1. O documento descreve um estudo que avaliou a capacidade de bactérias lácticas isoladas de fezes de suínos (Lactobacillus spp.) de inibir o crescimento de patógenos bacterianos ex vivo. 2. Seis amostras de Lactobacillus spp. isoladas de suínos recém-desmamados e mais velhos foram testadas para sua capacidade de inibir o crescimento de bactérias indicadoras. 3. L. johnsonii-18J e L. reuteri-11A mo

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TESTE DE ANTAGONISMO EX VIVO DE MICRORGANISMOS PRODUTORES DE
ÁCIDO LÁCTICO (Lactobacillus spp.) ISOLADOS DAS FEZES DE SUÍNOS (Sus
scrofa domesticus) FRENTE A MICRORGANISMOS INDICADORES
EX VIVO ANTAGONISM TEST OF LACTIC ACID PRODUCING MICRO-ORGANISMS (Lactobacillus
spp.) ISOLATED FROM SWINE FEES (Sus scrofa domesticus) IN FRONT OF INDICATOR MICRO-
ORGANISMS
FLÁVIO HENRIQUE FERREIRA BARBOSA1; FELIPE HENRIQUE SILVA BAMBIRRA2; LEANDRO
HENRIQUE SILVA BAMBIRRA3; RUBENS ALEX DE OLIVEIRA MENEZES4
RESUMO
A produção de alimentos saudáveis e nutritivos em grande quantidade tem se tornado um desafio para todos os
profissionais que trabalham com toda a cadeia produtiva alimentícia. A produção mundial de suínos cresceu e o Brasil
teve um aumento significativo nas exportações de carne suína. Para que a atividade de criação de suínos se mantenha
produtiva, com a geração de lucros, promotores de crescimento têm sido incorporados às rações, com objetivo de
melhorar o processo digestivo e o desempenho zootécnico dos animais, resultando em maior ganho de peso e redução
do número de doenças. Entretanto, nos últimos anos tem aumentado a conscientização sobre o uso excessivo destes
produtos, bem como se tornado evidente os possíveis transtornos à saúde destes animais e do homem, como
consequências desta suplementação. As alternativas disponíveis para substituição dos antimicrobianos na suinocultura
incluem a utilização de probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes fitoterápicos. Seguindo esta linha de raciocínio, este
trabalho se propôs a avaliar a capacidade de proteção das bactérias lácticas (Lactobacillus spp.) contra enteropatógenos
bacterianos, verificando a inibição do crescimento de patógenos ex vivo. De acordo com a característica probiótica
estudada (antagonismo ex vivo), algumas amostras de microrganismos isolados do conteúdo fecal de suínos se destacam
quando o objetivo almejado é a utilização para a elaboração de produtos probióticos que poderão ser administrados via
oral para os animais, logo após o nascimento, durante o desmame (creche) e em outras fases da cadeia produtiva. Todos
apresentaram bons resultados de inibição ex vivo do desenvolvimento das amostras de bactérias utilizadas como
reveladoras se mostrando efetivos contra os patógenos testados, porém, L. johnsonii - 18 J e L. reuteri - 11 A apresentaram
efeito antagonista contra espécie relacionada (Lactobacillus acidophilus), sugerindo a produção de substâncias
antagonistas, por exemplo, bacteriocinas.
PALAVRAS-CHAVE: Lactobacillus, bactérias lácticas, suínos, probiótico.
ABSTRACT
The production of healthy and nutritious food in large quantities has become a challenge for all professionals who work
with the entire food production chain. World swine production grew and Brazil saw a significant increase in exports. In
order for the pig breeding activity to remain productive, with the generation of profits, growth promoters have been
incorporated into the rations, with the objective of improving the digestive process and the zootechnical performance of
the animals, resulting in greater weight gain and reduced number of diseases. However, in recent years there has been
an increase in awareness about the excessive use of these products, as well as the possible health disorders of these
animals and man, as consequences of this supplementation, have become evident. The alternatives available to replace
antimicrobials in pig farming include the use of probiotics, prebiotics, symbiotics and herbal agents. Following this line of
reasoning, this work aimed to evaluate the protection capacity of lactic acid bacteria (Lactobacillus spp.) Against bacterial
enteropathogens, verifying the inhibition ex vivo of the growth of pathogens. According to the probiotic characteristic
studied (ex vivo antagonism), some samples of microorganisms isolated from the faecal content of swine stand out when
the aim is to use probiotic products that can be administered orally to animals, right after birth, during weaning (day care)
and at other stages of the production chain. All of them showed good results of ex vivo inhibition of the development of the
samples of bacteria used as developers, proving effective against the pathogens tested, however, L. johnsonii - 18 J and
L. reuteri - 11 A showed antagonistic effect against related species (Lactobacillus acidophilus) , suggesting the production
of antagonistic substances, for example, bacteriocins.
