UCGo Microbiologia I: Coleta de Amostras

Universidade Católica de Goiás

UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS

CURSO DE BIOMEDICINA
MICROBIOLOGIA I

Profa. CLÁUDIA MARIA DUQUE DE SOUZA
Profa. EDLAINE RODRIGUES MONTALVÃO

Profa. Cláudia Maria Duque de Souza


Curso: Biomedicina
Disciplina: Microbiologia I
Professora: Cláudia Maria Duque de Souza

PROGRAMA:

1- Objetivo geral:

A disciplina Microbiologia I visa, fundamentalmente, demonstrar as
técnicas bacteriológicas, princípios dessas técnicas, identificação dos
gêneros e espécies e suas patologias, bem como capacitar o estudante
para a pesquisa e reconhecimento desses microrganismos.

2- Objetivos específicos:

Habilitar o aluno de bacteriologia para a pesquisa, reconhecimento e
diferenciação dos microrganismos normais e patogênicos nas diferentes
partes do organismo humano, tais como: orofaringe, pele e anexos,
aparelhos auditivo, visual, gastrointestinal e genito-urinário.

Profa. Cláudia Maria Duque de Souza e Edlaine Rodrigues Montalváo.
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MICROBIOLOGIA I - CBB 3641 - 4 CRÉDITOS

CONTEÚDO:

01 - Normas de coleta, transporte e armazenamento das amostras das
diferentes áreas anatômicas.
02 - Microbiota
03 - Urinocultura.
04 - Coprocultura.
05 - Antibiogramas (TSAQ)
06 - Cultura de escarro.
07 - Cultura de exsudato de orofaringe.
08 - DST (Gonorréia, Sífilis).
09 - DST (Cancro mole, LGV e Donovanose).
10 - Cultura de exsudato do aparelho da visão.
11 - Cultura de lesões cutâneas e anexas.
12 - Diagnósticos laboratoriais da Hanseníase
13 - Hemocultura e Líquidos corporais.

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BIBLIOGRAFIA

01. Jawetz, Ernerst. Microbiologia Médica. Guanabara Koogan.
02. Bier, Otto. Microbiologia e Imunologia. Melhoramentos.
03. Pelczar, Reid e Chain. Microbiologia Vol I e II. McGraw-Hill do Brasil.
04. Moura. Microbiologia Clínica. Mc Will Editores.
05. Korting e Gunnter. Dermatologia. Editora Manole.
06. Cecil. Tratado de Medicina Interna. Guanabara Koogan.
07. Dowell, Allen e Koneman. Diagnóstico Microbiológico. Panamericana.

08. Neto, Amato e V. et al. Antibióticos na prática médica. Gnemed.
09. Parage, R. Microbiologia Clínica. Panamericana.
10. Miname. Micologia, Diagnóstico Laboratorial das Micoses.
11. Reese, Richard E, Sentochnik, Deborah E., Douglas Jr, R. Gordon e
Betts, Robert F. Manual de Antibióticos.
12. Roitman, Isaac, Travassos, Luiz R. e Azevedo, João Lúcio. Tratado de
Microbiologia.
13. Mac Faddin. Pruebas bioquimicas para la identificacion de bactérias de
importância clínica. Panamericana.
14. Lennete, Balows, Hausler e Shadony. Manual de Microbiologia Clínica.

15. Hentges, David J. Medical Microbiology.
16. Fundemberg, Hugh. Microbiology and Imunology, a positive statement
manual. Guanabara Koogan.
17. Delost, Danessa Maria. Introduction to diagnóstic Microbiology, Mosby,
1997.
18. Rowland, S. Sharon. Pathogenic and Clinical Microbiology. Little,
Brown and Company, 1994.
19. Crissey, Thorne John, Manual of Medical Micology. 1995. Blackwell
science.
20. Tagliavini, Ruggero. Novo Atlas prático de Dermatologia e
Venereologia. 1995, Santos.
21. Konneman, Elmer. 5ª edição. Color Atlas - Diagnostic Microbiology,
1997, Lippincott.
22. Dwight R. Johnson. Laboratory of diagnostic of Group A Streptococcal
infections. WHO (Organização Mundial de Saúde).
23. Chung, Kwon J. K. Medical mycology. 1992. Lea & Fabiger.
24. Zaitz, Clarisse. Atlas de Micologia. 1995. Medsi.

Artigos da Internet
Periódicos: Revista Laes Haes, Mc Will Editores, News Lab,
ARSCVRAND, JAMA, Arquivos de Dermatogia (JAMA).

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AULA 01

COLETA, TRANSPORTE E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS.

É a parte mais importante no isolamento do microorganismo que é
responsável pelo processo infeccioso. Uma coleta mal feita resulta no insucesso
da pesquisa do real agente etiológico da doença. Quando há contaminação na
coleta, por exemplo, com microorganismos da flora normal, pode gerar uma
terapia incorreta tratando-se o germe contaminante e não o causador da
doença. Por exemplo, num caso de pneumonia causada por Klebsiella
pneumoniae, se a coleta for feita erroneamente (só na saliva e não no escarro),
a terapia antibiótica estará inadequada.

A amostra clínica deve ser material do verdadeiro local da infecção e
colhida com o mínimo de contaminação. Deve-se ter cuidado com a
contaminação do escarro pela saliva, com a coleta de exsudatos de feridas para
não tocar na pele adjacente, com a contaminação da amostra de endométrio
com secreção vaginal e um cuidado especial com a limpeza do tecido
parauretral e períneo antes da coleta de urina. Outro problema é a
impossibilidade de atingir abcessos profundos sem agulhas e cânulas. Deve-se
estabelecer períodos ótimos para coletar as amostras para proporcionar um
maior acerto no isolamento dos agentes causadores, mas, para isso é
necessário conhecer a fisiopatologia dos processos infecciosos.

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* Hemocultura - segunda semana;

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* Urocultura - segunda ou terceira semana de infecção;

* Coprocultura - Salmonella tiphy = diarréia aguda;

* Soro - os anticorpos aumentam na segunda semana, mas com pico na quinta
semana.

A urina das pessoas normais pode ser inibitória ou bactericida para
alguns microorganismos quando o seu pH é igual ou menor do que 5,5 e
quando há aumento da osmolalidade ou da concentração (densidade).

As novas técnicas para urina e escarro possibilitam os usos de pequenos
volumes do material proporcionam um resultado fidedigno (tratando-se de
micobactérias), com pouca interferência de contaminantes e dispensando as
longas coletas de 24 horas.

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A quantidade de material deve ser suficiente para a boa execução da
técnica usada; observar que nas formas agudas há abundância de exsudatos,
porém, nas crônicas, há escassez.
Cuidado som os swabs secos, isto é, com pouco material; pode ser desperdício
de material do laboratório e do paciente. O melhor procedimento é retirar outra
amostra e fazer uma declaração sobre as condições da amostra que foi
enviada.
No caso de escarro, 0,5 mL é pouco para toda a rotina (pesquisa de BAAR e
cultura), além de poder não conter secreções pulmonares dos locais certos.

Dispositivos de coleta, recipientes e meios de cultura devem ser
rigorosamente esterilizados para que se chegue a um ótimo isolamento.
Os frascos para urina e escarro devem ter a boca larga, para não haver
contaminação do frasco, e tampa firme para não haver vazamento do material
no transporte.
Recomendam-se os swabs com pontas de alginato de cálcio, dracon ou
poliéster porque o algodão pode ter ácidos graxos que impedem certas
bactérias sensíveis.
Deve-se respeitar o tempo de contato entre o swab e amostra; os swabs de
orofaringe devem ser colocados em meios de transporte para que não
ressequem e provoquem a morte bacteriana.

RECIPIENTES PARA TRANSPORTE DAS AMOSTRAS

Existem no mercado várias opções, uma delas é o Culturette (ampola de
vidro com meio de Stuart para transporte), que assegura a umidade e conserva
a amostra por 24 horas.
Outro meio de transporte é o de Amies que é semi-sólido
Para a coleta de anaeróbios não se usa swabs, mas sim agulhas e
seringas para aspiração. As amostras devem ser protegidas do oxigênio e da
dissecação.
Alguns materiais para anaerobiose disponíveis no mercado são o Anaerocult da
Merck®, Anaerobac da Probac® e os Tubos de Scott ( dois tubos de onde foi
retirado o oxigênio e colocado o CO2, um dos tubos tem um swab adaptado à
tampa e o outro é lacrado). Para a coleta de anaeróbios obrigatórios,
microaerófilos e anaeróbios facultativos têm-se os tubos mais flaconetes (Port-a-
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cult da BBL® e o Coletor de amostras anaeróbicas da BD [tubo fechado e
saturado com gás].).

Sempre que possível coletar as amostras antes da administração de
antibióticos, a qual irá reduzir a segurança do resultado da cultura
(possibilidade de falso negativo), porém, existem microorganismos que têm o
seu crescimento normal mesmo em presença de antibióticos.
Há casos nos quais vários antibióticos da terapia têm ação bacteriostática e ,
quando colocamos a amostra em meios frescos (líquidos), com CIM
(concentração inibitória mínima) de antibióticos, abaixo da concentração
existente no local da infecção, o isolamento não fica problemático.

Para um bom desempenho dos exames bacteriológicos existem certas
regras de cadastramento do paciente que devem ser observadas:
O recipiente deve ser rotulado de maneira legível e contendo todas as
informações completas sobre o paciente, tais como:

# Numeração do exame;
# Médico;
# Data e hora;
#Local da coleta do material.

Deve-se ter um bom contato com o médico, no caso de precisar de
alguma informação antecipada do quadro do paciente.

