Este documento descreve uma pesquisa que selecionou bactérias láticas de origem suína para uso como probióticos em suínos. A pesquisa avaliou a capacidade de sobrevivência e crescimento das bactérias em vinhoto, um resíduo da produção de cachaça, com o objetivo de desenvolver um preparado probiótico à base de vinhoto para a alimentação de suínos recém-nascidos e terminados. Os resultados indicaram que é possível produzir um preparado probiótico de bactérias láticas us

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SELEÇÃO DE BACTÉRIAS LÁCTICAS (Lactobacillus spp.) DE ORIGEM SUÍNA PARA
USO COMO PROBIÓTICO UTILIZANDO COMO CRITÉRIO A CAPACIDADE DE
SOBREVIVÊNCIA E CINÉTICA DE CRESCIMENTO EM VINHOTO DA PRODUÇÃO DE
CACHAÇA
SELECTION OF LACTIC BACTERIA (Lactobacillus spp.) FOR USE AS A PROBIOTIC USING THE CAPACITY OF
SURVIVAL AND KINETICS OF GROWTH IN VINHOTO OF CACHAÇA PRODUCTION
FLÁVIO HENRIQUE FERREIRA BARBOSA1; FELIPE HENRIQUE SILVA BAMBIRRA2; LEANDRO
HENRIQUE SILVA BAMBIRRA3; RUBENS ALEX DE OLIVEIRA MENEZES4
RESUMO
A produção de alimentos saudáveis e nutritivos em grande quantidade tem se tornado um desafio para todos os
profissionais que trabalham com toda a cadeia produtiva alimentícia. A produção mundial de suínos cresceu e o Brasil
teve um aumento significativo nas exportações de carne suína. Para que a atividade de criação de suínos se mantenha
produtiva, com a geração de lucros, promotores de crescimento têm sido incorporados às rações, com objetivo de
melhorar o processo digestivo e o desempenho zootécnico dos animais, resultando em maior ganho de peso e redução
do número de doenças. Entretanto, nos últimos anos tem aumentado a conscientização sobre o uso excessivo destes
produtos, bem como se tornado evidente os possíveis transtornos à saúde destes animais e do homem, como
consequências desta suplementação. As alternativas disponíveis para substituição dos antimicrobianos na suinocultura
incluem a utilização de probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes fitoterápicos. Quanto aos Sistemas Agroindustriais
(SAG) existentes no Brasil, sabe-se que o sucroalcooleiro se destaca pela importância social, econômica e política. O
aumento da produção de álcool acarretará um problema ao meio ambiente, devido à maior quantidade de vinhoto, resíduo
produzido em grande volume. Seguindo esta linha de raciocínio, este trabalho propôs realizar a seleção de bactérias
lácticas de origem suína para uso como probiótico utilizando como critério a capacidade de sobrevivência e cinética de
crescimento em vinhoto da produção de cachaça sob atmosfera aneróbica a serem utilizadas em suinocultura. Pelos
resultados obtidos, foi possível avaliar e constatar, que é possível produzir um preparado probiótico de bactérias lácticas
a base de vinhoto para a alimentação de animais monogástricos (suínos) recém-nascidos e terminados. Verificando-se
neste caso, até o presente momento, que a melhoria dos processos de multiplicação celular em vinhoto visando à máxima
produtividade a custos aceitáveis para a sua produção em larga escala se faz necessário.
PALAVRAS-CHAVE: Lactobacillus, bactérias lácticas, suínos, probiótico, vinhoto.
ABSTRACT
The production of healthy and nutritious food in large quantities has become a challenge for all professionals who work
with the entire food production chain. World swine production grew and Brazil saw a significant increase in exports. In
order for the pig breeding activity to remain productive, with the generation of profits, growth promoters have been
incorporated into the rations, with the objective of improving the digestive process and the zootechnical performance of
the animals, resulting in greater weight gain and reduced number of diseases. However, in recent years there has been
an increase in awareness about the excessive use of these products, as well as the possible health disorders of these
animals and man, as consequences of this supplementation, have become evident. The alternatives available to replace
antimicrobials in pig farming include the use of probiotics, prebiotics, symbiotics and herbal agents. As for the Agroindustrial
Systems (SAG) in Brazil, it is known that the sugar and alcohol industry stands out for its social, economic and political
importance. The increase in alcohol production will cause a problem to the environment, due to the greater amount of
vinasse, waste produced in large volume. Following this line of reasoning, this work proposed to carry out the selection of
lactic bacteria of swine origin for use as a probiotic using as a criterion the survival capacity and growth kinetics in vinasse
of cachaça production under anerobic atmosphere to be used in pig farming. From the results obtained, it was possible to
evaluate and verify that it is possible to produce a probiotic preparation of lactic acid bacteria based on vinasse for the
feeding of newborn and finished monogastric animals (swine). In this case, it has been verified, until now, that the
improvement of cell multiplication processes in vinasse aiming at maximum productivity at acceptable costs for its large-
scale production is necessary.