KEYWORDS: Lactobacillus, lactic bacteria, swine, probiotic.

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INTRODUÇÃO
A produção de alimentos saudáveis e
nutritivos em grande quantidade tem se
tornado um desafio para todos os profissionais
que trabalham com toda a cadeia produtiva
alimentícia. Estimativas indicam que o
suprimento de alimentos necessários para
atender aos requerimentos nutricionais da
população humana durante os próximos
quarenta anos equivale à quantidade
previamente produzida ao longo de toda a
história. Para atender a esta grande demanda
de alimentos de origem animal, os
pesquisadores têm se esforçado na busca de
novas tecnologias a fim de aumentar a
eficiência e a produtividade dos animais de
criação.
A suinocultura é um dos setores
agropecuários que mais tem crescido nas
últimas décadas. Segundo dados da
EMBRAPA, a produção de carne suína no
Brasil vem crescendo mais 5% ao ano desde
o ano de 2006. A produção mundial de suínos
cresceu sistematicamente nos últimos 30
anos e o Brasil teve um aumento significativo
nas exportações de carne suína, chegando à
quarta colocação mundial e, atualmente, esse
produto pode ser encontrado até na Rússia. A
este fato, associa-se um marcante aumento
no comércio e consumo de carne de suínos
em todo o mundo, sendo que sua produção
está rapidamente se expandindo em muitos
países em desenvolvimento, como o Brasil, o
que faz aumentar o rigor no manejo dos
animais e na produção da carne.
Para que a atividade de criação de
suínos se mantenha produtiva, com a geração
de lucros, muitos aditivos (incluindo
promotores de crescimento, como drogas
antimicrobianas) têm sido incorporados às
rações, com objetivo de melhorar o processo
digestivo e o desempenho zootécnico dos
animais, resultando em maior ganho de peso
e redução do número de doenças. Entretanto,
nos últimos anos tem aumentado a
conscientização sobre o uso excessivo destes
produtos, bem como se tornado evidente os
possíveis transtornos à saúde destes animais
e do homem, como consequências desta
suplementação.
Os antimicrobianos promotores de
crescimento podem alterar a microbiota do
trato digestivo e deprimir os mecanismos de
defesa dos animais, além de deixar resíduos
indesejáveis à saúde do homem na carne.
Além disso, a presença de concentrações
baixas de antimicrobianos pode ser
responsável pelo aumento dos fenômenos de
resistência bacteriana aos mesmos.
Recentemente, novos microrganismos
resistentes a uma ou várias drogas
antimicrobianas têm surgido e sido motivo de
preocupação para a saúde pública mundial.
Estes microrganismos modificados podem se
difundir pelo meio ambiente e estarem
presentes na carne dos animais.
Por causa destas evidências, a
ausência de microrganismos potencialmente
patogênicos e a ausência de resíduos de
produtos químicos têm se tornado os
principais indicadores de qualidade da carne
de suínos, bem como de outros alimentos.
Assim, a suinocultura brasileira precisará se
adaptar às futuras normas de comércio
internacional, pois alguns países
importadores, principalmente da União
Europeia, não mais aceitarão adquirir carne
de suínos oriunda de produtores que utilizam
antimicrobianos para aumentar os índices de
produtividade de seus plantéis.
Assim, tem gerado a necessidade de se
buscar alternativas que possam promover os
mesmos efeitos de produtividade
relacionados ao uso dos aditivos alimentares,
porém, sem causar as mesmas
consequências indesejáveis destes. Além
disto, ainda existem prejuízos relacionados ao
impacto econômico da retirada destas drogas
antimicrobianas da alimentação de suínos.
Isto representa aumento nos custos de
produção, sendo, principalmente, causados
por aumento no consumo de ração e no
período de ocupação dos galpões, menos
ciclos produtivos por ano, além de mais gastos
com a mão-de-obra.