TEMPO DE ENTREGA DAS AMOSTRAS:

1) Respiratória: 30 min
2) Gastrointestinal: 1h
3) Hemocultura: 30 min
4) Anaeróbio: 30 min
5) Catéter intravascular: 15 min
6) LCR e líquido pleural
7) Urina: até 1h, se refrigerada
8) Swabs: imediatamente
9) Amostras com anestésicos locais: Imediatamente!!

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AULA 02

FLORA NORMAL

Atualmente, há uma grande motivação para o estudo da ecologia
microbiana, as causas do seu estabelecimento, a sua persistência, bem como o
papel que esta flora representa na movimentação do nosso estado de saúde,
especialmente no que se refere à flora normal do homem. Um estudo mais
profundo da flora autóctone é de difícil execução em virtude de problemas
econômicos e da dificuldade de se chegar a certas regiões do corpo como os
folículos pilosos, glândulas sebáceas, glândulas sudoríparas e vilosidades do
intestino, constituindo um problema técnico o estudo da flora normal destas
regiões.

Nem todas as espécies bacterianas que fazem parte da flora normal são
cultiváveis, podendo estar presente em determinadas áreas do corpo sem
serem recuperadas nas culturas de amostras colhidas; este também não deixa
de ser um problema técnico de isolamento dessas bactérias autóctones. Assim,
conclui-se que o estudo da flora normal ainda é um campo muito amplo de
observações e discussões.

Durante o processo de nascimento a pele, nariz, boca e conjuntiva
tornam-se infectados por organismos adquiridos na passagem pelos genitais
maternos. Após poucas horas do nascimento, os microorganismos já estão
proliferando dentro do trato alimentar, nas superfícies externas desse e de
outros tratos (por exemplo, do trato urogenital) e na superfície externa (pele e
mucosas), aonde estabelecem residência.
Os tecidos possuem mecanismos naturais e eficientes de defesa que restringem
os microorganismos às áreas nas quais eles podem ser tolerados; quando
essas defesas são vencidas e as bactérias têm acesso aos tecidos
normalmente infectados, geralmente, ocorre a doença. A disseminação desses
organismos autóctones dá-se por manuseio, perdigotos e pela respiração.

Os conceitos de patogenicidade e virulência, atualmente, são
considerados sinônimos e refletem a capacidade de espécies bacterianas de
penetrarem nas defesas do hospedeiro. Algumas espécies coexistem com o
hospedeiro de forma pacífica, mas, em determinadas circunstâncias, tornam-se
claramente patogênicas, vencendo rapidamente as defesas do hospedeiro e
produzindo doenças logo que chegam ao local.
A patogenicidade dos microorganismos depende de fatores que variam com o
gênero e as espécies do germe, e mesmo com as suas diferentes estirpes.
Existem espécies altamente patogênicas para uma espécie animal e não
patogênicas para outros animais, ou mesmo para o homem, devido à sua
capacidade invasora ou então à sua toxicidade. A sua capacidade invasora
resulta do poder de escapar da destruição causada pelas células fagocitárias,

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ou da capacidade de produção de enzimas bacterianas que facilitam a
penetração das bactérias nos tecidos.

PELE E MUCOSAS:

Constituem barreiras físicas que são relativamente impermeáveis às
bactérias. O pH ácido (3 a 5) da pele, devido a produtos do metabolismo
bacteriano, inevitavelmente dificulta o crescimento de muitos microrganismos
que chegam a esta superfície. Os ácidos graxos da pele matam muitas bactérias
patogênicas como o S. pyogenes, mas, por outro lado, estimulam o
crescimento de outros difteróides.
A lágrima e a saliva têm lisozimas que arrebentam a camada
mucopeptídica de várias bactérias.

A acidez da mucosa vaginal (pH de 4 a 4,5) é devida ao crescimento dos
lactobacilos. O aparelho respiratório também contém uma série de defesas
escalonadas contra microrganismos (reflexo epiglótico, aderência de muco na
árvore respiratória, cílios e epitélio respiratório e tosse).

A pele é considerada, porém, um ecossistema pouco favorável,
restringindo-se, assim, a um número muito pequeno de espécies.
Tem como componentes aeróbios: S. epidermides, S. pyogenes, outros
Streptococcus, Difteróides lipolíticos (axilas), Difteróides não lipolíticos,
Acinetobacter e Alkaligenes (Gram negativos, presentes em regiões úmidas
como axilas e pés); anaeróbios: Lactobacilos anaeróbios (glândulas sebáceas),
Propioniobacterum acne.

A maioria das bactérias vive nas camadas superiores da camada córnea
da pele e parte superior dos folículos pilosos, sendo que 20% dessas bactérias
não são alcançadas por desinfecção de pele. Esta barreira constitui um
reservatório que permite rápido reestabelecimento da flora superficial após a
sua remoção por meios artificiais. Há um aumento no número de bactérias de
superfície imediatamente após o banho, seguido de uma diminuição até os
níveis normais nas próximas duas horas. Isto ocorre porque durante o banho há
uma maior exposição da camada córnea da pele. Os locais da pele mais
habitados por bactérias são as axilas e os espaços interdigitais.

Os fatores climáticos também influenciam na constituição da flora da
pele; no inverno há um predomínio de Micrococcus e no verão de Difteróides.
Se a pele for abafada (vedada) há um provável aumento no pH e conseqüente
aumento dos Difteróides.

A quantidade de lisozimas na pele é suficiente para afetar a ecologia dos
microorganismos nela presentes, mas a fonte dessas enzimas é, ainda,
desconhecida.

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Os cocos residentes da pele são insensíveis à atividade lítica desta enzima, mas
a invasão por bactérias patogênicas talvez seja dificultada.
Os ácidos graxos da pele que inibem, in vitro, os Micrococcus, spp; S. pyogenes
e S. aureus, não inibem Pseudomonas aeruginosas nem a E. coli. O ácido
oléico estimula o crescimento, in vitro, de cepas lipolíticas de Difteróides
cutâneos e Propioniobacterium acne. Sommer Ville sugeriu que as variações da
microflora das crianças, quando comparada com os adultos, podem acontecer
por causa das baixas concentrações de ácidos graxos livres na pele dessas
crianças.

Os Staphylococcus coagulase negativa e outros Micrococcus podem
dominar a pele em virtude das bacteriocinas (antibióticos bacterianos) e outros
inibidores que eles produzem.

FLORA NORMAL DO OLHO:

As bactérias do olho são similares àquelas encontradas na pele (há
relação entre o S. aureus na pele e a sua presença no olho) e vias aéreas
superiores, além das bactérias Gram negativas mais comuns do TGI que
também são isoladas nos olhos; mas as bactérias encontradas normalmente no
ar são, raramente, isoladas no olho.
Acredita-se que os cílios tenham um papel importante na manutenção da flora
do olho; acredita-se também que os olhos nunca estão desprovidos de
Staphylococcus porque a fonte de contaminação está sempre presente. Não
existe diferença entre a flora ocular de homens e mulheres e não há
modificação da flora com a idade do indivíduo, exceto um aumento no número
de Difteróides em indivíduos com 50 anos ou mais (Corynebacterium xerosis).

OUVIDO:

O canal auditivo externo reflete a flora da pele, sendo que Pseudomonas
aeruginosas e S. pneumoniae também têm sido isolados. O ouvido médio e o
interno são estéreis e qualquer bactéria provoca infecção.

TRATO GENITO URINÁRIO:

A sua flora varia com as diferentes áreas.
A genitália externa masculina não é muito seletiva e a flora inclui Gram
negativos, com predominância de bacilos fusiformes, espiroquetas e
Micobacterium smegmatis.

A flora da vagina varia com a idade da paciente. Os fatores fisiológicos,
como os hormônios ou o glicogênio na mucosa vaginal (que é controlada por
estrogênios e progesterona), são responsáveis pela acidez vaginal. Essa
mesma acidez predomina no nascimento devido ao hormônio materno e,
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quando o estrogênio torna-se ativo, há uma intensa descamação do epitélio e
um grande depósito de glicogênio. O pH da vagina gira em torno de 4 a 5 e a
flora é rica em Lactobacillus acidophylus.
Na infância e menopausa o pH é básico (em torno de 6 a 7) e a flora
predominante é de cocos.
Na gravidez há um grande depósito de glicogênio. Recentemente, foi
demonstrado que a ação dos lactobacilos sobre o glicogênio da vagina é
específica de algumas estirpes que agem somente sobre o glicogênio humano.
Existe diferença entre a flora da vagina externa, paredes vaginais, fundo de
saco de Douglas e colo de útero.

São componentes da flora vaginal: Haemophilus vaginalis, Difteroides,
Mycoplasma, spp; Lactobacillus, spp; Coliformes, Streptococcus, spp aeróbios,
S. faecalis anaeróbios e S. aureus. Neisseria gonorrheae pode estar presente
em portadora.

TRATO GASTRO INTESTINAL:

É estéril ao nascimento.
No adulto existe entre 10 elevado a 5 e 10 elevado a 10 de bactérias por
grama de fezes no intestino delgado e 10 elevado a 11 no intestino grosso. O
esôfago e o estômago estão contaminados com bactérias provenientes dos
alimentos ingeridos, mas estas bactérias não sobrevivem nestas partes do trato
gastrointestinal. O estômago não é adequado ao crescimento de
microrganismos devido à grande acidez do suco gástrico e à própria motilidade
do órgão, que o esvazia em intervalos periódicos; nele, há uma reflexão da flora
dos alimentos e saliva, porém, como floras residentes podem considerar
algumas bactérias esporuladas e lactobacilos. O Mycobacterium gastri provoca
bacterioscopia duvidosa com TB quando é analisado no suco gástrico.
O fígado e vesícula são, geralmente, livres de contaminação bacteriana.

