to be approved, further tests are required demonstrating other protective effects, in addition to an assessment of its impact on the growth and weight gain of the animals. KEYWORDS: Lactobacillus, swine, probiotic, antagonism.
  • 2. ISSN 2318-4752 – Volume 7, N1, 2019 2 INTRODUÇÃO A produção de alimentos saudáveis e nutritivos em grande quantidade tem se tornado um desafio para todos os profissionais que trabalham com toda a cadeia produtiva alimentícia. Estimativas indicam que o suprimento de alimentos necessários para atender aos requerimentos nutricionais da população humana durante os próximos quarenta anos equivale à quantidade previamente produzida ao longo de toda a história. Para atender a esta grande demanda de alimentos de origem animal, os pesquisadores têm se esforçado na busca de novas tecnologias a fim de aumentar a eficiência e a produtividade dos animais de criação. A suinocultura é um dos setores agropecuários que mais tem crescido nas últimas décadas. Segundo dados da EMBRAPA, a produção de carne suína no Brasil vem crescendo mais 5% ao ano desde o ano de 2006. A produção mundial de suínos cresceu sistematicamente nos últimos 30 anos e o Brasil teve um aumento significativo nas exportações de carne suína, chegando à quarta colocação mundial e, atualmente, esse produto pode ser encontrado até na Rússia. A este fato, associa-se um marcante aumento no comércio e consumo de carne de suínos em todo o mundo, sendo que sua produção está rapidamente se expandindo em muitos países em desenvolvimento, como o Brasil, o que faz aumentar o rigor no manejo dos animais e na produção da carne. Para que a atividade de criação de suínos se mantenha produtiva, com a geração de lucros, muitos aditivos (incluindo promotores de crescimento, como drogas antimicrobianas) têm sido incorporados às rações, com objetivo de melhorar o processo digestivo e o desempenho zootécnico dos animais, resultando em maior ganho de peso e redução do número de doenças. Entretanto, nos últimos anos tem aumentado a conscientização sobre o uso excessivo destes produtos, bem como se tornado evidente os possíveis transtornos à saúde destes animais e do homem, como consequências desta suplementação (FULLER, 1989, 1992; FULLER & COLE, 1988; SALMINEN, 1998; TANNOCK, 1986, 1990, 1995 e 2003). Os antimicrobianos promotores de crescimento podem alterar a microbiota do trato digestivo e deprimir os mecanismos de defesa dos animais, além de deixar resíduos indesejáveis à saúde do homem na carne. Além disso, a presença de concentrações baixas de antimicrobianos pode ser responsável pelo aumento dos fenômenos de resistência bacteriana aos mesmos. Recentemente, novos microrganismos resistentes a uma ou várias drogas antimicrobianas têm surgido e sido motivo de preocupação para a saúde pública mundial. Estes microrganismos modificados podem se difundir pelo meio ambiente e estarem presentes na carne dos animais. Por causa destas evidências, a ausência de microrganismos potencialmente patogênicos e a ausência de resíduos de produtos químicos têm se tornado os principais indicadores de qualidade da carne de suínos, bem como de outros alimentos. Assim, a suinocultura brasileira precisará se adaptar às futuras normas de comércio internacional, pois alguns países importadores, principalmente da União Europeia, não mais aceitarão adquirir carne de suínos oriunda de produtores que utilizam antimicrobianos para aumentar os índices de produtividade de seus plantéis (FULLER, 1989, 1992; FULLER & COLE, 1988; SALMINEN, 1998; TANNOCK, 1986, 1990, 1995 e 2003). Assim, tem gerado a necessidade de se buscar alternativas que possam promover os mesmos efeitos de produtividade relacionados ao uso dos aditivos alimentares, porém, sem causar as mesmas consequências indesejáveis destes. Além disto, ainda existem prejuízos relacionados ao impacto econômico da retirada destas drogas antimicrobianas da alimentação de suínos. Isto representa aumento nos custos de produção, sendo, principalmente, causados por aumento no consumo de ração e no período de ocupação dos galpões, menos ciclos produtivos por ano, além de mais gastos com a mão-de-obra.
