PPT sobre técnicas moleculares

1.310 visualizações

Publicada em

tecnicas moleculares, o principio delas, muito bom para ter uma introdução ao conteudo

Publicada em: Ciências
0 comentários
1 gostou
Estatísticas
Notas
  • Seja o primeiro a comentar

Sem downloads
Visualizações
Visualizações totais
1.310
No SlideShare
0
A partir de incorporações
0
Número de incorporações
2
Ações
Compartilhamentos
0
Downloads
68
Comentários
0
Gostaram
1
Incorporações 0
Nenhuma incorporação

Nenhuma nota no slide

PPT sobre técnicas moleculares

  1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE LABORATÓRIO DE VIROLOGIA Equipe de Virologia UFRGS & IPVDF www.ufrgs.br/labvir Diagnóstico de infecções virais
  2. 2. • Duas formas  Buscar o vírus  Métodos diretos  Buscar a resposta do organismo  Métodos indiretos Diagnóstico de infecções virais
  3. 3. • Métodos diretos: utilizados na detecção do vírus, antígenos ou genomas virais:  Microscopia eletrônica  Isolamento viral  Detecção imunológica (IPX ou IF)  Hemaglutinação (HA)  ELISA direto  PCR, RT-PCR, Real-time PCR Buscar o vírus
  4. 4. • Permite a visualização de partículas víricas viáveis e também inviáveis • Aplicável virtualmente a todos os vírus • Identificação definitiva do agente • Desvantagens:  Caro  Baixa sensibilidade  Mão de obra especializada Microscopia eletrônica Fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/Megavirus Megavirus chilensis
  5. 5. • Identificação pela produção do efeito citopático (ECP) característico • Exige vírus viável • Boa sensibilidade • Não aplicável a alguns vírus • Disponibilidade de linhagens celulares Isolamento em cultivo celular
  6. 6. • Os vírus são espécie-específicos, mas alguns conseguem se multiplicar em células da espécie homóloga • BVDV: céls de bovinos, ovinos, suínos, carnívoros e primatas • PRRSV: céls MARC-145 (céls de primata) • EHV: céls VERO (primata) e RK-13 (coelho) • Influenza: MDCK (canina) • BoHV: MDBK, CRIB, VERO, etc Qual célula utilizar
  7. 7. • É o dano que o vírus causa à célula  lise  arredondamento  vacuolização  formação de sincícios  inclusões  picnose  apoptose Efeito citopático (ECP)
  8. 8. Adenovírus em células 293A Fonte: Knak et al., in prep Efeito citopático (ECP)
  9. 9. • Obtenção do vírus viável permite a sua caracterização e estudos posteriores  Detecção de antígenos ou ácidos nucleicos  Neutralização com soro imune específico • Desvantagens: caro, demorado, risco de contaminações Isolamento viral
  10. 10. • Inoculação em animais  Ex.: em camundongos lactentes para o diagnóstico conclusivo da raiva • Inoculação em ovos embrionados  Teremos uma aula específica sobre este tema Outras formas de detecção direta do vírus
  11. 11. • Observação da capacidade do vírus de aglutinar hemácias • Vantagens: rápida, boa sensibilidade e especificidade e de fácil execução • Desvantagens: aplicável a um grupo restrito de vírus  Necessidade de espécies doadoras de hemácias (cobaias, coelhos ou galinha) Hemaglutinação (HA)
  12. 12. • Alguns vírus possuem estruturas capazes de se ligar a receptores específicos de hemácias de determinadas espécies e produzir o fenômeno da HEMAGLUTINAÇÃO Essas estruturas são as hemaglutininas (glicoproteínas de superfície dos virions) Hemaglutinação (HA)
  13. 13. • Alguns vírus com capacidade hemaglutinante – Influenza – Parainfluenza – Adenovírus bovino, equino, canino – Parvovírus – Doença de Newcastle – Bronquite infecciosa das galinhas Hemaglutinação (HA)
  14. 14. • Mecanismo / Princípio Hemaglutinação (HA)
  15. 15. • Interpretação – Reação positiva: presença de vírus – Reação negativa: ausência de vírus – Reação negativa: ausência de vírus Hemaglutinação (HA)