Nos níveis mais inferiores do TGI há um aumento do número de bactérias
de cada espécie, atingindo o máximo no intestino grosso, sendo que nesses
níveis também são encontradas as bactérias anaeróbias.

Os principais germes da flora fecal são: os bacterióides
(Corynebacterium, sp), Lactobacillus acidophylus, Clostridium, sp (C. perfringes)
e Streptococcus faecalis.

A flora normal do TGI foi recentemente estudada e verificou-se uma
diferença na composição de acordo com a área geográfica, com a fisiologia e
dieta do paciente.

O intestino delgado superior, geralmente, é estéril ou contém poucos
germes; quando há uma gastroenterite aguda (crianças ou adultos) há um
aumento na sua flora normal, principalmente de E. coli (que provoca diarréia
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pela ação da exotoxina), o que irá provocar um desequilíbrio eletrolítico. Para o
controle da E. coli as colicinas podem ser consideradas importantes, porém,
fatores que controlam a espécie dominante, Bacterioides fragilis, ainda não
foram definidos.

CAVIDADE ORAL:

A boca pode ser considerada um ambiente uniforme. Porém, nela há
diferentes nichos ecológicos que se alteram com o tempo durante a vida. É o
local de maior variação de microrganismos (ex. dorso da língua, sulcos
gengivais, placas dentárias). A contagem de microrganismos totais da saliva é
igual a 4 - 5,5 bilhões/ml, com uma média de 750 bilhões.

O feto é, normalmente, estéril “in útero”. Durante o nascimento a criança
é contaminada pela flora do trato genital materno (Lactobacillus,
Corynebacterium, Micrococcus, Enterobactérias, Streptococcus,
Peptostreptococcus, leveduras, protozoários e vírus). Apesar disso ainda é
estéril ao nascimento e, de 6 a 10 horas após o nascimento, torna-se bem
variada por algum tempo.

Na idade de 0 a 1 ano as bactérias que predominam são: Streptococcus,
Staphylococcus, Lactobacillus, Neisseria catharralis, Veilonella, Nocardia,
Actinomicetos, Escherichia, Fusobacterium, Bacterioides, Leptotrichia e
leveduras.

A presença de dentes não é necessária para a instalação de bactérias
filamentosas (Fusobacterium, Actinomyces, Leptotrichia).

O Streptococcus sanguis se estabelece após erupção dentária. As cáries
também fornecem novos substratos e um pH ácido, além de dificultar a
exposição de microrganismos aos agentes antimicrobianos da saliva. A placa
dentária contém Streptococcus, Neisseria, Veilonella, Actinomyces e Gram
negativos.

O pH da saliva ( 5,7 - 7,0) parece ter importância na manutenção da flora
normal.
Outros fatores para a manutenção desta flora são as vitaminas do complexo B e
a mucina juntamente com carboidratos.

Os Lactobacillus,spp são em pequeno número e só aumentam na
presença de cáries ou má higiene bucal (correlação positiva entre cáries e
lactobacilos).

BOCA:

Actinomyces, spp
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Bacterioides, spp
Moraxella catharralis
Candida albicans e outras leveduras
Campylobacter, spp
Entamoeba gengivalis
Fusobacterium, spp
Haemophilus, spp
Lactobacillus, spp
Leptotrichia, spp
Micrococcus, spp
Mycoplasma, spp
N. meningitidis
Peptostreptococcus, spp
S. aureus
S. epidermides
S. pneumoniae
S. faecalis
S. mitis e S. salivarius ( alfa hemolítico)

NASOFARINGE:

Acinetobacter, sp
Moraxella catharralis
Haemophilus, spp
Moraxela, spp
N. meningitidis
S. aureus
S. epidermides

AMIGDALAS:

Actynomices, spp
Bacterioides, spp
Fusobacterium, spp
Micrococcus, spp
S. aureus
S. epidermides
S. pneumoniae
S. faecalis
Veillonella, spp

NARIZ:

Corynebacterium, spp
Moraxela, spp
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N. meningitidis
S. aureus
S. epidermides
S. pneumoniae
S. faecalis
S. pyogenes (portadores sãos)

OROFARINGE:

Bacterioides, spp
Candida albicans
Enterobacterias
Haemophilus, spp
S. pneumoniae
Streptococcus hemolíticos

DENTE:

Leptotrichia buccalis

SALIVA:

Lactobacillus, spp.

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AULA 3

URINOCULTURA
COLETA:

Normalmente, é feita pelo próprio paciente. Para um isolamento ideal dos
microrganismos causadores da infecção das VGU é necessária uma coleta com
o mínimo de probabilidade de contaminação pelos tecidos adjacentes à uretra; o
ideal seria a coleta com supervisão de um técnico ou enfermeiro bem treinado.

NORMAS:

Cabe a nós instruir o paciente da maneira mais simples para que o
mesmo não erre na coleta e, conseqüentemente, nos livre dos erros de
isolamento.

1. Lavar a área com água e sabão (períneo mais área genital);
2. No caso de mulheres devem-se afastar os lábios vaginais;
3. O frasco deve ser estéril e ter a boca larga para evitar extravasamento dos
jatos para mãos e adjacências;
4. Desprezar o primeiro jato (que traz excesso de bactérias da uretra e não das
VGU em si) e colher o segundo;
5. As instruções devem ser escritas em um cartão a ser entregue ao paciente,
ao invés de serem ditas apenas verbalmente, com o objetivo de evitar uma
interpretação errônea pelo paciente. Se o paciente tiver pouca instrução, faz-se
necessária a leitura e explicação dessas instruções por parte do atendente do
laboratório.

Observar que:
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- a contagem de colônias pode variar de 0 a 100.000 col/mL (ou mais);
- pacientes isentos de infecção das vias urinárias não devem ter bactérias ou ter
no máximo algumas colônias;

- significância - de 0 a 9.000 col. /mL, não tem significado clínico
de 10.000 a 90.000 col./mL, suspeita de infecção
acima de 100.000, início de infecção.
- o isolamento de três ou mais espécies de bactérias indica, na maioria dos
casos, falhas na coleta ou atraso no transporte.
- Punção supra-púbica:
1) Qualquer isolamento de BGN deve ser considerado.
2) Quantidade > 103 UFC/ml de CGP deverá ser considerada.

COLETA PARA MICRORGANISMOS ANAERÓBIOS DA URINA:

Usada principalmente para crianças e em material de adultos que
apresentam sintomatologia, porém com ausência de crescimento nos meios
habituais.

1. Desinfetar a pele da região suprapúbica, localizada sobre a bexiga
(preparação cirúrgica);
2. No local, injetar Lidocaína a 10% por via subcutânea;
3. Fazer um pequeno corte na epiderme e, através deste, injetar uma agulha
espinhal calibre 18 com bizel curto e aspirar 10 mL da urina;
4. Não coletar amostras em bolsa com catéter, exceto em crianças, porque as
pontas do catéter podem conter muitos microrganismos uretrais.

O prazo máximo para que o material, no caso da urina, seja utilizado em
exames é de duas horas, pois, se esse tempo for ultrapassado, há um
crescimento excessivo das bactérias da urina dando um número alterado (para
mais ou para menos).

Quando o paciente mora muito longe (mais de duas horas de distância) o
material deve ser colhido no laboratório ou então deve ser trazido numa caixa
com gelo.
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Os coletores de farmácia e os sacos plásticos devem ser aceitos no caso
de crianças e internos de hospital porque são esterilizados por raios.

MICRORGANISMOS QUE CAUSAM INFECÇÃO NO APARELHO
URINÁRIO:

Enterobactérias (E. coli, Proteus, spp; Klebsiella, spp), Streptococcus do
grupo D (S. faecalis), Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, S.
epidermides, S. saprophyticus.

SINAIS E SINTOMAS:

1. Infecções na bexiga: piúria, disúria, hematúria, dor e tumefação supra-púbica
e de abdomem inferior.
2. Infecção renal: dor lombar e tumefação do ângulo costo-vertebral (ACV).

ENTEROBACTÉRIAS:

São bactérias Gram negativas em forma de bastão com bordas retas.
Suas colônias são grandes, cinza escuras, úmidas e mucóides; as colônias que
crescem como ondas (fenômeno erosivo) sugerem a presença de Proteus, spp.

As enterobactérias fermentam a glicose e produzem ácido no meio,
tornando o TAF amarelo. Uma reação no TAF de ápice e base alcalinos
(vermelho) exclui as espécies bacterianas da família das enterobactérias. São
citocromo-oxidase negativas, reduzem nitratos a nitritos, com exceção do
Enterobacter aglomerans e Erwinia, spp, em 18 a 24 horas nos meios básicos
mais KNO3.
Os meios seletivos para enterobactérias, normalmente, contém sais
biliares em concentrações adequadas com o objetivo de evitar o crescimento
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dos Gram positivos. Se o material que chegar ao laboratório albergar bactérias
mistas (Gram positivas e Gram negativas) pode-se fazer um isolamento destas
bactérias semeando o material em meios não seletivos como o Ágar sangue e
em meios seletivos como o ágar MacConckey, Hektoen, ENDO.

