1) O documento discute a influência de polimorfismos genéticos do citocromo P450 na resposta terapêutica à mefloquina em pacientes com malária falciparum.
2) O citocromo P450 desempenha um papel importante no metabolismo de muitos medicamentos antimaláricos como a mefloquina. Variações na atividade das enzimas do citocromo P450 podem afetar a conversão dos medicamentos em suas formas ativas.
3) Estudos de polimorfismos genéticos do cit
Influência de polimorfismos genéticos do citocromo P450 de pacientes com malária falciparum na resposta terapêutica à mefloquina
1. Influência de polimorfismos
genéticos do citocromo P450 de
pacientes com malária falciparum
na resposta terapêutica
à mefloquina
Sandra do Lago Moraes
Instituto de Medicina Tropical –
SP
Lab. de Imunologia – InCor-SP
5. Mais de 300 milhões de casos novos
por ano
MALÁRIA
AIDSTB
HANSENÍAS
E
SARAMPO
6. Conseqüências
Malária mata um milhão de
pessoas a cada ano
3000 pessoas morrem de malária a cada
dia (uma de cada quatro mortes de
crianças na África e gestantes), 170 por
hora
Morrem por falta de
acesso aos serviços
de saúde, às drogas
e às redes
impregnadas
7. Dificuldades no controle da
malária
resistência do mosquito aos inseticidas
resistência do parasita às drogas
mudanças sociais, políticas e econômicas
(crise energética, inflação, guerras e
instabilidades políticas)
ausência de vacinas que confiram proteção
por longo período
8. 1992- Declaração mundial para o controle
da malária- Conferência Ministerial em
Malária, outubro de 1992,
Amsterdã/Holanda
1998- Roll Back Malaria (Retroceder a
malaria)- campanha global
Diagnóstico precoce
e tratamento rápido
10. O retardo no diagnóstico e no
tratamento é decisivo na
manutenção da transmissão e
gravidade da doença
11. Desenvolvimento de resistência às
drogas antimaláricas
e se espalhou nos últimos 20-30 anos
na eficácia de muitas drogas disponíveis
Cloroquina
≈ antimalárico confiável e disponível
≈ extremamente importante no
passado
≈ hoje é ineficaz em muitas áreas
endêmicas de malária falciparum
12. Outros derivados da quinolina
amodiaquina, halofantrine,
mefloquina
segunda linha de tratamento:
alternativas no caso de
resistência aos esquemas
terapêuticos de escolha ou de
13. artemisinina e seus derivados
(artesunato, artemeter, artemotil,
diidroartemisinina)
descobertos e desenvolvidos na China
transformaram o padrão de tratamento da
malária em várias regiões
são eficazes na diminuição da parasitemia
assexuada e não causam efeitos colaterais
altas taxas de recrudescência, que variam
com a duração do tratamento e a dose total
usada
14. Terapia de Combinação de
Antimaláricos (TCAM)
Recomendação atual da OMS para
conter a ameaça da resistência de P.
falciparum às monoterapias e melhorar o
tratamento
Principalmente, terapias combinadas
baseadas em artemisinina, no máximo
um dia após o início dos sintomas da
doença
15. uso simultâneo de duas ou mais drogas
esquizonticidas com modos de ação
independentes e portanto com alvos
bioquímicos não relacionados
baseia-se no potencial destas combinações
aumentarem a eficácia terapêutica e
também retardarem o desenvolvimento de
resistência aos componentes individuais da
combinação
Terapia de Combinação
de Antimaláricos (TCAM)
16. Não são TCAM
Combinações de drogas como
sulfadoxina–pirimetamina
sulfaleno–pirimetamina
proguanil-dapsona
clorproguanil-dapsona
atovaquone-proguanil
- dependem da sinergia entre os dois componentes e
têm alvos relacionados no parasita
- são considerados como produtos únicos
Terapias com drogas múltiplas que incluem um
medicamento não-antimalárico para aumentar o
efeito antimalárico de uma droga esquizonticida
sangüíneo (por ex. cloroquina e clorfeniramina).