  • 3. ISSN 2318-4752 – Volume 7, N1, 2019 3 As alternativas disponíveis para substituição dos antimicrobianos na suinocultura incluem a utilização de probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes fitoterápicos. Dentre estas, a utilização dos microrganismos probióticos constitui uma perspectiva extremamente interessante, pois as próprias bactérias benéficas da microbiota intestinal dos animais poderiam ser empregadas em substituição aos antimicrobianos. Nestes casos, estes microrganismos poderiam favorecer o equilíbrio do ecossistema gastrintestinal, o que seria refletido em melhoria da saúde e boa produtividade. Trabalhos científicos têm sido conduzidos tentando avaliar a eficiência da utilização dos probióticos, em substituição aos produtos químicos, para modular a saúde de suínos comerciais e proporcionar um ganho de peso adequado. Bactérias do gênero Lactobacillus são os principais microrganismos desejáveis encontrados em grandes quantidades por todo o trato gastrintestinal (TGI) de suínos, mostrando ser fortes candidatas como probióticos para estes animais (FULLER, 1989, 1992; FULLER & COLE, 1988; SALMINEN, 1998; TANNOCK, 1986, 1990, 1995 e 2003). Seguindo esta linha de raciocínio, este trabalho se propôs a realizar um teste de antagonismo in vivo de um Lactobacillus reuteri com potencial para uso probiótico isolado de suíno adulto frente à Salmonella enterica sorovar Typhimurium em camundongos gnotoxênicos (GN). MATERIAL E MÉTODOS 1. Microrganismos Características Morfo-tintoriais, Bioquímicas e Fisiológicas dos Microrganismos Isolados Numa placa contendo em torno de 100 unidades formadoras de colônia (UFC), as colônias morfologicamente diferentes e mais significativas do ponto de vista populacional foram repicadas, a partir do ágar MRS (Difco), no mesmo meio. A partir de colônias, de cada amostra, que apresentaram aspectos morfológicos distintos foram feitos esfregaços em lâminas para coloração pelo método de Gram. Além disto, a partir dessas mesmas colônias foram feitos testes de catalase em lâmina, utilizando-se H2O2 (30%). Aqueles que se apresentaram como Gram-positivo e catalase negativa, sugestivos de pertencerem ao gênero Lactobacillus, foram submetidos à identificação, utilizando técnicas de biologia molecular (PCR-ARDRA). Purificação e Manutenção dos Microrganismos Isolados Os microrganismos isolados e avaliados pelas características morfo- tintoriais, bioquímicas e fisiológicas e pelo teste respiratório foram inoculados em 5 mL de caldo MRS (Difco), sendo em seguida incubados em anaerobiose, à 37ºC durante 48 horas. Após o crescimento, uma alíquota de 500 µL de cada tubo foi transferida para tubo eppendorf e adicionada de glicerol esterilizado (50 µL), sendo, em seguida, congelados a - 18ºC e -86ºC, para posterior utilização, quando necessário. O restante dos cultivos foi destinado às análises baseadas em técnicas de biologia molecular, com a finalidade de identificação das espécies isoladas. Ativação das culturas Amostras de Lactobacillus spp. isoladas a partir do TGI dos suínos (Sus scrofa domesticus), oriundos de criação intensiva, e pré-identificadas pelo perfil de fermentação de carboidratos (kit API 50 CHL, BioMérieux, Marcy l’Etoile, France), foram descongeladas e inoculadas (200 µL) em caldo MRS (Difco). O meio foi incubado, sob condições de anaerobiose, a 37ºC, durante 48 horas. Após cinco passagens em caldo, 50 µL de cada amostra foram repicados em ágar MRS (Difco), por três métodos diferentes: pour- plate, espalhamento com auxílio da alça de Drigalski e estria. Então, as placas foram incubadas em anaerobiose, sendo mantidas a 37ºC, durante 48 horas. Para a realização do teste a seguir, foi escolhido o microrganismo entre o grupo de