KEYWORDS: Lactobacillus, lactic bacteria, swine, probiotic, vinasse.

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INTRODUÇÃO
A produção de alimentos saudáveis e
nutritivos em grande quantidade tem se
tornado um desafio para todos os profissionais
que trabalham com toda a cadeia produtiva
alimentícia. Estimativas indicam que o
suprimento de alimentos necessários para
atender aos requerimentos nutricionais da
população humana durante os próximos
quarenta anos equivale à quantidade
previamente produzida ao longo de toda a
história. Para atender a esta grande demanda
de alimentos de origem animal, os
pesquisadores têm se esforçado na busca de
novas tecnologias a fim de aumentar a
eficiência e a produtividade dos animais de
criação.
A suinocultura é um dos setores
agropecuários que mais tem crescido nas
últimas décadas. Segundo dados da
EMBRAPA, a produção de carne suína no
Brasil vem crescendo mais 5% ao ano desde
o ano de 2006. A produção mundial de suínos
cresceu sistematicamente nos últimos 30
anos e o Brasil teve um aumento significativo
nas exportações de carne suína, chegando à
quarta colocação mundial e, atualmente, esse
produto pode ser encontrado até na Rússia. A
este fato, associa-se um marcante aumento
no comércio e consumo de carne de suínos
em todo o mundo, sendo que sua produção
está rapidamente se expandindo em muitos
países em desenvolvimento, como o Brasil, o
que faz aumentar o rigor no manejo dos
animais e na produção da carne.
Para que a atividade de criação de
suínos se mantenha produtiva, com a geração
de lucros, muitos aditivos (incluindo
promotores de crescimento, como drogas
antimicrobianas) têm sido incorporados às
rações, com objetivo de melhorar o processo
digestivo e o desempenho zootécnico dos
animais, resultando em maior ganho de peso
e redução do número de doenças. Entretanto,
nos últimos anos tem aumentado a
conscientização sobre o uso excessivo destes
produtos, bem como se tornado evidente os
possíveis transtornos à saúde destes animais
e do homem, como consequências desta
suplementação.
Os antimicrobianos promotores de
crescimento podem alterar a microbiota do
trato digestivo e deprimir os mecanismos de
defesa dos animais, além de deixar resíduos
indesejáveis à saúde do homem na carne.
Além disso, a presença de concentrações
baixas de antimicrobianos pode ser
responsável pelo aumento dos fenômenos de
resistência bacteriana aos mesmos.
Recentemente, novos microrganismos
resistentes a uma ou várias drogas
antimicrobianas têm surgido e sido motivo de
preocupação para a saúde pública mundial.
Estes microrganismos modificados podem se
difundir pelo meio ambiente e estarem
presentes na carne dos animais (FULLER,
1989; SALMINEN & VON WRIGHT, 1993;
TANNOCK, 2003).
Por causa destas evidências, a
ausência de microrganismos potencialmente
patogênicos e a ausência de resíduos de
produtos químicos têm se tornado os
principais indicadores de qualidade da carne
de suínos, bem como de outros alimentos.
Assim, a suinocultura brasileira precisará se
adaptar às futuras normas de comércio
internacional, pois alguns países
importadores, principalmente da União
Europeia, não mais aceitarão adquirir carne
de suínos oriunda de produtores que utilizam
antimicrobianos para aumentar os índices de
produtividade de seus plantéis.
Assim, tem gerado a necessidade de se
buscar alternativas que possam promover os
mesmos efeitos de produtividade
relacionados ao uso dos aditivos alimentares,
porém, sem causar as mesmas
consequências indesejáveis destes. Além
disto, ainda existem prejuízos relacionados ao
impacto econômico da retirada destas drogas
antimicrobianas da alimentação de suínos.