17. TCAM com
artemisinina e derivados
clareamento rápido da parasitemia e resolução rápida
dos sintomas
10 000 vezes o número de parasitos a cada ciclo
assexuado (outros antimaláricos de 100 a 1000 vezes
a parasitemia por ciclo)
são eliminados rapidamente
Se administrados em combinação com compostos que
são rapidamente eliminados (tetraciclinas,
clindamicina), são necessários sete dias de tratamento
mas se administrados em combinação com
antimaláricos eliminados lentamente, três dias de
tratamento são suficientes
As evidências para a sua superioridade em relação às
monoterapias têm sido claramente documentadas
18. Ensaios clínicos de TCAM de
artemisinina
amodiaquina
atovaquone-proguanil
cloroquina
clindamicina
doxicyclina
lumefantrine
mefloquina
piperaquina
pironaridina
proguanil-dapsona
sulfadoxina–
pirimetamina
tetraciclina
ainda se conhece muito pouco sobre
essas interações
19. Mefloquina
arilaminoálcool (4-metanolquinolina)
quimicamente relacionado ao quinino
é administrado oralmente com potente ação
esquizonticida sangüíneo
Não é gametocida nem é ativo contra formas
hepáticas do parasita
recomendada como droga profilática para quem
viaja a áreas com risco significante de malária
falciparum resistente à cloroquina
MEFLOQUINA QUININO
F
F
F
F
F
F
N
N
N
HN
HO
HO
O
20. Mefloquina
ativo contra P.falciparum resistente às 4-
aminoquinolinas (cloroquina e drogas
relacionadas) e combinações de sulfa-
pirimetamina; também é ativo contra P. vivax e P.
malariae e muito provavelmente contra P. ovale. O
que reduz o risco de morbidade e mortalidade
devido a erros diagnósticos de especiação,
principalmente se o erro for em relação ao não
diagnóstico da infecção por P. falciparum
tem ação sinergística com os derivados da
artemisina, o que também justifica a sua utilização
como droga de combinação à artemisina em TCAM
21. Mefloquina
Tem uma meia-vida longa (14 a 28 dias) e
consequëntemente mantém concentrações sub-
terapêuticas no sangue também por mais tempo, o
que favorece o surgimento de resistência,
principalmente em áreas de alta transmissão
altamente ligada a proteínas plasmáticas (~98 %) e
é largamente distribuída pelo corpo
bem absorvida no trato gastrintestinal, mas existe
uma variação inter-individual no tempo requerido
para alcançar o pico de concentração plasmática
É metabolizada no fígado e excretada
principalmente na bile e nas fezes
22. Uso da mefloquina em
TCAM com artemisinina
??? Interações farmacocinéticas e metabólicas
potenciais das drogas e implicações para o uso
clínico
pouca informação sobre o metabolismo da MF
em humanos
principal metabólito circulante da MF:
carboximefloquina (concentrações >>>
composto original), parece não ter ação
antimalárica significante
Outro metabólito: hidroximefloquina
23. Avaliação da
resposta terapêutica
Métodos in vivo de assessoramento da eficácia
terapêutica e estudos in vitro da
suscetibilidade do parasito às drogas em
cultura, genotipagem molecular para
marcadores de resistência validados
Propriedades farmacocinéticas e
farmacodinâmicas (tolerabilidade, padrão dos
efeitos adversos, velocidade da resposta
terapêutica)
Resultados de ensaios clínicos
Custo (importante a ser considerado na política
e prática de tratamento)
24. Ensaios in vitro e in vivo
de avaliação da terapêutica
refletem apenas a reação do parasito ao
medicamento e não permite avaliar a
resposta imune e as condições fisiológicas e
de saúde do hospedeiro
nem sempre coincidem
25. Outros fatores podem influenciar na
eficácia do tratamento
qualidade do medicamento
dose e via de administração
processos farmacocinéticos
rota metabólica de biotransformação
genética do hospedeiro
resposta imune do hospedeiro
estado nutricional e de saúde do hospedeiro
26. Rota metabólica de
biotransformação
série de enzimas não integradas nas vias do
metabolismo energético ou intermediário do
organismo e cujos substratos são os
xenobióticos (compostos químicos que não
fazem parte da composição normal deste
organismo)
sua função é converter os xenobióticos em
moléculas mais polares, mais hidrossolúveis e,
portanto, mais facilmente excretáveis
pode gerar compostos mais ativos que o
medicamento original e outros com pouca ou
nenhuma atividade ou de mais rápida excreção