As enterobactérias podem provocar doenças infecciosas nas VGU,
aparelho respiratório (Klebsiella pneumoniae) e em feridas (E. coli).
As bactérias lactose positivas são consideradas patogênicas (E. coli,
Klebsiella,spp; Enterobacter,spp), e são fermentadores lentos Citrobacter,spp;
Providencia,spp; Serratia,spp; Hafnia,spp. No meio seletivo EMB pode-se
observar as colônias fermentadoras de lactose (E. coli produz colônia verde
escura com brilho metálico). Para as amostras gastrointestinais usam-se os
meios ágar SS, Hektoen, XLD (ou ágar SIM).
Os caldos de enriquecimento para enterobactérias são o caldo selenito, caldo
GN e caldo tetrationato.

PRINCIPAIS BACTÉRIAS QUE CAUSAM INFECÇÕES NO TRATO
URINÁRIO

1- Escherichia coli

Existem 171 sorotipos antigênicos somáticos O e ainda são divididas em
sorogrupos baseados nos antígenos K (capsular) e H (flagelar); certos sorotipos
O de E. coli são conhecidos como invasores da mucosa intestinal e outros são
conhecidos como produtores de enterotoxinas termolábeis e termoestáveis. A
transferência de produção das enterotoxinas é dada por plasmídio (Ent.) e,
como exemplo de sorotipos produtores tem-se: O 6; O 8; O 25; O 27; O 148; O
159.
Nas fezes é necessário classificá-las em enteropatogênicas ou
enterotoxinogênicas e invasivas, mas isto só é necessário em infecções
gastrointestinais (coprocultura).

A E. coli é predominante no intestino grosso. É um coliforme produtor de
colicinas. Os testes de ELISA (imunoabsorção ligada a enzima) para as toxinas
termolábeis são positivos.

A patogenia da infecção do trato urinário propaga-se por via
hematogênica e linfática. A E. coli(UPEC) é lactose positiva, CO2 positivo,
lisina positiva (76 a 89 %), indol positivo, motilidade positiva, VP negativo, citrato
negativo e urease negativa. As espécies da taxonomia das enterobactérias
adotada e proposta atualmente são: E. coli; E. hermannii e E. vulneris, E.coli
inactiva(antiga Alkalescences-dispar).

2- Proteus, spp

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A família Proteae tem como espécies de interesse: P. mirabillis, P.
vulgaris (P vulgaris biogrupo 2), P. rettigeri (passou para P.vulgaris
biogrupo 1), P. penerii e P. inconstans.

As Providencia stuarti e Providencia alcalifaciens estão incluídas como
Proteus inconstans. O Proteus morganii foi transferido para o novo gênero
Morganella morganii(subespécie morganii).
Recentemente o nome Proteus penerii foi proposto para o organismo P. vulgaris
indol negativo. O P. mirabillis, P. penerii e P. vulgaris são H2S positivos e podem
ser confundidos com Salmonella, spp.

Os Proteus, no geral, são ureia positivos, fenil-alanina positivos, VM
positivos, H2S positivos e CO2 positivos. Em TAF apresentam-se em colônias
não pigmentadas; em meios seletivos podem ser confundidas com colônias não
fermentadoras de lactose. Forma em ágar sangue um crescimento em véu ou
onda como se fosse uma película. São pleomórficos, não capsulados e móveis.

O P. mirabillis é o mais encontrado em infecções humanas no trato
urinário. Comumente são encontrados em pacientes em antibioticoterapia longa.
O P. vulgaris é, geralmente, resistente à penicilina e à cefalosorina; o P.
mirabillis é sensível à ampicilina e à cefalosporina. Encontram-se na água e solo
em fezes contaminadas.

Os Proteus têm 49 antígenos O e 19 antígenos H. Algumas estirpes têm
o antígeno K (capsular). A reação de Weil Felix utiliza antígenos dos tipos O 1 e
O 2 de P. vulgaris e O 3 de P. mirabillis pode apresentar resultados positivos
para as três espécies, mas especialmente para o P. mirabillis. O P. mirabillis é
mais frequente do que o P. vulgaris, mas ambos estão frequentemente
associados ao Diabetes e anomalias do trato urinário. Em hospitais o P.
mirabillis acomete pacientes cateterizados, pós-cirúrgicos e aqueles que
sofreram instrumuntações urológicas.

Encontram-se na água e fezes contaminadas, sendo que 25 % da
população são portadora de Proteus no intestino. Pode ser encontrado, ainda,
na garganta, olhos, feridas e trato respiratório.

A Morganella morgani também causa infecção urinária e tem sorogrupos
classificados pelos antígenos O e H.

3- Citrobacter, spp

São lactose positiva, motilidade positivos, VM positivos e citrato positivos
(76 a 89 %) como o C. amalonaticus. Citrobacter freudii, C. amalonaticus e C.
diversus são as espécies de interesse, sendo que o C. freudii é a espécie tipo
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que se assemelha à Salmonella e Arizona e é um organismo oportunista no
homem.

4- Klebsiella, spp

São capsuladas, imóveis e isoladas aos pares ou em cadeias curtas. As
colônias são elevadas, viscosas e brilhantes. Nas provas bioquímicas mostram-
se VP positivas (produzem butilenoglicol a partir da glicose), mas existem VP
negativas e VM positivas e também VM positivas. Várias espécies têm
bacteriocinas e causam bacteremia e infecções no trato urinário humano. São
muito encontradas em infecções hospitalares, sendo que todas as espécies são
resistentes à ampicilina.

As espécies que representam o gênero são: K. pneumoniae
(K.pneumoniae subspécie pneumoniae), K. oxytoca (mais no intestino), K.
ozaenae (necrose da mucosa nasal), K. rhinoescleromatis(K.pneumoniae
subspécie rhinoescleromatis)granuloma destrutivo de nariz e faringe), K.
terrigena e K. platicola. São H2S negativas, uréia negativa, femil-alanina
negativas, lisinas positivas e ornitina negativas.
A K. pneumoniae tem 82 antígenos K e 5 antígenos O, mas os antígenos
causadores da pneumonia são os capsulares 1, 2 e 3.

5- Enterobacter, spp

Algumas espécies são capsuladas, são móveis, citrato positivo, CO2
positivo, glicose positiva, VP positiva, VM negativa e H2S positivo.

Antigamente a espécie tipo era denominada Aerobacter aerogenes; o
Enterobacter hafnia é agora Hafnia alvei e as espécies de interesse são: E.
cloacae, E. aerogenes, E. aglomerans, E. sakazakii e E. gergoviae
( E.aerogenes atypical) = uréia positiva).

O E. cloacae (E.cloacae-like unemed sps 1,2,3) é mais isolado na urina,
escarro, pus, sangue e líquor; faz reação cruzada com E. coli.

O E. sakazakii, que antes era E. cloacae, é encontrado em alimentos, no
meio ambiente e causa meningite em recém-nascidos.

O E. aglomerans (E. agglomerans complex: Erwinia herbícola, E.
melletiae e ainda: Pantoea agglomerans (E. agglomerans HGXIII); Pantoea
ananás (E. agglomerans HGVI) Pantoea dispersa (E. agglomerans HGIII),
após atos cirúrgicos e cateterização positiva hemoculturas).

O E. aerogenes é encontrado em fezes humanas, esgotos, leite, água,
VGU, pus e sangue.

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6- Pseudomonas, spp

Não são enterobactérias, mas são encontradas em infecções no TGU.
São bastonetes aeróbios estritos, móveis, catalase positiva e citocromo-oxidase
positivo. Nas espécies flageladas o número de flagelos serve para separá-las,
mas isso não ocorre na rotina do laboratório clínico. Possuem fímbrias que
possibilitam a fagocitose. Produzem pigmentos solúveis, a pioverdina (P.
fluorescens) e a piocinina ( P. aeruginosa - azul) e odor adocicado semelhante
ao da uva.

São encontradas nos olhos, urina, ferida, sangue, lavados brônquicos e
trato genital feminino.

As espécies de interesse são: P. aeruginosa (mais patogênica, que
cresce a 42ºC), P. fluorescens, P. putida, P. cepacia (Burholderia cepatia,
encontrada na putrefação da cebola, em lesões úlcero-necroticas em humanos,
em pacientes com fibrose cística em paciente com estenose de uretra, após o
uso de sondas), P. stutzeri (água e solo, raro em infecções) e P. maltophilia
(Stenotophomonas maltophila, encontrada no aparelho respiratório, sangue,
feridas e urina e pacientes com infecções oportunistas),
P.pseudomallei(Burkholderia pseudomallei)

7- Staphylococcus, spp

As espécies que causam infecções urinárias são: S. aureus, S.
saprophyticcus, S. xylosus e S. epidermides (quando a contagem de colônias
está muito alta ele também pode causar infecções urinárias).

Outros patógenos que podem causar infecções urinárias e outras
infecções (Bacilos Gram negativos ,não fermentadores de açúcares:

1) Flavobacterium meningosepticum = Chryseobacterium meningosepticum
(patogênicos para prematuros)
2) Oligella urethralis (infecções no ouvido e urinárias)
3) Neisseria elongata (subsp. nitroredutans) endocardite
4) Sphingobacterium spiritivorum (sg, urina, antigo Flavobacterium
spiritivorum)
5) Shingomonas paucimobilis (Pseudomonas paucimobilis) encontrada em
várias amostras clínicas.
6) Weeksella virosa (Flavobacterium genitale) = colônia mucóide, infecções
urinárias e genitais.
7) Alcalígenes faecalis (antigo odorans) = nebulizadores, lavado brônquico, sg,
escarro, urina.
8) Acinetobacter baumannii (penicilina resistente).

