Identificação convencional de
fungos filamentosos
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leveduriformes
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Introdução
• Identificação do fungo de maneira ideal seria: Gênero e
espécie
• O processamento da amostra passa por 3 fase...
Isolamento do fungo
Semear Exame direto
Macroscópico
Microcultivo/ análise
bioquímica
Levedura Filamentoso
Gram
Identificação de fungos filamentosos
Cultura pura (Cultura
mista é uma causa
comum de erro)
• 1. Exame
Macroscópico
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Identificação de fungos filamentosos
• 1. Exame Macroscópico
Relevo: cerebriformes, rugosa,
apiculadas, crateriformes
Bord...
Identificação de fungos filamentosos
• 2. Exame Microscópico:
É a base do diagnóstico da
maioria dos fungos
filamentosos
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• 2. Exame Microscópico - 2 técnicas podem ser
empregadas:
Técnica Material Montagem
...
Identificação de fungos filamentosos
• Exame microscópico Direto
• Agar “cornmeal”
• Potato Dextrose Agar (PDA)
• SDA Dextrose Agar (SDA)
• Agar malte
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Identificação de fungos filamentosos
• Técnica de microcultivo em lâmina (método 1)
• Resistencia à cicloheximida
• Separar as culturas de:
Blastomyces dermatitidis,
Paracoccidiodes brasiliensis,
Histoplasm...
Identificação de fungos filamentosos
• 4.Demonstração de balistosporos
• Alguns fungos Zygomycetes tem habilidade de produ...
Identificação de fungos filamentosos
• 4.Demonstração de balistosporos
• 30ºC
• 2-3 dias
Identificação de fungos filamentosos
• 5. Teste da Perfuração do fio de cabelo
Distinção entre
Trichophyton rubrum e T. Me...
. Teste da Perfuração do fio de cabelo
Trichophyton mentagrophytes,
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Identificação de fungos filamentosos
• 6. Testes Fisiológicos
• Urease
• Habilidade de hidrolisar ou não a Uréia
• Disting...
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• 7. Dimorfismo
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• 7. Dimorfismo
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• 1 - Exame Macroscópico
• Características:
Textura
Topografia
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Coloração
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Colônias de cor laranja a vermelha,
aspecto cremoso.
Rhodothorula spp
Macromorfologia (ágar Sabouraud)
Ágar Sabouraud: col...
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• 2 - Exame Microscópico
• Preparações diretas e/ou cultivo em lâmina
• Célula leve...
Pseudohifas:
abundantes e ramificadas
Clamidósporos terminais
estruturas arredondadas de
parede espessa
Blastoconídeos
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Identificação de fungos leveduriformes
• Tubo Germinativo
• Objetivo: Identificação presuntiva de Candida albicans e
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• Tubo Germinativo
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• Demonstração de cápsula
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 3 – Testes fisiológicos ou bioquímicos
 São usados para identificação final dest...
Suspensãode
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Auxanograma
• Presença de oxigênio
• Utilização de fontes de:
• Carbono (a partir de açúcares)
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Auxanograma
• Meio basal sem fonte de carbono
• Sólido ou líquido
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• Inóculo: escala 1 Mc...
Auxanograma
• Aplicação de compostos nitrogenados
• Peptona (controle positivo)
• Nitrato de potássio
• Incubação 30oC por...
Identificação de fungos leveduriformes
 Teste da Urease
 Hidrólise da Uréia
 Cryptococcus neoformans (99%), Rhodotorula...
Identificação de fungos leveduriformes
 Sistemas Comerciais
 Manuais
 Automatizados (Vitek 2, ID 32C )
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Cultura positiva
Exame direto
Bactéria Levedura
Cultura Pura
Sim Não
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por isolamento
Cápsula
+
Macromorf...
Cultivo em lâmina
Obrigado!!!
Bibliografia
• LEVY, C. E. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em
Serviços de Saúde, 1ª edição, Mó...