27. Fases da biotransformação
• fase 1: ocorrem reações de oxidação, redução
ou hidrólise que modificam os xenobióticos e os
convertem em produtos mais hidrossolúveis,
graças ao aparecimento de novos grupos
funcionais de caráter polar (hidroxila, amina,
carboxila)
• fase 2: ocorre a combinação dos metabólitos
gerados pelas reações da fase 1 com
moléculas endógenas de caráter polar para
formar produtos de conjugação que são
rapidamente excretados
28. Enzimas de de biotransformação
da fase 1
• capazes de transformar múltiplos
substratos e catalizar reações diferentes
• têm natureza muito diversa, ex.: enzimas
com atividade monooxigenase (Citocromo P-
450, flavina monooxigenase), diversas
oxidases (álcool desidrogenase, aldeído
desidrogenase, amino oxidases,
aromatases), epóxido hidrolase ou
esterases e amidases hepáticas e
plasmáticas
29. • CYP-450 é o que tem sido mais estudado- responsável
pela fase 1 do metabolismo de mais de 50% dos
xenobióticos existentes
• também chamado de sistema de oxidases microssomais
• maior parte da biotransformação de muitos
medicamentos antimaláricos ocorre no fígado com a
participação do CYP-450
• Variações na atividade de uma ou de várias das enzimas
deste complexo podem fazer com que o medicamento
não se converta à sua forma ativa ou que sua conversão
seja tão rápida que conduza à sua rápida excreção
Complexo enzimático do
Citocromo P450 (CYP-450)
30. Citocromo P-450 (CYP-450)
• nome dado por Ronald Estabrook, quando em
1961 observou um pico no espectro de
absorção a 450 nm em extratos de fígado na
presença de monóxido de carbono
• nos anos 60 e 70 descobriu-se sua importância
no metabolismo de esteróides e substâncias
xenobióticas
• estudos da estrutura, funções e diversidade do
P-450 foram dificultados pela sua natureza de
proteína hidrofóbica associada às membranas
31. Fatores que podem inibir ou induzir a
atividade do CYP-450
• polimorfismo genético
• desnutrição
• deficiência de micronutrientes
• processos infecciosos e inflamatórios
• consumo simultâneo de outros
medicamentos
32. Complexo enzimático CYP-450
• 114 enzimas (em diversos tecidos e órgãos,
principalmente nas membranas microssomais do
retículo endoplasmático liso do fígado)
• Muito versátil funcionalmente (cataliza vários
processos e metaboliza vários substratos)
• Principal participação em oxidações, mas também
catalizam reduções, hidratações ou hidrólise
oxidação do substrato
Polaridade
capacidade de excreção
solubilidade em água
Precursores se convertem
em metabólitos que podem
ou não ter uma maior
atividade farmacológica
33. As enzimas do CYP-450 -hemoproteínas
compostas de quatro elementos
• um grupo protéico heme do tipo da
ferroprotoporfirina IX, no qual o átomo de
ferro se encontra no estado férrico (Fe3+);
• uma cadeia polipeptídica codificada por
apenas um gene, cujas variações originam as
diferenças de uma enzima para outra;
• uma enzima flavoproteína dependente de
NADH;
• o citocromo b5, relacionado com o transporte
do segundo elétron na oxidação catalizada
pelo sistema CyP-450
34. CYP-450
• As seqüências de aminoácidos entre os
diferentes CYP-450 são pouco semelhantes,
menos de 20% de similaridade em alguns
casos
• porção C-terminal da molécula é mais
conservada que a porção N-terminal
• regiões mais polimórficas estão nas
porções intermediárias
35. Nomenclatura do CYP-450
Família: enzimas com homologia estrutural
de 35 a 40% e se representa por um número
arábico, por ex., CYP1, CYP3. Existem
cerca de 270 famílias entre os seres vivos, e
destas 18 estão presentes em humanos
Subfamílias: enzimas com uma homologia
de 65 a 70%, se identificam pela adição de
uma letra maiúscula, por exemplo, CYP3A,
CYP2C. Subfamília CYP3A é a mais
abundante em humanos e desempenha
um papel importante no metabolismo de
cerca da metade dos medicamentos
A adição de um número arábico em itálico=
o gene que codifica uma enzima, (ex.,
CYP2C8, CYP2D6, CYP3A436). Cada um dos
polipeptídeos que codificam os CYP,
procede de um transcrito primário do gene
que pode, em alguns casos, ser processado
de modo alternativo, produzindo diferentes
mRNA e por conseguinte diferentes
proteínas, que podem ter diferentes
capacidades de reconhecimento e catálise
dos substratos oxidáveis.