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AULA 4

COPROCULTURA

Este exame é destinado a isolar os microrganismos causadores das
diarréias, disenterias purulentas, sanguinolentas e mucosas e dores abdominais.
As fezes podem se apresentar sólidas, líquidas ou pastosas;
normalmente, as fezes líquidas e pastosas são características de agentes
gastrointestinais patogênicos. Quando as fezes do paciente estão sólidas e ele
está apresentando dores abdominais, o médico pode administrar um laxante
para facilitar o trabalho da coprocultura; se as fezes estiverem líquidas ou
pastosas há necessidade de se fazer uma suspensão em salina estéril.

A semeadura é feita num caldo de enriquecimento, podendo ser utilizado
o caldo selenito, caldo tetrationato ou caldo GN, ou em meios seletivos (SS,
Hektoen, XLD [xilose lisina desoxicolato], ágar sulfito-bismuto, ágar
MacConckey, EMB ou ENDO).

As espécies que podem ser encontradas causando gastroenterites são:
Campylobacter pylori, Camppylobacter jejuni, Salmonella, spp; Shiguella, spp;
E. coli (enterotoxinogênica e enteropatogênica), Vibrio cholerae, Vibrio, spp;
Yersinia enterocolitica, Clostridium difficile e Staphylococcus aureus.

COLETA DE AMOSTRAS

Coletar em recipientes estéreis, de boca larga e que possam ser
hermeticamente fechados.

Para isolar Shiguella, spp e Neisseria gonorrhoeae, utilizar Swab retal,
sendo que para a N. gonorrhoeae tocar o Swab apenas no esfíncter anal tendo
o cuidado de não entrar em contato com as fezes.
Para o isolamento de bactérias patogênicas é bom colocar as fezes em
um conservante como o tampão fosfato de sódio ou potássio a 0,033 M mais
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glicerol. Se a suspeita for de Salmonella, spp ou Shiguella, spp, colocar em
caldo selenito ou caldo GN.

São Bactérias Causadoras de Gastroenterites:

1- Campylobacter jejuni subsp. jejuni:

Quadro clínico - dor abdominal, diarréia, vômito, febre, dor de cabeça, mialgia
e artralgia.
Acomete mais indivíduos adultos na faixa etária de 20 a 29 anos.

Transmissão - água e alimentos contaminados.

Coleta - as fezes diarreicas podem ser transportadas à temperatura ambienta
se for para cultivo imediato, caso contrário às fezes devem ser refrigeradas.

Cultura - não cresce a 25 ºC cresce pouco a 37 ºC, mas cresce bem a 42-43
ºC. Requer atmosfera gasosa adequada (2-5 % de CO2); não se deve usar a
jarra de anaerobiose devido à concentração de O2 que é de 12 - 17 % e o
microrganismo em questão necessitam de 3 - 6 % de O2.
O meio mais usado é o Campy-Bap a 42 ºC é microaerófilo (↓O2) e
Capnophilico (↑CO2).
O crescimento da cultura deve ser avaliado em 24, 48 e 72 horas através de
lâminas coradas pelo Gram (bastonetes curvos Gram negativos); pode ser feita
a montagem a fresco para avaliar a presença de motilidade em flecha.

Se o material vier de ágar não inibidor a 37 ºC fazer uma lâmina corada
pelo Gram e uma montagem a fresco para observar os mesmos aspectos do
microrganismo em estudo, em seguida semear no ágar sangue a 25 ºC,
podendo ou não haver crescimento (no ágar sangue o C. jejuni não cresce a 37
ºC). O C. jejuni hidrolisa o hipurato e é sensível ao ácido nalidixico (30 mg) e à
cefalotina.
Pode-se fazer teste de aglutinação em látex ou Gen Probe (sonda genética), a
partir das colônias.

2- Helicobacter pylori

É um novo microrganismo associado à gastrite e úlcera gastroduodenal.
Apresenta-se em espiral, porém, é mais semelhante ao gênero Spirillum que ao
Campylobacter, além de apresentar ácidos graxos em sua parede celular que o
difere das outras espécies de Campylobacter.
Tem sensibilidade aos sais de bismuto, produz urease com atividade forte (fator
de patogenicidade), não é muito ativo bioquimicamente, não fermenta
carboidratos, não reduz nitratos e não hidrolisa o hipurato de sódio.

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A sua morfologia em espiral é vista no tecido gástrico corado pelo Gram,
HE e acridina-orange, mas os melhores resultados foram obtidos com a
coloração da prata de Warthin-Starry.

Para a cultura é utilizado o ágar chocolate ou o meio ágar Campylobacter
de Skirrow (7% de sangue de cavalo, vancomicina, ácido nalidixico e
trimetroprim). É redutor de nitrato-nitrito variável, cresce na presença de 0,5%
de glicina e cresce à 30ºC, 42ºC.

Outras sps de Helicobacter, spp:
H. cinaedi (swabs retais em homossexuais),
H. fennelliae (swabs retais em homo e bissexuais),
Flexipira rappini (semelhante ao H. pylory), pacientes com ou sem AIDS,
Gastropirillum hominis (gastrite em humanos semelhantes a H. pylori).

3- Shigella, spp

O gênero Shigella, spp é constituido de quatro sorotipos ou subgrupos:
A) S. dysenteriae, B) S. flexineri, C) S. boydii e D) S. sonnei.
A sorotipagem com antisoros polivalentes ou grupo específicos é o método mais
adequado para identificar um microorganismo isolado que tenha características
bioquímicas e morfológicas parecidas com as da Shigella,spp.

Os biotipos imóveis e não produtores de gás de E. coli, pertencentes ao
grupo de Alkaligenes dispar, podem se assemelhar às Shiguella, portanto, não
se dispensa a sorotipagem (A - D).
Possuem antígeno ‘’O’’ específico, certas estirpes têm antígenos K (termolábil) e
não têm antígenos H.

As Shigella, spp permanecem restritas ao TGI (a septicemia é rara), são
lactose negativa, imóveis e não produzem gás a partir da glicose;
As exceções são a S. flexineri sorotipos Newcastle e Manchester, que diferem
dos biogrupos de 1 - 5 por serem indol negativo, arginina negativa e CO2
positivo. Sua identificação bioquímica fica confusa com outros gêneros como
Hafnia alvei, Enterobacter, Providencia e E. coli invasiva. As Shiguella, spp
exigem um maior número de provas bioquímicas devido à quase total
negatividade nestes testes.
Todas as espécies são produtoras de enterotoxinas, mas uma delas , a S.
dysenteriae, produz uma exotoxina conhecida como neurotoxina de Shiga, que
é potente e responsável pela patogenia desta espécie.

As Shigella, spp causam no homem uma doença debilitante denominada
disenteria bacilar, mas são menos invasivas que as Salmonellas, spp.
As shigeloses podem apresentar-se desde a forma de infecção inaparente,
pequenas infecções com desconforto abdominal e pouca diarréia até a
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disenteria bacilar. O início é súbito com tenesmo, diarréia e febre após um
período de incubação de 1 a 4 dias.

Todas as Shigella, spp são patogênicas para o homem causando lesões
no TGI (íleo e cólon), lesões no epitélio e mucosa e inflamação aguda com
presença de restos celulares (S. flexineri).
As lesões superficiais do TGI (mucosas) ocorrem devido à ineficiência dos
anticorpos IgG, os quais têm efeito de proteção.

Há um aspecto a ressaltar sobre a formação de uma pseudomembrana,
nas áreas ulceradas do TGI, composta por restos celulares, bactérias e mucosa
necrosada.

As fezes devem ser colhidas na fase aguda antes do início do tratamento.
O paciente está sujeito à reinfecção.
O tratamento é feito com cloranfenicol, tetraciclinas (bacteriostáticas) ou
ampicilina. Pode-se fazer a administração de Lactobacillus acydophillus que
acidulam o meio tornando-o impróprio para o crescimento das Shiguella, spp.
A vacinoterapia não tem valor algum.
As Shiguella, spp são anaeróbios facultativos, crescem bem em
aerobiose. Existem variações coloniais dos tipos lisa (S) e rugosa (R), não
invasiva.

4- Salmonella, spp

É o gênero mais complexo com 2.200 sorotipos diferentes descritos por
Kauffman-White. Neste esquema elas são agrupadas, em A, B, etc. com base
nos antígenos O (somáticos), e em sorotipos 1, 2, etc. segundo os antígenos
flagelares H. Todos os subgrupos de Salmonella, spp e Arizona, spp são
considerados pertencentes à mesma espécie.

A contaminação se dá, normalmente, por ingestão de leite, água e
alimentos contaminados por fezes de humanos e animais.
Podem-se obter três tipos clínicos:
1. Gastroenterites - diarréia de leve a fulminante, febre baixa, náuseas e
vômitos;
2. Bacteremia ou septicemia - febre alta com hemoculturas positivas (S.cholerae
suis é a espécie invasiva);
3. Febres entéricas - febra amena e diarréia. Pode ser causada por qualquer
espécie de Salmonella, exceto a S. typhi que causa constipação.

Nos primeiros 7 a 10 dias as hemoculturas são positivas e o indivíduo
apresenta diarréia sanguinolenta, posteriormente se positivam as culturas de
fezes e urina. O indivíduo continua eliminando o microorganismo após 1 ano de
desaparecimento da clínica.