• Micologia Médica à Luz de
AutoresContemporâneosSidrim JJC, Rocha
MFGGuanabara Koogan
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Identificação convencional de fungos filamentosos1

  1. 1. Identificação convencional de fungos filamentosos e identificação automatizada e convencional de fungos leveduriformes Disciplina: Micologia Médica Profº.: Luís Henrique Acadêmicos: Carlos Alberto; Joilce Portela; Marcos Allan; Maria Inês e Maria Josenilda
  2. 2. Introdução • Identificação do fungo de maneira ideal seria: Gênero e espécie • O processamento da amostra passa por 3 fases: Pré-analítica Analítica Processamento da amostra • Indicar a coleta • transporte • Processamento • identificação do microrganismo • laudo e estocagem • Estudos • Dados epidemiológicos
  3. 3. Isolamento do fungo Semear Exame direto Macroscópico Microcultivo/ análise bioquímica Levedura Filamentoso Gram
  4. 4. Identificação de fungos filamentosos Cultura pura (Cultura mista é uma causa comum de erro) • 1. Exame Macroscópico Textura: algodonosa, velutina, pulverulenta (furfuráceas), penugentas
  5. 5. Identificação de fungos filamentosos • 1. Exame Macroscópico Relevo: cerebriformes, rugosa, apiculadas, crateriformes Bordas: vários desenhos (franjas) Pigmentação: anverso e reverso/ difusível ou não Tamanho: variável (quantidade e qualidade do substrato)
  6. 6. Identificação de fungos filamentosos • 2. Exame Microscópico: É a base do diagnóstico da maioria dos fungos filamentosos Se baseia nas diferenças morfológicas das estruturas reprodutivas e na ontogenia dos esporos Os isolados primários e subcultivo devem ser submetidos a avaliação micromorfológica (40x)
  7. 7. Identificação de fungos filamentosos • 2. Exame Microscópico - 2 técnicas podem ser empregadas: Técnica Material Montagem Exame Microscópico Direto Amostra biológica Material é colocado entre lâmina e lamínula com líquido de montagem apropriado Microcultivo Fragmento da cultura 1ª ou 2ª em meio sólido ou líquido, Material é previamente depositados sobre lâmina e/ou lâminula Lactofenol azul de algodão (hialinos) Lactofenol de Aman/ KOH/NaOH/ (demáceos)
  8. 8. Identificação de fungos filamentosos • Exame microscópico Direto
  9. 9. • Agar “cornmeal” • Potato Dextrose Agar (PDA) • SDA Dextrose Agar (SDA) • Agar malte Identificação de fungos filamentosos • Técnica de microcultivo em lâmina (método 1) • 121ºC • 20- 30min • 30ºC • 3-5 dias
  10. 10. Identificação de fungos filamentosos • Técnica de microcultivo em lâmina (método 1)
  11. 11. • Resistencia à cicloheximida • Separar as culturas de: Blastomyces dermatitidis, Paracoccidiodes brasiliensis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, Coccidioides immitis, Epidermophyton floccosum Microsporum ssp., Trichophyton ssp. Observação Meio Resultado Crescimento SDA e Mycosel Resistente Crescimento SDA Sensível Não SDA Repetir Identificação de fungos filamentosos • 30°C • 7 dias Fungos Oportunistas Absidia, Rhizopus, Mucor e Aspergillus fumigatus
  12. 12. Identificação de fungos filamentosos • 4.Demonstração de balistosporos • Alguns fungos Zygomycetes tem habilidade de produzir balistosporos – dilatação propulsiva Produção de balistosporos Formação espontânea de colônias periféricas (Basidiobolus e Conidiobolus)
  13. 13. Identificação de fungos filamentosos • 4.Demonstração de balistosporos • 30ºC • 2-3 dias
  14. 14. Identificação de fungos filamentosos • 5. Teste da Perfuração do fio de cabelo Distinção entre Trichophyton rubrum e T. Mentagrophytes Extrato de levedura (10%) + fio de cabelo + cultura suspeita → incubar 30°C/ 10-14 dias
  15. 15. . Teste da Perfuração do fio de cabelo Trichophyton mentagrophytes, Hair perforation test is positive. Trichophyton rubrum, Hair perforation test is negative. Perforations
  16. 16. Identificação de fungos filamentosos • 6. Testes Fisiológicos • Urease • Habilidade de hidrolisar ou não a Uréia • Distinguir isolados atipicos de Trichophyton rubrum (-) e T. Mentagrophytes (+) • Agar usado: Agar uréia Christensen • Tempo: 3-4 dias controle
  17. 17. Identificação de fungos filamentosos • 7. Dimorfismo Dimórficos são fungos filamentosos que podem, sob determinadas condições, assumir forma de levedura, diminuindo a capacidade de filamentação - colônias aspecto cremoso • Filamentosa a 25-30⁰C • Levedura a 37 ⁰C É um critério útil para identificação desses fungos patogênicos → Temperatura, composição do meio e concentração de CO₂
  18. 18. Identificação de fungos filamentosos • 7. Dimorfismo Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidiodes brasiliensis, Sporothrix schenckii, Coccidioides immitis, gênero Emmonsia, Penicillium marneffei
  19. 19. Técnica de conversão da fase micelial à fase leveduriforme Todos os procedimentos devem ser feitos em câmara de fluxo laminar • Blastomyces dermatitidis e Paracoccidioides brasiliensis • Agar Kelley • Agar semente de algodão • Sporothrix schenckii, Histoplasma capsulatum • BHIB + glicose +cisteína • Sporothrix schenckii, • BHIA Exame direto – hifas em levedura (semanas) • 1º - 30°C 2º - 37°C