Isto representa aumento nos custos de
produção, sendo, principalmente, causados
por aumento no consumo de ração e no
período de ocupação dos galpões, menos
ciclos produtivos por ano, além de mais gastos
com a mão-de-obra.

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As alternativas disponíveis para
substituição dos antimicrobianos na
suinocultura incluem a utilização de
probióticos, prebióticos, simbióticos e agentes
fitoterápicos. Dentre estas, a utilização dos
microrganismos probióticos constitui uma
perspectiva extremamente interessante, pois
as próprias bactérias benéficas da microbiota
intestinal dos animais poderiam ser
empregadas em substituição aos
antimicrobianos. Nestes casos, estes
microrganismos poderiam favorecer o
equilíbrio do ecossistema gastrintestinal, o
que seria refletido em melhoria da saúde e
boa produtividade. Trabalhos científicos têm
sido conduzidos tentando avaliar a eficiência
da utilização dos probióticos, em substituição
aos produtos químicos, para modular a saúde
de suínos comerciais e proporcionar um
ganho de peso adequado. Bactérias do
gênero Lactobacillus são os principais
microrganismos desejáveis encontrados em
grandes quantidades por todo o trato
gastrintestinal (TGI) de suínos, mostrando ser
fortes candidatas como probióticos para estes
animais (FULLER, 1989; SALMINEN & VON
WRIGHT, 1993; TANNOCK, 2003).
Quanto aos Sistemas Agroindustriais
(SAG) existentes no Brasil, sabe-se que o
sucroalcooleiro se destaca pela importância
social, econômica e política. A crise do
Proálcool, após a década de 1990, foi
acompanhada por período de sensível
redução dos preços do açúcar no mercado
externo. Esse fato, associado à estagnação
no crescimento da demanda interna e no
aumento da produtividade agrícola e
industrial, desencadeou uma nova crise de
superprodução, existente até há pouco tempo.
Nessa nova configuração, a análise da
competitividade e de potencialidades para
novos empreendimentos com uso de
derivados da cana-de-açúcar aparece em
destaque. A cadeia produtiva da cana-de-
açúcar como fornecedora de produtos para o
mercado industrial e para exportação faz com
que as usinas intensifiquem seus esforços por
melhoria da produtividade, sendo que a
exigência dos clientes industriais as leva à
diferenciação de produtos com maior valor
agregado.
Dessa forma, uma diferente iniciativa
que o SAG Canavieiro poderia empreender
para reforçar sua competitividade nesta nova
configuração seria o aproveitamento das
oportunidades de diversificação na direção de
novos produtos oriundos da cana-de-açúcar e
seus derivados. Os empreendimentos para
diversificação das empresas mais bem
posicionadas do SAG estão sendo para
diferenciar suas commodities, açúcar e álcool,
em atividades complementares, tais como as
iniciativas para produção de produtos
resultantes de transformação de derivados da
cana-de-açúcar.
A reestruturação do SAG, na direção de
consolidar seu posicionamento nos mercados
interno e externo, apresenta grande impacto
na produção canavieira. Esse impacto é mais
forte principalmente em regiões do país onde
há predomínio da atividade canavieira.
Anuncia-se para essas regiões o aumento na
produção do álcool, dada sua
sobrevalorização em decorrência do
crescimento da demanda, devido às
exportações e do aumento dos preços do
petróleo e, ainda, do crescimento do mercado
interno, com os novos carros bicombustíveis e
a perspectiva de outros países adotarem
combustíveis menos poluidores.
De outro lado, o aumento da produção
de álcool acarretará um problema ao meio
ambiente, devido à maior quantidade de
vinhoto, resíduo produzido em grande volume,
qual seja na proporção de um litro de álcool
para 12 litros de vinhoto. O vinhoto distribuído
no solo, por meio de fertiirrigação dos talhões
de cana, apresenta já, nesse momento, várias
objeções de caráter ambiental: a primeira é
que a quantidade de vinhaça necessária para
a fertiirrigação da cana é inferior à quantidade
despejada, o que provoca comprometimento
dos lençóis freáticos e, no limite, até dos
lençóis mais profundos de água, como os
aquíferos. A segunda objeção é que as usinas
não possuem capacidade logística de
distribuição do vinhoto sobre toda a área
colhida de cana. Essa distribuição, em geral,
concentra-se nas áreas circunvizinhas às
usinas, o que vem comprometendo a própria
produtividade da cana próxima. Isso reforça a
necessidade de pensar em soluções, ou que

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reduzam o grau de concentração da vinhaça a
ser distribuída no solo, ou que seja expandida
a área de fertiirrigação ou ainda, que se
descubram novas aplicações tecnológicas
(VIAN, 2003; MOREIRA et al., 2002;
ASSUMPÇÃO, 2004).