  16. 16. 1º PBS Hemaglutinação (HA)
  17. 17. 2º Vírus Hemaglutinação (HA)
  18. 18. 3º Diluição do vírus 25μl Hemaglutinação (HA)
  19. 19. 4º Hemácias a 1% Hemaglutinação (HA)
  20. 20. • Utiliza anticorpos específicos • Método mais utilizado para detecção e identificação viral • Diferentes amostras: secreções, tecidos ou céls de cultivo inoculadas • IPX, Imunofluorescência, ELISA Detecção de antígenos virais
  21. 21. • Vantagens: alta sensibilidade e especificidade • Rapidez, baixo custo e facilidade de execução • Kits comerciais ampliaram e popularizaram o uso Detecção de antígenos virais
  22. 22. • É uma técnica de detecção de antígeno (Ag) utilizada no diagnóstico de infecções víricas • Baseia-se na reação de anticorpos (Ac) específicos com o antígeno presente no material suspeito  Imunocitoquímica: monocamadas celulares  Imunoistoquímica: diretamente em tecidos Imunoperoxidase (IPX)
  23. 23. IPX
  24. 24. - IPX indireta é mais sensível Ampliação do sinal! IPX
  25. 25. Resultado positivo Resultado negativo IPX
  26. 26. • Tb é uma técnica baseada na reação antígeno-anticorpo • Proteínas virais são detectadas por Ac conjugados com marcador fluorescente • Rápida, fácil, apresenta boa sensibilidade e especificidade • Detecta tb vírus inviável Imunofluorescência
  27. 27. • Disponível em kits • Desvantagens:  Podem ocorrer reações inespecíficas  Reagentes para alguns vírus podem não ser disponíveis • Aplicação: imunofluorescência direta para o diagnóstico do vírus da raiva Imunofluorescência
  28. 28. • Diagnóstico da raiva • Amostras de cérebro suspeitas • Impressão tecidual em lâminas (imprint) • Anticorpo marcado com FITC sobre material infectado • Visualização em microscópio de fluorescência Imunofluorescência direta
  29. 29. Imunofluorescência direta Fonte: http://www.utmb.edu/virusimages/ Cérebro de raposa positivo para o vírus da raiva (CDC, 1958)
  30. 30. • Baseia-se na identificação de anticorpos e/ou antígenos, por anticorpos marcados com uma enzima, de maneira que esta enzima age sobre um substrato e a reação faz com que o cromógeno mude de cor  Tipos de ELISA: indireto, direto, competitivo ELISA
  31. 31. • Anticorpos imobilizados em placas de poliestireno detectam o vírus presente na amostra • Rápida, sensível, específica, automatizável, disponível em kits,  Desvantagens: kits comerciais são caros e podem apresentar falhas na detecção (falsos-negativos) ELISA direto
  32. 32. • Também denominado sanduiche ou de captura • Utilizado para detecção de antígenos • Anticorpo primário específico ao antígeno é adsorvido no poço da microplaca • Adiciona-se o antígeno • O segundo anticorpo específico ao antígeno é marcado com uma enzima é adicionado ELISA direto
  33. 33. • PCR, Nested PCR, multiplex PCR • RT-PCR • Real-time PCR • NGS • Alia alta sensibilidade e especificidade • Aplicável a todos os vírus • Rápida e automatizável Detecção de ácidos nucleicos
  34. 34. • Teremos aulas específicas sobre estes temas  21/05 Prática: PCR e Nested PCR (Fabrício e Helton)  04/06 Prática: Real time PCR (Tiane)  18/06 Teórica: Next Generation Sequencing (Fabricio e Helton) Detecção de ácidos nucleicos
  35. 35. • Quando ocorre contato com o vírus • Detecção de anticorpos • Métodos indiretos:  Soro-neutralização  Inibição da hemaglutinação (HI)  Imunofluorescência indireta  ELISA indireto Buscar a resposta do organismo