As alternativas disponíveis para
substituição dos antimicrobianos na
suinocultura incluem a utilização de

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probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes
fitoterápicos. Dentre estas, a utilização dos
microrganismos probióticos constitui uma
perspectiva extremamente interessante, pois
as próprias bactérias benéficas da microbiota
intestinal dos animais poderiam ser
empregadas em substituição aos
antimicrobianos. Nestes casos, estes
microrganismos poderiam favorecer o
equilíbrio do ecossistema gastrintestinal, o
que seria refletido em melhoria da saúde e
boa produtividade. Trabalhos científicos têm
sido conduzidos tentando avaliar a eficiência
da utilização dos probióticos, em substituição
aos produtos químicos, para modular a saúde
de suínos comerciais e proporcionar um
ganho de peso adequado. Bactérias do
gênero Lactobacillus são os principais
microrganismos desejáveis encontrados em
grandes quantidades por todo o trato
gastrintestinal (TGI) de suínos, mostrando ser
fortes candidatas como probióticos para estes
animais.
Seguindo esta linha de raciocínio, este
trabalho se propôs a avaliar a capacidade de
proteção das bactérias lácticas (Lactobacillus
spp.) contra enteropatógenos bacterianos,
verificando a inibição do crescimento de
patógenos ex vivo.
MATERIAL E MÉTODOS
1. Microrganismos
Características Morfo-tintoriais,
Bioquímicas e Fisiológicas dos
Microrganismos Isolados
Numa placa contendo em torno de 100
unidades formadoras de colônia (UFC), as
colônias morfologicamente diferentes e mais
significativas do ponto de vista populacional
foram repicadas, a partir do ágar MRS (Difco),
no mesmo meio. A partir de colônias, de cada
amostra, que apresentaram aspectos
morfológicos distintos foram feitos esfregaços
em lâminas para coloração pelo método de
Gram. Além disto, a partir dessas mesmas
colônias foram feitos testes de catalase em
lâmina, utilizando-se H2O2 (30%). Aqueles
que se apresentaram como Gram-positivo e
catalase negativa, sugestivos de pertencerem
ao gênero Lactobacillus, foram submetidos à
identificação, utilizando técnicas de biologia
molecular (PCR-ARDRA).
Purificação e Manutenção dos
Microrganismos Isolados
Os microrganismos isolados e
avaliados pelas características morfo-
tintoriais, bioquímicas e fisiológicas e pelo
teste respiratório foram inoculados em 5 mL
de caldo MRS (Difco), sendo em seguida
incubados em anaerobiose, à 37ºC durante 48
horas. Após o crescimento, uma alíquota de
500 µL de cada tubo foi transferida para tubo
eppendorf e adicionada de glicerol esterilizado
(50 µL), sendo, em seguida, congelados a -
18ºC e -86ºC, para posterior utilização,
quando necessário. O restante dos cultivos foi
destinado às análises baseadas em técnicas
de biologia molecular, com a finalidade de
identificação das espécies isoladas.
Ativação das culturas
Amostras de Lactobacillus spp.
isoladas a partir do TGI dos suínos (Sus scrofa
domesticus), oriundos de criação intensiva, e
pré-identificadas pelo perfil de fermentação de
carboidratos (kit API 50 CHL, BioMérieux,
Marcy l’Etoile, France), foram descongeladas
e inoculadas (200 µL) em caldo MRS (Difco).
O meio foi incubado, sob condições de
anaerobiose, a 37ºC, durante 48 horas. Após
cinco passagens em caldo, 50 µL de cada
amostra foram repicados em ágar MRS
(Difco), por três métodos diferentes: pour-
plate, espalhamento com auxílio da alça de
Drigalski e estria. Então, as placas foram
incubadas em anaerobiose, sendo mantidas a
37ºC, durante 48 horas.