Seguindo esta linha de raciocínio, este
trabalho se propôs a selecionar bactérias
lácticas para uso como probiótico utilizando
como critério a sua capacidade de
sobrevivência e cinética de crescimento em
vinhoto da produção de cachaça sob
atmosfera aeróbica a serem utilizadas em
suinocultura.
MATERIAL E MÉTODOS
1. Microrganismos
Características Morfo-tintoriais,
Bioquímicas e Fisiológicas dos
Microrganismos Isolados
Numa placa contendo em torno de 100
unidades formadoras de colônia (UFC), as
colônias morfologicamente diferentes e mais
significativas do ponto de vista populacional
foram repicadas, a partir do ágar MRS (Difco),
no mesmo meio. A partir de colônias, de cada
amostra, que apresentaram aspectos
morfológicos distintos foram feitos esfregaços
em lâminas para coloração pelo método de
Gram. Além disto, a partir dessas mesmas
colônias foram feitos testes de catalase em
lâmina, utilizando-se H2O2 (30%). Aqueles
que se apresentaram como Gram-positivo e
catalase negativa, sugestivos de pertencerem
ao gênero Lactobacillus, foram submetidos à
identificação, utilizando técnicas de biologia
molecular.
Purificação e Manutenção dos
Microrganismos Isolados
Os microrganismos isolados e
avaliados pelas características morfo-
tintoriais, bioquímicas e fisiológicas e pelo
teste respiratório foram inoculados em 5 mL
de caldo MRS (Difco), sendo em seguida
incubados em anaerobiose, à 37ºC durante 48
horas. Após o crescimento, uma alíquota de
500 µL de cada tubo foi transferida para tubo
eppendorf e adicionada de glicerol esterilizado
(50 µL), sendo, em seguida, congelados a -
18ºC e -86ºC, para posterior utilização,
quando necessário. O restante dos cultivos foi
destinado às análises baseadas em técnicas
de biologia molecular, com a finalidade de
identificação das espécies isoladas.
Ativação das culturas
Amostras de Lactobacillus spp.
isoladas a partir do TGI dos suínos (Sus scrofa
domesticus), oriundos de criação intensiva, e
pré-identificadas pelo perfil de fermentação de
carboidratos (kit API 50 CHL, BioMérieux,
Marcy l’Etoile, France), foram descongeladas
e inoculadas (200 µL) em caldo MRS (Difco).
O meio foi incubado, sob condições de
anaerobiose, a 37ºC, durante 48 horas. Após
cinco passagens em caldo, 50 µL de cada
amostra foram repicados em ágar MRS
(Difco), por três métodos diferentes: pour-
plate, espalhamento com auxílio da alça de
Drigalski e estria. Então, as placas foram
incubadas em anaerobiose, sendo mantidas a
37ºC, durante 48 horas.
2. O Vinhoto
Foram utilizadas amostras de vinhoto
(produto resultante do destilado da cana-de-
açúcar) produzidas por “Vale Verde
Alambique e Parque Ecológico”, alambique de
cachaça localizado na rodovia MG 50, Km 39
– Bairro Vianópolis, município de Betim – MG.
As amostras foram acondicionadas e
transportadas em vasilhame de polietileno
tereftalato (PET) selados para evitar trocas
gasosas prevenindo a oxidação. Foram
realizadas análises físico-químicas e
estabilidade microbiológica durante o período
de estocagem.