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As Salmonella, spp são móveis (exceto as aviárias), lactose negativa,
H2S positivo, citrato positivo e uréia negativa.
As espécies de interesse são: S. typhi, S cholerae-suis e S. enteritidis, sendo
que os mais de 2.200 sorotipos pertencem à espécie S. enteritidis.
A Arizona hinshawii mudou de gênero e passou a ser subespécie da S.
enteritidis e é causadora de gastroenterites nos humanos e animais. Existem
outras espécies como S. pullorum (causa diarréia em pintos), S. galinanum, S.
schottmülleri (S. paratyphi A, B, C), porém a taxonomia aceita somente as três
primeiras espécies citadas anteriormente.

Doenças:
1- Febre tifo - S. typhi; (sorogrupo 1).
2- Febre paratifóide no homem - S. paratyphi B; (sorogrupo 1).
3- Gastroenterite aguda no homem e animais - S. typhimurium; (S.enteritidis
sotipo typhimurium)
4- Paratifo em leitões - S. cholerae-suis.

A identificação sorológica é feita colocando-se uma gota da suspensão
de Salmonella, spp com uma gota de antisoro diluído.

A S. typhi multiplica-se no tecido linfóide, submucosa intestinal ( placas
de Peyer) e linfonodos regionais, propaga-se para o baço, fígado e medula
óssea e volta ao sangue com liberação de endotoxinas.
A hemocultura positiva na primeira semana, mas na convalescência a
coprocultura fica positiva e o indivíduo fica portador.

O diagnóstico laboratorial é feito através de hemocultura e reação de
Widal (soroaglutinação com anticorpos anti O e anti H).
A coprocultura tem valia no caso de infecções alimentares; a semeadura é feita
em caldo selenito e depois em ágar SS ou ágar sulfito-bismuto (inibe a E. coli).
A imunidade é duradoura (celular e humoral).

5- E. coli enteropatogênica (EPEC)

As estatísticas mostram que a faixa etária mais acometida por este
sorotipo vai de 0 a 2 anos.
No intestino delgado forma abcessos localizados, o indivíduo apresenta
tenesmo (calafrios e abdômen endurecidos), as fezes são líquidas e
mucopiosanguinolentas.
Os adultos só são afetados quando debilitados.
A semeadura deve ser feita em ágar simples ou ágar sangue porque os meios
seletivos podem inibir o crescimento de algumas dessas cepas.

6- E. coli enterotoxinogênica (ETEC)

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Raramente invade a mucosa do intestino delgado ou grosso, mas pode
produzir exotoxina que atua na mucosa intestinal provocando grande liberação
de água.
Essas diarréias são copiosas, não contém sinais de piócitos ou hemácias e têm
como conseqüência desidratação sem febre.
Algumas estirpes de E. coli são produtoras de exotoxinas e contém fímbrias
(fatores de colonização, adesão à mucosa).
As técnicas de ELISA são positivas para antígenos TL e TE.
Em crianças é chamada de ¨cólera infantil¨ e adultos ¨diarréia dos viajantes¨.

7- EIEC (enteroinvasiva)

Invade células epiteliais (febre + colite + diarréia e PMN nas fezes + tenesmos).

8- EHEC (enterohemorrágica)

Elaboração de citoxinas = diarréia com sg e sem febre acompanhada de dor
abdominal.

9- EaggEC (enteroagregativa)

Pode durar até 14 dias o processo diarréico é aquoso e promove desidratação
grave. Este patógeno adere às células epiteliais.

10- Vibrio, spp

A espécie tipo é o Vibrio cholerae, que foi causa de diarréias
potencialmente graves durante séculos.
A doença leva à diarréia, muitas vezes severas, desidratação e infecções extra
intestinal que podem resultar em septicemia fatal; as fezes ficam líquidas e
acinzentadas podendo ter coágulos.

As espécies de destaque são: V. parahaemoliticus (frutos do mar
contaminados e mal cozidos), V. mimicus (mariscos) e V. alginolyticus (biotipo 2
do parahaemoliticus feridas e ouvido).
A cólera clássica, quando aparece, tem como microrganismo responsável
o V. cholerae biotipo El-Tor.

Os microorganismos podem ser isolados dos vômitos na fase aguda e
para este isolamento é usado o meio TBCS (tiosulfato-citrato-bile-sacrose).
Os Vibrio, spp são flagelados.
O Vibrio cholerare tem 3 sorogrupos: Inaba (EUA, Peru, CHILE, Brasil, Equador
= variedades EL TOR) Ogawa (sudeste da Ásia) e Hikojima.
Pode ser tratado com Tetraciclina.

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As provas pós-cultura que são confirmatórias para V. cholerae são:
Gelatinase + , aglutinação de eritrócitos de galinha +.

11- Yersinia enterocolitica

Características gerais: bacilo Gram negativo pertencente às enterobactérias.
Espécies: Y. intermedia, Y. fredericksenii, Y. kristensenii (Y. enterocolitica
atípica).

A manifestação clínica depende do sorotipo, dos fatores genéticos e das
condições do indivíduo. As manifestações primárias são enterites, linfadenite
mesentérica, ileíte terminal, pericardite, pneumonia, etc.; as secundárias incluem
eritema nodoso, púrpuras, artralgias, mono e poliarterites, glomerulonefrites,
doenças da tireóide e tromboses.
Em crianças e adolescentes predominam os sintomas de gastroenterite
mesentérica; as diarréias agudas e artrite acometem mais as pessoas de 20 a
60 anos.

Quadro laboratorial: a semeadura em meios seletivos deve ser feita quando
houver flora mista, podemdo usar o ágar tripticase soja (TSA).
É um dos patógenos entéricos que tem a habilidade de crescer a 4 ºC
(enriquecimento a frio em tampão fosfato).
Os sorotipos O3, O8 e O9 crescem em ágar sulfito-bismuto, MacConckey, SS,
XLD e Hektoen.
Há relatos de contaminação por tranfusão sanguínea e preparados caseiros
com tripas e em alimentos dessa natureza que foram armazenados em
supermercados.

Bioquímica: fermenta a sacarose, uréia, ornitina, lisina e arginina e tem
motilidade a 37 ºC. Podemos utilizar a sorotipagem para confirmar.

Outras sps de Yersinia, spp: Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis
(linfadenite mesentérica em crianças, simulando apendicite.).

12-Clostricium difficile

É uma espécie toxinogênica que causa enterocolite e diarréia associada a
antibióticos (outra causa rara é o S. aureus).

É encontrado na água, no intestino de animais, vagina e uretra de
humanos, fezes de crianças e apenas 3 % das fezes de adultos sadios. É muito
encontrado em adultos hospitalizados.

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Os antimicrobianos aplicados na doença gastrointestinal associada ao C.
difficile incluem penicilina, clindamicina, lincomicina, metronidazol e anfotericina
B.

Este microrganismo é encontrado associado à colite pseudomembranosa,
doenças intestinais inflamatórias inespecíficas, obstrução e estrangulamento do
intestino. Ele elimina a flora normal por competição e produz a enterotoxina A e
citotoxina B.

13- Staphylococcus, spp

Provoca intoxicação alimentar, pela enterotoxina que fica incubada de 1 a
8 horas, com náuseas, vômitos e diarréia; a convalescência é rápida e não há
febre.

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Novos gêneros e espécies de enterobactérias que causam infeccões em
humanos:
a) Cedecea davisae: Escarro(VAI)
b) Cedecea lapagei: VAI
c) Cedecea neteri: Hemocultura de paciente com valvulopatia
d) Ewigella americana: sg, escarro
e) Kluyvera ascorbata: sg, urina, fezes (pigmento púrpura escuro)
f) Leclercia adecarboxylata: várias espécimes clínicas,água e comidas
g) Leminorella grimontii: fezes e urina
h)Tatumella ptyseos: escarro
i) Trabusiella guamensis: Fezes (microbiota), não causa diarréia

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j) Yokenella regensburgei (similar a Hafnia alvei): VAS (orofaringe), escarro,
fezes, ferida

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AULA 5

ANTIBIOGRAMA

O antibiograma continua sendo na atualidade, o método mais utilizado na
determinação da sensibilidade bacteriana devido à sua facilidade de execução,
e mais do que isso, devido à sua boa correlação com resultados obtidos na
prática clínica. Naturalmente, esta boa correlação está em função dos
constantes estudos feitos por um grande número de pesquisadores de profundo
conhecimento sobre a matéria.
Os antibiogramas de antigamente utilizavam três concentrações de um mesmo
disco de sensibilidade, mas hoje, depois de estudos, usa-se uma concentração
só para cada disco.

INDICAÇÕES, SELEÇÃO DOS DISCOS, INTERPRETAÇÕES E LIMITAÇÕES
DO TESTE.

Os testes de sensibilidade são indicados para qualquer organismo que
contribui para a formação de um processo infeccioso de forma a garantir uma
antibioticoterapia correta. Isto, naturalmente, se não pudermos predizer de
antemão, conhecendo o organismo e a sua normal sensibilidade.

Os organismos causadores de infecções devem ser identificados quase
que simultaneamente com a realização da prova de sensibilidade. O teste é bem
recomendado para Staphylococcus, spp e Enterobactérias, uma vez que tais
organismos exibem regular resistência aos antibacterianos comumente usados.