Para a realização do teste a seguir,
foram escolhidos seis microrganismos entre o
grupo de doze os quais apresentaram
crescimento satisfatório em aerobiose dos
trinta e um isolados e identificados como
Lactobacillus, sendo três originados de
animais recém-desmamados (21 dias) e três
originados de animais jovens/terminados (140

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dias). Estas linhagens alcançaram melhores
resultados nos testes anteriores de
crescimento, viabilidade e manutenção
(estocagem) em função da atmosfera e do
meio de cultura a partir de vinhoto de cana-de-
açúcar suplementado com diferentes fontes
de carbono e nitrogênio. Dessa forma, os
microrganismos de interesse probiótico
escolhidos para os demais testes foram:
 06 J - Lactobacillus mucosae
 14 J - Lactobacillus ruminis
 18 J - Lactobacillus johnsonii
 08 A - Lactobacillus salivarius
 11 A - Lactobacillus reuteri
 13 A - Lactobacillus acidophilus
2. Animais
Animais Isentos de Germes (IG)
Foram usados camundongos isentos
de germes (NIH) de 21 dias de idade, de
ambos os sexos, derivados de um núcleo de
reprodução de camundongos provenientes da
Taconic Farms (Germantown, USA),
propagados no biotério de Gnotobiologia do
Instituto de Ciências Biológicas da UFMG,
mantidos em isoladores flexíveis do tipo
Trexler (Standard Safety Equipment
Company, McHenry, USA) e manuseados de
acordo com técnicas já estabelecidas
(PLEASANTS, 1974) e adaptadas às nossas
condições (SILVA, 1986). Para os
experimentos, os animais foram mantidos em
microisoladores (UNO Roestvaststaal BV,
Zevenaar, Netherland) e receberam “ad
libitum”, ração “Nuvilab” comercializada pela
Nuvital (Curitiba, PR) e água esterilizados por
calor úmido.
Manejo dos Animais
A manutenção, e o manejo dos animais
nos experimentos foram conduzidos
respeitando-se o “Guide for the care and use
of laboratory animals” – National Research
Concil, Institute of Laboratory Animal
Resources, Washington, D.C., National
Academy Press, 1996.
3. Teste de Antagonismo ex vivo
O teste ex vivo foi realizado conforme
descrito por Nicoli & Raibaud (1990), Ramare
et al. (1993) e Silva et al. (2001). Fezes de
animais antes e após 10 dias de
monoassociação com as bactérias lácticas
foram coletadas e cuidadosamente colocadas
no centro das placas de Petri contendo ágar
MRS (Difco) antes da solidificação e
incubadas por 48 horas a 4ºC. Após essa
incubação, as placas foram colocadas em
posição invertida e em cada tampa foi
colocado 1 mL de clorofórmio. Depois de 30
minutos, as placas foram abertas para
evaporação do clorofórmio residual e uma
sobre-camada de 3,5 mL de ágar BHI semi-
sólido (0,75% de ágar) acrescido de 10 µL de
uma cultura da bactéria reveladora (as
mesmas utilizadas no teste in vitro) crescida
por 18 a 24 horas a 37ºC em BHI foi colocada
sobre o ágar. Após incubação, a 37ºC, por 24
horas, efetua-se a leitura de possíveis halos
de inibição. O critério de determinação dos
resultados foi a presença ou ausência do halo
de inibição, independente do seu tamanho.
Todos os testes foram realizados em
duplicatas.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados dos testes de
antagonismo ex vivo são apresentados na
Tabela 1. Observando os dados contidos
nesta tabela, pode-se verificar que os
microrganismos colonizadores do TGI dos
camundongos, em conjunto, apresentaram
atividade antagonista. Verifica-se, também,
grande oscilação dos resultados,
caracterizando este tipo de determinação
como muito instável.
Dentre as amostras isoladas e
escolhidas para este trabalho, todas as seis
espécies foram selecionadas para
participarem do teste de antagonismo ex vivo
como produtoras de substância antagonista
frente a reveladoras, amostras de patógenos
de referência (Salmonella enterica sorovar
Typhimurium e Escherichia coli ATCC 25723)
e uma espécie relacionada (Lactobacillus

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acidophilus ATCC 4356), a fim de verificar
possíveis atividades inibitórias entre
microrganismos correlatos. A escolha da S.
enterica sorovar Typhimurium e da E. coli
dizem respeito à importância e relevância
destes microrganismos, quando patógenos na
suinocultura, levando os animais a quadros
diarreicos graves em alguns estágios de vida.
O resultado do teste de inibição ex vivo
dos Lactobacillus spp. previamente
selecionados contra patógenos e uma espécie
relacionada mostrou que houve produção de
substância antagonista no trato gastrintestinal
dos animais monoassociados que inibiu o
crescimento dos reveladores, mas não em
animais isentos de germes (grupo controle) ou
monoassociados com microrganismos não
produtores. Os resultados positivos
aconteceram somente para os
microrganismos 18 J – Lactobacillus johnsonii
e 11 A – Lactobacillus reuteri, em relação à
inibição da espécie relacionada.