  36. 36. • Técnicas de detecção de anticorpos são tb denominados testes sorológicos • Importância na epidemiologia: prevalência e distribuição de infecções virais • Resultados dos exames sorológicos devem ser interpretados de acordo com a biologia e epidemiologia do agente e da resposta imunológica do hospedeiro Detecção de anticorpos antivirais
  37. 37. Inibição da Hemaglutinação • Anticorpos antivirais impedem a atividade hemaglutinante do vírus • Rápida, sensível, especifica, custo baixo • Somente aplicável a vírus hemaglutinantes • Requer animais doadores de hemácias • Não automatizável
  38. 38. Detecção de anticorpos capazes de inibir a atividade aglutinante de alguns vírus Inibição da Hemaglutinação
  39. 39. Resultado positivo PRESENÇA DE ANTICORPOS Resultado negativo AUSÊNCIA DE ANTICORPOS Inibição da Hemaglutinação
  40. 40. • Anticorpos presentes no soro previnem a replicação viral e a produção de ECP nas células • Vantagens: sensível, especifica, qualitativa e quantitativa Soroneutralização Anticorpos anti-BoHV Foto: Fabrício Campos Foto: http://images.google.com.br
  41. 41. • Obj.: avaliar o título de anticorpos neutralizantes • Determinar nível de imunidade de uma população • Determinar poder imunogênico de vacinas • Desvantagens: exige cultivo celular, toxicidade do soro  Detecta somente anticorpos neutralizantes  Somente vírus que replicam em cultivo Soroneutralização
  42. 42. • Vírus “desafio” previamente conhecido e quantificado • Teste realizado em microplacas de 96 cavidades • Incubação das diluições crescentes do soro-teste com uma quantidade constante de vírus (100 DICC50) • 1h a 24h de incubação (OIE: 24hs) • Adição das células de cultivo • Soro-vírus-célula (37°C; 5% de CO2 ; 48 a 96h). Soroneutralização
  43. 43. 100 DICC50 7° dil.1° dil. 2° dil. 3° dil. 4° dil. 5° dil. 6°dil. 100 DICC50 Vírus Estoque: Título = 106 105 104 103 102 101 100 10-1 DICC50 = Doses infectantes em 50% do cultivo celular 900 ul 100 ul MEM Vírus 900 ul 100 ul 900 ul 100 ul 900 ul 100 ul 900 ul 100 ul 900 ul 100 ul 900 ul 100 ul 10 DICC50 1 DICC50 0,1 DICC50 Calculo de dose infectante
  44. 44. + - soro teste vírus suspeito células 24 horas Soroneutralização
  45. 45. Leitura: 48-96h VÍRUS CITOPÁTICO + - Presença de Ac – neutralização viral – ausência de efeito citopático Ausência de Ac – vírus livre – presença de efeito citopático Soroneutralização
  46. 46. Leitura: 48-96h VÍRUS NÃO CITOPÁTICO + - Presença de Ac – neutralização viral – ausência de efeito citopático Ausência de Ac – vírus livre – presença de efeito citopático Soroneutralização
  47. 47. VÍRUS NÃO CITOPÁTICO IPX Soroneutralização
  48. 48. Soroneutralização
  49. 49. • Anticorpos presentes no soro se ligam a antígenos imobilizados e são detectados por anticorpos marcados com FITC • Vantagens: rápida e simples • Desvantagens: risco de reações inespecíficas  Reagentes para alguns vírus podem não ser disponíveis Imunofluorescência indireta
  50. 50. Imunofluorescência indireta Fonte: www.virologyj.com - Figure Imunofluoresncencia indireta feita com soro de galinha em células Vero infectadas com virus West Nile
  51. 51. • Utilizado para detecção de anticorpos • Antígeno fica aderido aos poços da microplaca • Adiciona-se o soro • Em seguida um anticorpo marcado com uma enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor ELISA INDIRETO
  52. 52. • Detecta exposição, mas não quando ela ocorreu • Considerar a cinética de replicação dos vírus para escolher o teste diagnóstico • Sugestão de leitura: Capitulo 11: Diagnóstico Laboratorial das Infecções Víricas do livro Virologia Veterinária; Flores, 2007. Limitações da sorologia
  53. 53. Cinética da replicação viral Fonte: Flores, 2007
  54. 54. Grato pela atenção!

×