Como já foi dito, alguns organismos possuem sensibilidade conhecida
frente a determinados agentes antibacterianos. Assim, por exemplo, é
conhecida universalmente a aparente sensibilidade, nos EUA, do Streptococcus
pyogenes e Neisseria meningitides à Penicilina.
No entanto, o S. pyogenes originário de um paciente alérgico à Penicilina deve
ser testado frente à Eritromicina e Tetraciclina para que se possa conhecer a
sua sensibilidade.
Cepas de Streptococcus pneumoniae que sejam resistentes à Penicilina são
raramente encontradas, assim sendo, não requerem TSAQ, todavia o método
de discos está estabelecido para estes organismos.

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Os testes de sensibilidade são também indicados nos estudos de resistência
epidemiológica e nos estudos de um novo antibacteriano a ser introduzido, ou
que tenha sido recentemente introduzido, no mercado.

Recomenda-se que o teste de sensibilidade seja feito de colônias
isoladas e supostamente patogênicas, partindo-se do isolamento primário.
A mistura de diferentes organismos não deve ser submetida ao TSAQ.
A prática de conduzir o teste de sensibilidade diretamente do material clínico
também deve ser evitada, exceto em emergências clínicas nas quais o Gram
direto sugere um único patógeno. Mesmo assim o teste deve ser repetido
segundo determina a metodologia padrão. Quando a natureza da infecção não
for clara e o material biológico contiver mistura de organismos ou flora normal,
sendo que os organismos em questão guardem pouca relação com o processo
infeccioso que está sendo tratado, os testes de sensibilidade são
desnecessários e errôneos.

SELEÇÃO DOS ANTIBACTERIANOS A SEREM USADOS ROTINEIRAMENTE

Para se fazer um teste rotineiro razoável deve ser limitado o número de
antibacterianos a serem testados. No geral, deve-se testar apenas um
antibacteriano representativo de cada grupo com espectro de ação similar.
Para evitar confusão é recomendado o uso do nome genérico do antibacteriano.
De um modo geral, a seguite recomendação é feita na seleção dos
antibacterianos:

1- Grupo das Penicilinas:

Normalmente é conveniente testar o Staphylococcus, spp frente à Penicilinase
resistente (PCR), tal como a oxacilina.
O Staphylococcus, spp deve ser testado frente à Ampicilina ou Penicilina, mas
não frente às duas.
As enterobactérias devem ser testadas frente à Ampicilina e Carbenicilina.
Proteus, spp e Pseudomonas aeruginosa devem ser testados frente à
Carbenicilina.

A Penicilina tem na sua estrutura um anel de tiazolidina mais ácido 6-
amino-penicilânico que pode ser clivado por enzimas beta-lactamases,
passando a ácido penicilinóico (inativo).

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O mecanismo de ação das Penicilinas é a inibição da síntese da parede celular
das bactérias através do bloqueio das ligações cruzadas terminais dos
glicopeptídeos lineares nos complexos glicopeptídicos (atua no quarto estágio).
As formas L atuam mais em Gram positivos do que em Gram negativos (exceto
Ampicilina e Carbenicilina).
São produtores de beta-lactamases os: Staphylococcus, spp; Pseudomonas,
spp; Haemophylus, spp e Coliformes.

A administração é por via oral ou intramuscular, a absorção é rápida e a
excreção se dá pelos rins.
Uso clínico da PG: Streptococcus, spp; Neisserias, spp; Espiroquetas,
Clostridium, spp; Staphylococcus, spp não produtores de beta-lactamases e
bastonetes Gram positivos por via intramuscular; para infecções menores a
administração deve ser por via oral.

Ampicilina - infecções do TGU por coliformes; 2 a 3g por dia.
Amoxilina - níveis mais elevados que a Ampicilina.

As Penicilinas podem causar hipersensibilidade com irritações no SNC
(encefalopatia, delírio e convulsões); o nível de toxicidade é de mais de 30g por
dia. Por via oral causa diarréia.

2- Grupo das Cefalosporinas:

Estão normalmente classificadas em três diferentes grupos: de primeira,
segunda e terceira gerações; como elas têm espectro de ação diferente, deve-
se usar apenas uma daquelas que não se correlaciona com as demais.

Os Staphylococcus, spp são previsíveis quanto à sua sensibilidade às
Cefalosporinas, exceto as cepas de S. aureus que são Meticilina resistentes
(antibiótico que não tem no Brasil).
Os enterococos são considerados resistentes às Cefalosporinas, porém, eles
podem apresentar-se sensíveis sob certas condições do teste e a cura com
algum antimicrobiano deste grupo poderá ocorrer, contudo, as Cefalosporinas
não devem ser usadas rotineiramente frente a estes microrganismos.

As Cefalosporinas são isômeros da Penicilina e atuam para Gram
positivas e Gram negativas.
São compostas pelo ácido 7-aminocefalosporânico (em lugar do 6-
aminopenicilânico).
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Não devem ser usadas em meningites, mas podem ser administradas
para infecções do trato urinário e respiratório.

Proteus, spp e Klebsiella, spp são Cefalosporinas sensíveis.
Enterobacter, spp, Serratia, spp e Pseudomonas, spp são Cefalosporinas
resistentes.
A Cefalordina é nefrotóxica e está sendo retirada do mercado.

3- Grupo das Tetraciclinas:

As Tetraciclinas apresentam boa correlação na rotina laboratorial,
contudo, algumas bactérias podem apresentar-se mais sensíveis à Doxiclina e
Minociclina (novas), sendo que a Clortetraciclina é a mais instável. São
absorvidas pelo trato intestinal, têm pouca ação no LCR e as mais novas têm
uma excreção mais lenta.

O seu modo de ação é a inibição da síntese protéica pela inibição da
ligação do amino-ARN-t com as unidades 30s dos mini-ribossomos bacterianos.
São bacteriostáticos e são drogas de primeira escolha para os casos de
Clamidia e Mycoplasma, mas estimulam o aumento das leveduras.
Existem, ainda, Staphylococcus, Proteus e Pseudomonas resistentes às
Tetraciclinas. Têm médio espectro de ação.

Apresentam como sintomas de toxicidade distúrbios gastrointestinais e
erupções cutâneas; em gestantes causa danos hepáticos e crianças podem
apresentar alterações na cor dos dentes.

4- Cloranfenicol:

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Distribui-se facilmente no SNC e LCR e ainda penetra nas células, mas é
inativado no fígado quando está associado ao ácido glicurônico.

Tem como modo de ação a inibição da síntese protéica dos
microrganismos, sendo, portanto, bacteriostático.
Atua bem em Neisseria (pacientes sensíveis à Penicilina), Salmonella,
Haemophylus e bactérias anaeróbias.

A resistência se dá através da enzima cloranfenicol-transferase.
Os efeitos colaterais: distúrbios no TGI, aumento do ferro sérico e anemia
aplástica; em recém-nascidos e prematuros provoca a síndrome da medula
cinzenta. No TSAQ usa-se somente um disco.

5- Macrolídeos:

Na prática atual só a Eritromicina necessita ser testada.

Têm como modo de ação a ligação às subunidades 50s dos ribossomos.

A Eritromicina é utilizada nas VAS e em infecções por Corinebacterium,
spp (C. minutissimum causadora de eritrasma);
A Espiramicina é usada nas VAS, a Oleandomicina nas VD, a Trioleandomicina
nas VAS e a Leucomicinas nas VAS e VD.

6- Aminoglicosídeos:

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É neste grupo de antibióticos que estão incluídos a Amicacina,
Gentamicina, Canamicina, Netilmicina, Tobramicina, Sizomicina, Ribostamicina,
Dipecacina e Espectinomicina.

O espectro de ação deles não é idêntico o suficiente para assegurar a
resistência cruzada.
Contém atividades bacterianas tóxicas.
O seu modo de ação é a inibição da síntese protéica das bactérias. São ativos
em pH alcalino, ototóxicas e nefrotóxicas, são carregados positivamente, e em
hemoculturas são inibidos pelo sulfonato polietanetol de sódio e outros
detergentes.

As bactérias Gram negativas (enterobactérias) e as anaeróbias são
resistentes aos aminoglicosídeos, mas eles são usados em septicemias e em
Gram negativas.

Particularidades:
# Canamicina - é menos tóxica do que a Amicacina, bactericida para Gram
negativas (exceto Pseudomonas, spp e Serratia, spp) e é nefro e ototóxica.
# Amicacina - derivado sintético da Canamicina, no SNC atua sobre bactérias
Gram negativas entéricas ou não (Pseudomonas), é nefro e ototóxica (oitavo par
craniano).
# Neomicina - tópica e das VD, é nefro e ototóxica.
# Gentamicina - é bactericida para Gram positivas e Gram negativas (Proteus,
spp; Pseudomonas, spp e Serratia, spp), os Staphylococcus, spp e bacterióides
são resistentes, é altamente nefrotóxica. Tem uso tópico em queimaduras e
lesões cutâneas.
# Tobramicina - é ativa contra Pseudomonas, spp e é nefro e ototóxica. Não
deve ser usada com diuréticos porque potencializa a ação desta droga.
# Estreptomicina - é um bactericida (inibe a síntese proteica) bom para
Mycobacterium tuberculosis (BK), Gram negativas e Gram positivas. É muito
ototóxica. Pode ser associada à Isoniazida.
# Espectinomicina - usada em infecções gonocócicas (gonorréia) = Tobricin.

7- Lincomicina e outras drogas:

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O ideal é testar somente a Clindamicina (derivado clorado da
Lincomicina) para Gram positivas e infecções ósseas provocadas por
Bacterioides fragilis Staphylococcus, spp.