  • 4. ISSN 2318-4752 – Volume 7, N1, 2019 4 doze os quais apresentaram crescimento satisfatório em aerobiose dos trinta e um isolados e identificados como Lactobacillus, sendo três originados de animais recém- desmamados (21 dias) e três originados de animais jovens/terminados (140 dias). Sendo assim, a amostra L. reuteri - 11 A, foi a escolhida para a realização dos testes in vivo, tanto em camundongos por apresentar as seguintes características relacionadas nos itens abaixo: - Apresentar menor sensibilidade ao cultivo em vinhoto, conseguindo manter-se viável e em concentrações mais elevadas por maior tempo. - Quando foi verificado o seu crescimento, este microrganismo se apresentou com boa capacidade de multiplicação no vinhoto, destacando a necessidade do incremento de nutrientes para potencializar este resultado. - Nas avaliações de adesão da superfície celular o microrganismo demonstrou possuir maiores probabilidades de se fixar ao epitélio intestinal e maior resistência à acidez. - Em relação ao antagonismo in vitro, o mesmo demonstrou-se eficaz contra os microrganismos reveladores, tanto patógenos como contra espécie relacionada (Lactobacillus acidophilus), sugerindo a produção de substâncias antagonista além do antagonismo proveniente da produção de ácidos. - Mostrou-se bom colonizador do TGI de camundongos, sendo que a colonização se manteve estável por todo o período analisado. - Não altera a estrutura histológica dos órgãos analisados em camundongos, com os mesmos se apresentando com aspectos normais e se mostrando mais efetivo em melhorar a lesão das vísceras (baço e fígado) e de porções do trato digestivo (cólon, ceco e íleo) induzida pela infecção. Conclui-se, até este momento, que este microrganismo poderia ser utilizado para a elaboração de probiótico para suínos, visando substituir, mesmo que parcialmente, os promotores de crescimento antimicrobianos, atualmente empregados nesta atividade produtiva. Porém, para que tal probiótico possa vir a ser aprovado, são necessários ensaios demonstrando seus efeitos in vivo, além de uma avaliação de seu impacto no crescimento e ganho de peso dos suínos. 2. Animais Animais Isentos de Germes (IG) Foram usados camundongos isentos de germes (NIH) de 21 dias de idade, de ambos os sexos, derivados de um núcleo de reprodução de camundongos provenientes da Taconic Farms (Germantown, USA), propagados no biotério de Gnotobiologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG, mantidos em isoladores flexíveis do tipo Trexler (Standard Safety Equipment Company, McHenry, USA) e manuseados de acordo com técnicas já estabelecidas (PLEASANTS, 1974) e adaptadas às nossas condições (SILVA, 1986). Para os experimentos, os animais foram mantidos em microisoladores (UNO Roestvaststaal BV, Zevenaar, Netherland) e receberam “ad libitum”, ração “Nuvilab” comercializada pela Nuvital (Curitiba, PR) e água esterilizados por calor úmido. Manejo dos Animais A manutenção, e o manejo dos animais nos experimentos foram conduzidos respeitando-se o “Guide for the care and use of laboratory animals” – National Research Concil, Institute of Laboratory Animal Resources, Washington, D.C., National Academy Press, 1996. 3. Teste de Antagonismo in vivo Tratamento e Desafio dos Animais Quando tratado com a bactéria láctica (Lactobacillus reuteri) (grupo experimental), os camundongos dos grupos IG receberam um inóculo único de 108 células (0,1 mL de uma cultura contendo 109 UFC/mL), ressuspensas no vinhoto, por inoculação intragástrica, dez dias antes do desafio com a
  • 5. ISSN 2318-4752 – Volume 7, N1, 2019 5 bactéria patogênica. Os animais IG dos grupos controle receberam inóculos de vinhoto de acordo com o esquema descrito para os respectivos grupos experimentais, conforme descrito por Rodrigues et al. (1996). Após o desafio com a bactéria patogênica, os animais GN do grupo experimental não iriam receber mais inóculos, pois se esperava, neste caso, que viesse a ocorrer colonização microbiana do TGI devida à ausência de competição. Desafio A linhagem de Salmonella enterica subsp. enterica sorov. Typhimurium de origem humana utilizada nos experimentos pertence ao Laboratório de Ecologia e Fisiologia de Microrganismos do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG. A linhagem bacteriana (S. Typhimurium) foi conservada em 0,2 mL de glicerina, esterilizada por calor seco, com 1 mL