3. Curva de Crescimento das
Bactérias Lácticas
Para a realização dos testes da Curva
de Crescimento das Bactérias Lácticas
(Lactobacillus spp.), foram escolhidos seis

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microrganismos entre o grupo de doze os
quais apresentaram crescimento satisfatório
em aerobiose dos trinta e um isolados e
identificados como Lactobacillus, sendo três
originados de animais recém-desmamados
(21 dias) e três originados de animais
jovens/terminados (140 dias). Estas linhagens
alcançaram melhores resultados nos testes
anteriores de crescimento, viabilidade e
manutenção (estocagem) em função da
atmosfera e do meio de cultura a partir de
vinhoto de cana-de-açúcar suplementado com
diferentes fontes de carbono e nitrogênio.
Dessa forma, os microrganismos de interesse
probiótico escolhidos para os demais testes
foram:
 06 J - Lactobacillus mucosae
 14 J - Lactobacillus ruminis
 18 J - Lactobacillus johnsonii
 08 A - Lactobacillus salivarius
 11 A - Lactobacillus reuteri
 13 A - Lactobacillus acidophilus
Para a curva de crescimento das
bactérias lácticas um pré-inóculo de cada
linhagem foi crescido por 24-48 horas a 37ºC,
em caldo MRS (Difco) sob condições de
anaerobiose em câmara anaeróbica. O
mesmo procedimento foi realizado utilizando o
vinhoto (com suplementação – 2% dextrose e
0,2% de extrato de levedura - pH=6.5) como
meio para o cultivo. Para a curva de
crescimento as bactérias lácticas em MRS e
em vinhoto, foram mantidas na temperatura
de 37ºC em anaerobiose durante 24 horas, e
alíquotas foram retiradas em intervalos pré-
determinados e diluições foram realizadas e
plaqueadas. A quantidade de microrganismos
presentes foi determinada pelo número de
colônias desenvolvidas nas placas (expresso
em UFC) multiplicadas pelo fator de diluição.
A leitura da D.O. foi impossibilitada
nesta etapa do ensaio devido à coloração
mais escura do vinhoto. Sendo assim foi
adotado o mesmo procedimento para as
culturas em MRS.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A quantidade de microrganismos
presentes foi determinada pelo número de
colônias desenvolvidas nas placas (expresso
em UFC) multiplicadas pelo fator de diluição.
A leitura da D.O. foi impossibilitada nesta
etapa do ensaio devido à coloração mais
escura do vinhoto. Sendo assim foi adotado o
mesmo procedimento para as culturas em
MRS.
Observou-se um crescimento
satisfatório das culturas desenvolvidas em
MRS, alcançando, em 24 horas, nível elevado
no que diz respeito à concentração celular
visando à aplicação probiótica futura. Sob esta
ótica, todos os Lactobacillus spp. pré-
selecionados comportaram-se de maneira
bem semelhante (ver Figura 01).
Figura 1. Curva de crescimento dos Lactobacillus
selecionados em MRS (Difco). Tempo (Horas).
Em relação ao crescimento dos
mesmos microrganismos em vinhoto
suplementado, o crescimento foi bom quando
se leva em conta que se trata de um resíduo
da produção de álcool cujas condições para o
cultivo de bactérias lácticas não são as
melhores no que diz respeito, por exemplo, ao
pH e disponibilidade de outros nutrientes.
Conforme foi dito anteriormente, até
atingir seu local de ação no intestino, o
probiótico tem de enfrentar várias situações
estressantes e até mesmo potencialmente
letais (KLAENHAMMER & KULLEN, 1999). A
ingestão de um microrganismo vivo ou, em
condições de ser reativado, cujo destino deva

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ser o trato gastrintestinal, é uma complexa e
difícil jornada.
Na ingestão o microrganismo entra em
contato com o pH relativamente neutro da
cavidade oral. Subsequente, encontra-se o
estômago com seu pH ácido (embora suínos
não apresentem um pH letal para
microrganismos resistentes à acidez como os
Lactobacillus). Depois do estômago vem a
mudança de pH com a chegada ao intestino e,
a agressividade dos sucos intestinais, tais
como os sais biliares e sucos pancreáticos
(HOLZAPFEL et al., 1998). Além desta, a
entrada do microrganismo no sistema
gastrintestinal o deixa em uma tensão de
oxigênio e potencial de óxido-redução bem
menores.