36. Polimorfismos do CYP-450
• variantes alélicas de cada um dos polipeptídeos
que codificam os CYP
• variantes alélicas sã indicadas com asterisco
depois do número e um outro número posterior
para identificar a variante, CYP2C9*1
• Alguns CYP têm variantes alélicas mais abundantes
dependendo das populações e etnias e estes são
considerados em estudos de farmacogenética
• Dados dos polimorfismos do CYP-450 são
importantes para interpretar o efeito de diferentes
transformações metabólicas e são a base da
farmacogenômica, toxicogenômica, genômica de
câncer, genômica de desenvolvimento, etc.
37. Enzimas do Citocromo P-450 envolvidas no
metabolismo das principias drogas
antimaláricas
Droga Citocromo P-450
Amodiaquina CYP2C8
Artesunato CYP2A6
Cloroquina CYP2C8, CYP3A4, CYP2D6
Halofantrina CYP3A4
Mefloquina CYP3A4
Primaquina CYP1A2 e CYP2D6
Proguanil CYP2C19 e CYP2A4
Quinino CYP3A4, CYP1A2
38. envolvimento da subfamília CYP450 3A na
biotransformação da mefloquina
• Aumento do metabolismo da MF em microssomas
hepáticos de ratos pré-tratados com dexametasona
e também em hepatócitos humanos e ratos após
tratamento prévio com indutores de CYP450 3A.
• a biotransformação da mefloquina em hepatócitos
humanos induzidos com rifampicina foi inibida de
modo dependente da concentração pelo
cetoconazol, um inibidor específico bem
estabelecido de CYP450 3A
• forte correlação entre a atividade da eritromicina-
N-demetilase (mediada pelo CYP450 3A) e o
metabolismo da mefloquina em microssomas
humanos (eritromicina é um potente inibidor de
CYP3A)
39. Como muitos outros xenobióticos são
metabolizados pela subfamília CYP3A, o
envolvimento desta na biotransformação da
MF possibilita numerosas interações droga-
droga, o que pode ter conseqüências
importantes in vivo especialmente no que
diz respeito à escolha de drogas a serem
usadas em combinação na TCAM
40. Fatores que podem afetar a atividade do
CYP-450
•Variação genética das enzimas do CYP-450
•Própria doença
•Demora em procurar tratamento
•Administração em doses subótimas do
medicamento (ou seja pela quantidade de
medicamento ou pelo tempo de tratamento)
•Deficiências da absorção ou da ligação do
princípio ativo às proteínas plasmáticas
•Conversão insuficiente da forma ativa
•Excreção excessiva do composto
•Alterações metabólicas
Fatores
do
hospedei
ro
41. Fatores que podem afetar a atividade do
CYP-450
•Baixa qualidade dos fármacos
•Propriedades físico-químicas
•Interação com outros
Fatores do
medicamento
•Espécie
•Metabolismo
•Resistência ao medicamento
•Mutações genéticas
Fatores do
parasito
•interações entre o fármaco e os
alimentos
•Grau de imunidade antimalárica do
paciente
•Estado de saúde geral e nutricional
Fatores da relação
hospedeiro-
medicamento-
parasito
42. Variações genéticas no citocromo P-450
• Variações genéticas na atividade de enzimas e
transportadores responsáveis pela absorção,
distribuição, metabolismo e excreção de
drogas são a base de muitos exemplos de
diferenças interindividuais na resposta à
drogas.
• Metabolismo e “clearance” muito rápidos
tornam uma droga ineficaz enquanto
metabolismo lento pode levar a níveis
excessivos e potencial acúmulo,
freqüentemente associados com efeitos
adversos e toxicidade
43. O CyP-450 apresenta uma grande
variedade genética
foram descritas variantes nos genes:
CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2A6,
CYP2A13, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9,
CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4 e
CYP3A5, etc.