da cultura de 18 horas crescida em caldo BHI (Brain Heart Infusion, Difco, Detroit, USA) a 37ºC. Todas as amostras foram estocadas em tubos criogênicos de 2 mL a -86ºC. Os inóculos da Salmonella Typhimurium foram preparados a partir da seleção de uma colônia lisa crescida em ágar MacConkey (Difco, Detroit, USA) e posteriormente repicada para caldo BHI e mantida, a 37ºC, por 18-24 horas. A cultura pura foi submetida a diluições sucessivas em salina tamponada esterilizada, para obtenção da concentração de células desejada. A confirmação da viabilidade do inóculo e as contagens bacterianas foram feitas em ágar MacConkey após 24 horas de incubação a 37ºC. Os camundongos GN (controle e experimental) receberam inóculos de 0,1 mL, contendo 102 UFC, por via oral através de uma agulha de inoculação intragástrica em dia pré-estabelecido. RESULTADOS E DISCUSSÃO Quando tratados com a bactéria láctica L. reuteri – 11 A, os camundongos dos grupos IG receberam um inóculo único de 108 células (0,1 mL de uma cultura contendo 109 UFC/mL), por inoculação intra-gástrica, dez dias antes do desafio com a bactéria patogênica, conforme descrito por Rodrigues et al. (1996). A linhagem de Salmonella enterica sorov. Typhimurium, utilizada como desafio para os camundongos GN (controle e experimental) foi fornecida em inóculos de 0,1 mL, contendo 102 UFC, por via oral através de uma agulha de inoculação intra-gástrica em dia pré-estabelecido. Neste experimento, em 10 dias de monoassociação com o L. reuteri – 11 A, observou-se o mesmo resultado do experimento de colonização do TGI e do experimento ex vivo, com a linhagem instalando-se em altos níveis no trato digestivo dos animais gnotobióticos e mais uma vez, destacando-se a capacidade de sobreviver à passagem através do trato gastrointestinal (Figuras 1 e 2). Diferentemente do que foi mencionado para os experimentos in vitro e ex vivo, a atividade antagonista nesta etapa não foi observada. Dentre estas formas de inibição esperada para este teste, a produção de ácido láctico talvez fosse a mais importante no caso do microrganismo estudado neste ensaio, pois a bactéria avaliada é produtora deste ácido. Dessa forma, quando ácido láctico e outros ácidos são produzidos por este microrganismo, eles alteram o metabolismo das bactérias sensíveis, causando um efeito bacteriostático ou bactericida (SALMINEM, 1998). No experimento in vivo, não foi visualizado, como demonstrado em outros trabalhos (NICOLI & RAIBAUD, 1990; RAMARE et al., 1993), o efetivo antagonismo bacteriano, denominado de efeito barreira do probiótico testado contra o patógeno em camundongos gnotobióticos, levando a drástica redução do microrganismo maléfico. Neste caso, foi observada uma ligeira, porém visível, melhora dos animais do grupo experimental em relação aos animais do grupo controle, mostrando então, a possível atuação de modo benéfico do microrganismo no trato gastrintestinal seja quanto à produção de substâncias inibitórias já citadas, ou a
  • 6. ISSN 2318-4752 – Volume 7, N1, 2019 6 outros fatores como competição por sítios de adesão para a eliminação ou controle do alvo patogênico. Após este período os animais foram sacrificados. Alguns autores também sugerem que microrganismos exercem sua atividade antagonista in vivo através da produção de bacteriocina. Isto lhes confere uma habilidade ecológica para exercer um papel de modulação do crescimento dos indivíduos que compõem a microbiota intestinal. Desta forma, mesmo não tendo sido observada a atividade antagonista in vivo exercida pela linhagem de L. reuteri estudada no presente experimento, não está descartada a possibilidade de pesquisas visando à comprovação da produção de bacteriocina. Figura 1. Níveis populacionais de Salmonella Typhimurium detectados nas fezes de camundongos gnotobióticos. Foram realizadas colheitas de fezes para análises nos dias 1, 2, 5, 6, 8, 10 e 11. Figura 2. Níveis populacionais de Lactobacillus reuteri - 11 A e Salmonella Typhimurium detectados nas fezes de camundongos gnotobióticos. Foram realizadas colheitas de