Além das variações na tensão de
oxigênio, pH e do contato com os sucos
intestinais, existe a extensa microbiota natural
contra a qual qualquer microrganismo deverá
fazer frente. Em outras palavras, isto significa
que o microrganismo exógeno deverá possuir
uma flexibilidade nutricional que o capacite de
sobreviver com o que existe disponível, e deva
ser tolerante aos produtos secundários
gerados pelo metabolismo normal de milhares
de outros microrganismos tais como
bacteriocinas, gases, ácidos, etc.
(HOLZAPFEL et al., 1998).
Outros fatores, exteriores ao meio
ambiente gastrintestinal, também são de
extrema importância na seleção de um
probiótico. A possibilidade de cultivo em
escala industrial é um importante critério, o
microrganismo deverá ser adaptado a um
substrato economicamente viável para a
fermentação. Deve ser resistente à liofilização
e, durante sua reativação, deve conservar um
alto número de células viáveis. O produto final
deve ter um período de viabilidade longo na
prateleira.
Para uma futura aplicação probiótica
com estes Lactobacillus spp. pré-
selecionados, faz-se necessário a
concentração destas células buscando
aumentar os níveis do microrganismo no
produto a base de vinhoto ou melhor
incremento nutricional, sem grandes
aumentos nos custos de produção, para que o
probiótico comporte-se de maneira satisfatória
e alcance resultados positivos mediante a sua
aplicação na suinocultura (ver Figura 2).
Figura 2. Curva de crescimento dos Lactobacillus
selecionados em vinhoto suplementado (2% de
dextrose – pH=6,5). Tempo (Horas).
A Tabela 1 mostra as análises físico-
químicas realizadas no vinhoto suplementado
com dextrose 2% e 0,2% de extrato de
levedura (fonte de nitrogênio) utilizado para o
cultivo dos microrganismos. Pode-se observar
que a concentração de nitrogênio (N/L)
praticamente duplicou em alguns cultivos
microbianos. É possível que este incremento
nos valores de nitrogênio possa ser
decorrente do inoculo inicial dos
microrganismos no vinhoto e não somente da
adição de extrato de levedura.
Tabela 1. Determinações físico-químicas realizadas no
vinhoto utilizado nos experimentos.

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Nestes casos, para uma utilização
racional e efetiva do microrganismo probiótico
associado ao vinhoto como suplemento
alimentar incorporado à dieta animal, faz-se
necessário a produção seguida de rápida
aplicação do produto (talvez três dias fosse o
prazo máximo), ainda com número
considerável de células viáveis ou, então, do
estabelecimento de outras formas de
conservação microbiana e manutenção do
produto como se pode citar: a liofilização,
desidratação da cultura tipo spray dryer,
congelamento, e outros.
CONCLUSÃO
De acordo com as características
probióticas estudadas, algumas amostras de
microrganismos isolados do conteúdo fecal de
suínos se destacam quando o objetivo
almejado é a utilização para a elaboração de
produtos probióticos que poderão ser
administrados via oral para os animais, logo
após o nascimento, durante o desmame
(creche) e em outras fases da cadeia
produtiva.
Destaque para os microrganismos L.
mucosae - 06 J; L. ruminis - 14 J; L. salivarius
- 08 A; L. reuteri - 11 A. Assim como nos testes
acima, estes microrganismos se
apresentaram com boa capacidade de
multiplicação no vinhoto, destacando que o
incremento de nutrientes como fontes de
carbono e nitrogênio se faz necessário
visando ampliar o número de células
microbianas.
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where we are going? Wymondham: Caister
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VIAN, C.E. de F. Agroindústria canavieira –
estratégias competitivas e modernização.
Campinas: Editora Átomo, 216 p., 2003.
________________________________________
1 - Graduação em Ciências Biológicas.
Professor Adjunto do Departamento de
Morfologia (DMO – CCBS) da Universidade
Federal de Sergipe - UFS, Brasil.
E-mail: flaviobarbosaufs@gmail.com
2 - Graduação em Fisioterapia. Mestrado em
Microbiogia. Departamento de Microbiologia
(ICB) da Universidade Federal de Minas
Gerais - UFMG, Brasil.
3 - Graduação em Medicina Veterinária.
Departamento de Microbiologia (ICB) da
Universidade Federal de Minas Gerais -
UFMG, Brasil.
4 - Graduação em Enfermagem. Professor
Adjunto do Curso de Enfermagem da
Universidade Federal do Amapá (UNIFAP),
Brasil.