  20. 20. Identificação de fungos leveduriformes • 1 - Exame Macroscópico • Características: Textura Topografia Bordos Coloração meios sólidos Formação de película meios líquidos
  21. 21. Colônias de cor laranja a vermelha, aspecto cremoso. Rhodothorula spp Macromorfologia (ágar Sabouraud) Ágar Sabouraud: colônias de cor branca a creme, cremosas e lisas. Candida albicans Em ágar sangue, colônias de cor creme, com formação de franjas que lembram “ estrelas”. Candida krusei Colônia rosa Macromorfologia em Chromagar Macromorfologia
  22. 22. Identificação de fungos leveduriformes • 2 - Exame Microscópico • Preparações diretas e/ou cultivo em lâmina • Célula leveduras • Blastoporos • Blastosporos • Balistosforos • Pseudo-hifas • Tubos germinativos • Clamidosforos • Artrosporos • Ascos • Ascoporos • Cápsulas
  23. 23. Pseudohifas: abundantes e ramificadas Clamidósporos terminais estruturas arredondadas de parede espessa Blastoconídeos são ovais e formam aglomerados no septo das pseudohifas. Candida albicans Micromorfologia
  24. 24. Identificação de fungos leveduriformes • Tubo Germinativo • Objetivo: Identificação presuntiva de Candida albicans e C. stellatoidea (incubado com soro humano a 37°C/ 2-3 horas) Descrição Método 1 Método 2 Meio de cultura Soro humano ou animal Clara de ovo Procedimento 0,3 - 0,5mL (tubo de ensaio) → cultura suspeita (idade 18-72h) → incubar a 37°C / 2-3h → Inocular 1gt entre lâmina e lamínula → microscópico Inocular a cultura suspeita em clara de ovo → incubar a 37°C / 2 - 3h → montagem microscópica (tubos germinativos)
  25. 25. Identificação de fungos leveduriformes • Tubo Germinativo ALMEIDA, G. M. D., et al.
  26. 26. Identificação de fungos leveduriformes • Demonstração de cápsula • Indicar presuntivamente o agente etiológico – Cryptococcus neoformans (cápsulas em torno da célula) • Realizada com preparações microscópicas com nanquim ou nigrosina • Suspensão de levedura em água destilada + tinta da China + lâmina e lamínula → microscópio
  27. 27. Identificação de fungos leveduriformes  3 – Testes fisiológicos ou bioquímicos  São usados para identificação final deste grupo de fungos Assimilação de carboidratos Assimilação de nitrato Fermentação de carboidratos Teste de Urease → ZIMOGRAMA Sistemas comerciais AUXANOGRAMA }
  28. 28. Suspensãode células do fungo Solução- padrão= 106 ufc/mL Comparação para ajuste de turbidez: espectrofotômetro ou visual = INÓCULO
  29. 29. Auxanograma • Presença de oxigênio • Utilização de fontes de: • Carbono (a partir de açúcares) • Nitrogênio (a partir de nitrato)
  30. 30. Auxanograma • Meio basal sem fonte de carbono • Sólido ou líquido • Yeast Nitrogen Base (YNB)- 40mL • Inóculo: escala 1 McFarland (2mL) • Incorporar suspensão de levedura ao meio • Aplicação de discos ou açúcar in natura • Incubação 30oC por 24-48h
  31. 31. Auxanograma • Aplicação de compostos nitrogenados • Peptona (controle positivo) • Nitrato de potássio • Incubação 30oC por 24-48 h até 7 dias • Resultados: presença de zona de crescimento (leitura visual)
  32. 32. Identificação de fungos leveduriformes  Teste da Urease  Hidrólise da Uréia  Cryptococcus neoformans (99%), Rhodotorula e Trichosporon → urease positivo  Rápido crescimento em Agar Uréia de Christensen – coloração rosa escuro (30ºC/5 dias)  Teste da Urease rápida  Controle positivo: C. neoformans
  33. 33. Identificação de fungos leveduriformes  Sistemas Comerciais  Manuais  Automatizados (Vitek 2, ID 32C )  Para identificação específica de C. albicans  São empregados tiras ou cartelas contendo uma série de galerias plásticas com carboidratos desidratados ou outro substrato bioquímico  Inoculação nas galerias → incubação (varia de 4h-2-3 dias) → leitura
  34. 34. Cultura positiva Exame direto Bactéria Levedura Cultura Pura Sim Não Obter Colônia Pura por isolamento Cápsula + Macromorfologia Colônia bege: Criptococcus sp Colônia salmão/laranja: Rhodothorula sp - Tubo Germinativo - + C. albicans Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina (continua)
  35. 35. Cultivo em lâmina
  36. 36. Obrigado!!!
  37. 37. Bibliografia • LEVY, C. E. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde, 1ª edição, Módulo VII, Editora Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Campinas SP., 2004. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/ servicosaude/manuais/ microbiologia.asp>. Acesso em 17/10/12. • SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia Médica à Luz de Autores Contemporâneos, 1ª edição, Guanabara Koogan, 2004. • ZAITZ. C, et al, Compêndio de Micologia Médica, 2º edição, Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2010.
  38. 38. • Micologia Médica à Luz de AutoresContemporâneosSidrim JJC, Rocha MFGGuanabara Koogan

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