Estes resultados foram semelhantes
aos encontrados nos experimentos de
antagonismo in vitro. A Tabela 1 mostra os
valores dos diâmetros de halos de inibição em
milímetros do antagonismo ex vivo de
Lactobacillus spp. contra todos os
reveladores. Pelo fato da microbiota intestinal
constituir um ecossistema altamente
competitivo, a produção de substâncias
antagonistas por seus componentes,
principalmente Lactobacillus representa uma
vantagem ecológica no controle dos níveis
populacionais de outras espécies patogênicas
ou não (NAIDU et al., 1999).
Tabela 1. Resultados (diâmetros de halos de inibição
em milímetros) do antagonismo ex vivo de Lactobacillus
spp. isolados do conteúdo fecal de suínos recém-
desmamados e terminados frente a microrganismos
indicadores.
Estes resultados corroboram aos
outros ensaios, ao demonstrar que em 10 dias
de monoassociação com os respectivos
Lactobacillus spp., observou-se que estes
instalaram-se em altos níveis no trato
digestivo dos animais. Este resultado está de
acordo com os achados de outros
pesquisadores na literatura que
demonstraram ser, os microrganismos deste
gênero bacteriano capazes de sobreviver à
passagem através do trato gastrointestinal,
resistindo a ações adversas como pH
estomacal, sais biliares e enzimas. Estes
achados confirmam, mais uma vez, a
produção de substância inibitória, sendo desta
vez realizada no ambiente do trato
gastrointestinal dos animais. As amostras 18 J
(Lactobacillus johnsonii) e 11 A (Lactobacillus
reuteri) foram aquelas que apresentaram
efeito inibidor frente às bactérias reveladoras
utilizadas, inclusive microrganismo do mesmo
gênero, sugerindo a possibilidade de
substâncias antagonistas tipo bacteriocinas.
As atividades antagonistas observadas
ex vivo foram muito semelhantes àquelas
observadas in vitro e, também podem ser
explicadas por diferentes mecanismos como:
produção de ácidos orgânicos, peróxido de
hidrogênio, dióxido de carbono ou
bacteriocinas (EDENS, 2003). Dentre estas
formas de inibição, a produção de ácido
láctico talvez seja a mais importante no caso
dos microrganismos estudados deste
trabalho, pois as bactérias avaliadas eram
produtoras deste ácido. Quando ácido láctico
e outros ácidos (butírico, propiônico e acético)
são produzidos por estes microrganismos,
estes alteram o metabolismo das bactérias
sensíveis, causando um efeito bacteriostático
ou bactericida (SALMINEM, 1998).
CONCLUSÃO
De acordo com a característica
probiótica estudada (capacidade de
colonização do trato gastrointestinal),
algumas amostras de microrganismos
isolados do conteúdo fecal de suínos se
destacam quando o objetivo almejado é a
utilização para a elaboração de produtos

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probióticos que poderão ser administrados via
oral para os animais, logo após o nascimento,
durante o desmame (creche) e em outras
fases da cadeia produtiva.
Todos apresentaram bons resultados
de inibição ex vivo do desenvolvimento das
amostras de bactérias utilizadas como
reveladoras se mostrando efetivos contra os
patógenos testados, porém, L. johnsonii - 18 J
e L. reuteri - 11 A apresentaram efeito
antagonista contra espécie relacionada
(Lactobacillus acidophilus), sugerindo a
produção de substâncias antagonistas, por
exemplo, bacteriocinas.
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Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas,
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microbiota. J. Med. Microbiol., v. 50, p. 161-
164, 2001.
____________________________________
1 - Graduação em Ciências Biológicas.
Professor Adjunto do Departamento de
Morfologia (DMO – CCBS) da Universidade
Federal de Sergipe - UFS, Brasil.
E-mail: flaviobarbosaufs@gmail.com
2 - Graduação em Fisioterapia. Mestrado em
Microbiogia. Departamento de Microbiologia
(ICB) da Universidade Federal de Minas
Gerais - UFMG, Brasil.
3 - Graduação em Medicina Veterinária.
Departamento de Microbiologia (ICB) da
Universidade Federal de Minas Gerais -
UFMG, Brasil.
4 - Graduação em Enfermagem. Professor
Adjunto do Curso de Enfermagem da
Universidade Federal do Amapá (UNIFAP),
Brasil.