fezes para análises nos dias 1, 2, 5, 6, 8, 10 e 11. Os animais receberam S. Typhimurium (desafio) no dia 5 após a monoassociação com o L. reuteri - 11 A. CONCLUSÃO Conclui-se, até este momento, que este microrganismo possui capacidade de colonização do trato gastrointestinal de camundongos gnotobióticos e que alcança níveis adequados à proteção nas diversas porções estudadas. No experimento in vivo, não foi visualizado o efetivo antagonismo bacteriano, denominado de efeito barreira do probiótico testado contra o patógeno em camundongos gnotobióticos, levando a drástica redução do microrganismo maléfico. Neste caso, foi observada uma ligeira, porém visível, melhora dos animais do grupo experimental em relação aos animais do grupo controle, mostrando então, a possível atuação de modo benéfico do microrganismo no trato gastrintestinal. Porém, para que tal probiótico possa vir a ser aprovado, são necessários outros ensaios demonstrando outros efeitos protetivos, além de uma avaliação de seu impacto no crescimento e ganho de peso dos animais. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS FULLER, R. Probiotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol., v. 66, p. 365-378, 1989. FULLER, R. Probiotics. The scientific basis, London: Chapman & Hall, 328 p., 1992. FULLER, R.; COLE, C.B. The Scientific Basic of the Probiotic Concept. In: Probiotic: Theory and Applications. Marlows: Chalcombe Publications, p. 1-14, 1988. NICOLI, J.R.; RAIBAUD, P. In vivo and in vitro antagonistic effect against Clostridium perfringens of a diffusible compound produced by a Peptostreptococcus sp from human intestinal flora in mice. Microecol. Therap., v. 20, p. 141-146, 1990. PLEASANTS, J.R. Gnotobiotics. In: Melby Jr., E.C., Altmann, N.H. Handbook of Laboratory
  • 7. ISSN 2318-4752 – Volume 7, N1, 2019 7 Animal Science, Cleveland: CRC Press, p. 119-174, 1974. RAMARE, F.; NICOLI, J.; DABARD, J.; CORRING, T.; LADIRE, M.; GUEUGNEAU, A.; RAIBAUD, P. Trypsin-dependent production of an antibacterial substance by a human Peptostreptococcus strain in gnotobiotic rats and in vitro. Appl. Environ. Microbiol., v. 59, p. 2876-2883, 1993. RODRIGUES, A.C.; NARDI, R.M.; BAMBIRRA, E.A.; VIEIRA, E.C.; NICOLI, J.R. Effect of Saccharomyces boulardii against experimental oral infection with Salmonella typhimurium and Shigella flexneri in conventional and gnotobiotic mice. J. Appl. Bacteriol., v. 81, p. 251-256, 1996. SALMINEN, S. Clinical applications of probiotic bacteria. Int. Dairy J., v. 8, p. 563- 572, 1998. SILVA, M.E. Modelos experimentais para o estudo de doença de Chagas, camundongos e ratos isentos de germes e convencionais, Belo Horizonte: Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas, 1986, Dissertação (Mestrado). TANNOCK, G.W. Microbial interactions and influences in gastrointestinal tract. Lactobacilli and the gastrointestinal tract. Proc. IV ISME, p. 526-532, 1986. TANNOCK, G. W. More than a smell: the complexity of the normal microflora. In: TANNOCK, G. W. (Ed.). Normal Microflora. An Introduction to Microbes Inhabiting the Human Body. New Zealand: Chapman & Hall., p. 1- 36, 1995. TANNOCK, G.W. Probiotics and prebiotics: where we are going? Wymondham: Caister Academic Press. 54 p., 2003. TANNOCK, G.W.; FULLER, R.; PEDERSEN, K. Lactobacillus succession in the piglet digestive tract demonstrated by plasma profiling. Appl. and Environ. Microbiol., v. 56, p. 1310-1316, 1990. ____________________________________ 1 - Graduação em Ciências Biológicas. Professor Adjunto do Departamento de Morfologia (DMO – CCBS) da Universidade Federal de Sergipe - UFS, Brasil. E-mail: flaviobarbosaufs@gmail.com 2 - Graduação em Fisioterapia. Mestrado em Microbiogia. Departamento de Microbiologia (ICB) da Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG, Brasil. 3 - Graduação em Medicina Veterinária. Departamento de Microbiologia (ICB) da Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG, Brasil. 4 - Graduação em Enfermagem. Professor Adjunto do Curso de Enfermagem da Universidade Federal do Amapá (UNIFAP), Brasil.