44. Família CYP3
• tem uma única subfamília em humanos, a CYP3A,
que contém quatro membros, CYP3A4, CYP3A5,
CYP3A7 e CYP3A43
• é uma das mais importantes na biotransformação
dos medicamentos
• Todos os genes se encontram no cromossoma 7
• O CYP3A4 e o CYP3A5, são os citocromos
mais abundantemente expressos no fígado e em
todo o trato gastrintestinal
45. Objetivo #1.Investigar a prevalência de
polimorfismos do CYP-450 em pacientes com
malária falciparum em tratamento com MF e
internados em hospital
• PCR-RFLP (Polymerase chain reaction-
restriction fragment lenght polymorphism)
• Detecção de polimorfismos nas enzimas do
CYP-450, CYP3A4, CYP3A5, CYP2C9,
CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1
46. Objetivo #2.Determinar o tempo de
clareamento da parasitemia e do DNA de
P.falciparum no sangue de cada paciente
• Amostras de sangue foram colhidas nos
tempos 0, 48h, 7,14,21,28,35 e 42 dias de cada
paciente com malária falciparum em
tratamento com MF e mantidos internados em
hospital
• gota espessa (tempo de clareamento da
parasitemia- TCP)
• Nested-PCR para determinação qualitativa do
tempo de clareamento do DNA (TCD) de
P.falciparum.
• Real Time PCR para quantificação do DNA de
P.falciparum
47. Objetivo #3.Analisar a associação dos
polimorfismos do CYP-450 com a resposta
terapêutica à MF
• Os resultados da ocorrência de
polimorfismos do CYP-450 serão analisados
em função do TCP, TCD e tempo de
clareamento da febre (TCF) (dados
disponíveis de todos pacientes) e níveis
plasmáticos da MF (dados disponíveis
apenas de alguns pacientes).
• Os pacientes serão divididos em bons e
maus respondedores à MF
49. Indivíduos da pesquisa
critérios para inclusão dos pacientes:
▫ indivíduos com infecção por P.falciparum
diagnosticada por gota espessa, com menos que
100.000 parasitas/mm3
▫ sexo masculino
▫ idade entre 18 e 60 anos
▫ não uso de drogas antimaláricas nos 7 dias
precedentes à internação
▫ nenhuma evidência de complicações clínicas, tais
como envolvimento renal ou cerebral
▫ consentimento pós-informado
50. métodos
• Extração do DNA genômico com
Fenol/Clorofórmio
• “Semi-Nested” PCR para a
detecção de plasmódios (Kimura
et al.,1997)
• Real time-PCR para
quantificação do DNA
56. Polimorfismos CYP3A*1B -392 e tempo de
clareamento da parasitemia
por P. falciparum
Polimorfismo
CYP3A*1B -392
TCP Estatística
≤ 48h
(n=63)
> 48h
(n=27)
χ2 P OR [95%
CI]
Genótipo A/A
A/G
G/G
48 (0,76)
11 (0,17)
4 (0,06)
13
(0,5
)
11
(0,4
)
3 (0,1)
6,8
a
0,00
5
3.4
[1,3-8,9]
Alelo A
G
107 (0,85)
19 (0,15)
37
(0,7
)
17
(0,3
)
6,3
a
0,00
6
8.1
[1-6,5]
a A/A vs A/G+G/G
OR: odds ratio; CI: intervalo de confiança
57. Polimorfismo
CYP3A*1B -392
TCD - snPCR
≤ 7d
(n=16
> 7 d
(n=71)
p OR
[95%
CI]
Genótipo A/A
A/G
G/G
15 (0,94)
1 (0,06)
0
44 (0,62)
20 (0,28)
7 (0,10)
0,032 8,1
[1-65]
Alelo A
G
31 (0,97)
1 (0,03)
108
(0,76)
34 (0,24)
0,004 9,7
[1,3-74]
Polimorfismos CYP3A*1B -392 e
tempo de clareamento do DNA de P.
falciparum
58. Faculdade de Medicina
da USP
• Rui Rafael Durlacher
• Crispim Cerutti Jr.
• Filomena
Walter Reed Institute
• Lorin Pang
IMT
•Fabiana M. S. Leoratti
•Thaís
•Lilian de Farias
INCOR
•Rajendranath Ramasawn
•Jorge Kalil