# Clindamicina - para anaeróbios e Bacterioides fragilis.
# Vancomicina - bactericida para enterococos e Staphylococcus, spp em
infecções sistêmicas. Pode cauasr surdez e dano renal.
# Novobiocina - bacteriostática que inibe a síntese de ADN e ácido teitóico
(membrana celular). É ideal para cocos Gram positivos, inclusive os produtores
de beta-lactamases, e bacilos Gram negativos (Proteus, spp).
# Rifamicina - inibe a síntese de ARN (bactérias e Clamydia, spp); na
tuberculose é utilizada associada ao Etambutol.

Antibióticos de uso tópico: Neomicina, Bacitracina, Furacin, Gentamicina
(quimioterápico que atua em membrana e mucosa) e Nebacetin (bactericida
para Gram positivas).

# Polimixina-B e Colistina - polipeptídicos bactericidas para bacilos Gram
negativos (Pseudomonas, spp). Seu modo de ação é envolver a membrans
celular da bactéria e destruir sua função osmótica (detergentes catiônicos).

8- Quimioterápicos:

# Nitrofurantoína - para Gram positivas e Gram negativas;
# Furadantina - atua nas VGU;
# Furacin - uso tópico;
# Furoxona - uso nas VD;
# Ácido nalidixico - VD e VGU;
# Ácido oxolínico - VGU;
# Ácido piperanídico - VGU;
# Metronidazol - VGU e VAS;
# Terizidona - VGU;
# Sulfonamidas - uso sistêmico;
# Sulfametaxazol-trimetoprim (Bactrim) - serve para fazer associações e para
uso sistêmico.

LIMTAÇÕES DO MÉTODO

O teste com os discos foi padronizado para organismos de crescimento
rápido tais como Enterobactérias, Staphylococcus, Pseudomonas, Acinetobacter
e algunas Streptococcus, sendo que foi modificado para testar Haemophylus,
Neisseria e S. pneumoniae.

Os estudos nesta área não permitiram, ainda, uma padronização definitva
para outros organismos que requerem condições anaeróbias para crescimento
lento em ágar Müller-Hinton, ou ainda, para aquelas bactérias que apresentam
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taxa de crescimento diferente de cepa em cepa; estes microrganismos não
devem ser testados pelo método de discos.

OBSERVAÇÒES SOBRE O MEIO DE CULTIVO

A adição de fosforilase, ou mesmo sangue lisado de cavalo, pode
melhorar a difusão e auxiliar assim a confiança nos testes com Sulfonamidas e
Trimetoprim com a maioria dos patógenos, exceto entrococos.

A variação de íons Ca e Mg podem afetar resultados com Tetraciclina,
Polimixina e Aminoglicosídeos frente a Pseudomonas aeruginosa.

Cepas que não crescem em ágar Müller - Hinton deve-se acrescer
sangue de carneiro a 5 % desfibrinado.

Ágar chocolate (com sangue de carneiro) não serve para fazer TSAQ de
Haemophylus, mas serve se acrescer 1 % de hemoglobina e um suplemento
tipo Isovitaex (fator X e V) ou suplememnto sintético equivalente com pH ideal
de 7,2.

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AULA 6

CULTURA DE ESCARRO
Em laboratório clínico a pesquisa do escarro se destina à pesquisa de
vários microrganismos que podem causar infecções na árvore brônquica e
provocar secreções sanguinolentas ou não.
As principais bactérias pesquisadas no escarro são: Mycobacterium
tuberculosis (BAAR), Streptococcus pneumoniae, Haemophylus influenzae,
Leigionella pneumophilla, Staphylococcus aureus e Fusobacterium nucleatum.
A coleta pode ser feita através de aspirado brônquico ou punção transtraqueal.

1- Mycobacterium tuberculosis

Quando o escarro chega ao laboratório, vários exames relacionados com
BAAR podem ser solicitados: cultura, inoculação ou simplesmente o TSAQ.

1.1 - Coleta: escarro espectorado, colhido por nebulização ultrasônica ou por
aspirado brôquico, logo pela manhã após o despertar preferencialmente sem
assepsia bucal.
As culturas podem se positivar ou se negativar com facilidade, por isso, faz-se
necessário à coleta de três a cinco amostras, no mínimo (no princípio da
manhã).
Estas amostras devem ser refrigeradas e, no caso de amostras com flora
bacteriana mista, deve-se fazer a descontaminação (liquefação do muco e
impedimento no crescimento de bactérias contaminantes).

1.2 - Descontaminação: é feita com NaOH ou NALC (N-acetil-L-cisteína). O
NALC é mucolítico sem atividade bacteriana (destrói as ligações dissulfeto); com
a liquefação, as bactérias podem sedimentar com mais facilidade na
centrifugação, que é o próximo passo.
O NaOH a 2% (ou 3% em climas quentes) é o agente descontaminante.
A neutralização do agente descontaminante pode ser feita com HCL ou NaOH
concentrado.
O NALC é vantajoso porque tem tampão fosfato que lava a amostra e
mantém o pH ideal de diluir as substâncias tóxicas.
A centrifugação deve ser feita a uma alta rotação (3800 rpm), o que possibilita a
melhor pesquisa de bacilos em lâminas e maior positividade das culturas. Os
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lípides da parede celular das micobactérias estão em alta porcentagem, potanto,
abaixam a densidade dos organismos, justificando assim o uso de alta rotação
para a obtenção de melhores resutados.

Técnica:
* 10 ml de escarro em frasco estéril;
* colocar o escarro em tubo de centrifugação com capacidade para 50 ml;
* adiciona-se 10 ml de NALC mais NaOH a 2%;
* agitar e deixar em repouso por 15 minutos (descontaminação);
* homogeneizar com 30 ml de tampão fosfato com pH 6,8 (neutralização);

Precauções:
Não se recomenda o uso de Swabs para a coleta de micobactérias porque os
lípides da parede celular são hidrófobos e inibem a transferência das bactérias
dos Swabs para os meios aquosos. Se os Swabs forem utilizados, devem ser
deixados em contato com o meio por quatro semanas. Como as amostras são
extremamente perigosas, utilizar todas as medidas de segurança.

1.3 - Cultura: o meio mais empregado (considerado seletivo para micobactérias)
é o de Lowestein-Jensen, modificado por Gruft, que contém ovos inteiros
coagulados, sais, glicerol, farinha de batata e RNA-5 mg/100 ml; tem como
agente inibidor descontaminante o Verde de Malaquita (0,025g/100ml),
Penicilina (5ug/ml) e ácido nalidixico (35 mg/ ml).
Existem outros meios, tais como: Lowestein-Jensen com Cicloheximida,
Midlebrook 7H10 (usado para TSAQ) e 7H11 (seletivo de Mitchisen).

1.4 - Coloração: coram-se bem pela fucsina e descoram-se por solução álcool-
ácido. Precisa da presença de 10.000 bacilos/ml para que possam ser
detectados pelo microscópio ótico. Existe uma boa correlação entre esfregaço
positivo e cultura positiva; quando o paciente sofre antibioticoterapia as culturas
negativam primeiro que os esfregaços (impede a replicação, mas não a
combinação com o corante).
O número de bacilos do escarro informa sobre a resposta imune e o tratamento.
As técnicas mais usadas são:
* Ziehl-Neelsen - tem como corante de contraste o azul de metileno; as bactérias
coram pela fucsina e resistem ao descoramento pela solução álcool/ácido.
* Kinyoun - azul de metileno como corante de contraste; fucsina em maior
quantidade para corar as bactérias e a solução álcool/ácido para descorar.
* Flourocrômica - auramina fenólica, álcool/ácido e permanganato de potássio
como contraste.

Método para relatar o número de BAAR observados em esfrgaços corados:

Número BAAR observados Método de relatar do CDC

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1 a 2 em 300 campos Núm observ. ( + / - )
1 a 9 em 100 campos Núm médio/10 campos (1+)
1 a 9 em 10 campos Núm médio/10 campos (2+)
1 a 9 por campo Núm medio/campo (3+)
mais de 9 por campo Mais de 9/campo (4+)

Quando a pesquisa de BAAR for negativa, o método de liberação relatado
pelo CDC é: negativo para BAAR.

1.5 - Identificação de Mycobacterium tuberculosis:
* Temperatura ótima e tempo de crescimento - as micobactérias crescem
melhor a uma atmosfera de 3 a 11 % de CO2 sob a temperatura de 37 ºC,
sendo que a 30 ou 42 ºC o seu crescimento é considerado fraco.
No meio a base de ovo crescem em doze dias (seis ou mais semanas para
cepas ocasionais).
Existe um tipo de subcultivo feito em caldo 7H11 mais Tween 80 (polissobato)
com uma diluição de 1:100, semeadura em estrias para colônias isoladas; o M.
tuberculosis tem crescimento lento enquanto que o M. fortuitum tem crescimento
rápido.

* Produção de pigmentos - depende do fato de haver ou não exposição à
luz ambiente (envolver o tubo com papel alumínio para evitar exposição).
O M. tuberculosis não produz pigmentos, exceto uma cor camurça, mesmo
quando exposto à luz intensa; Runyon separou as micobactérias atípicas de
acordo com a sua fotorreatividade e produção de pigmentos.

Grupo de Runyon Pigmentos Organismos
I - Fotocromogênicas Carotenóide amarelo
(luz M. kansasii
forte) M. marinum
M. simiae
M. szulgai
II - Escotocromogênicas Amarelo brilhante (luz ou M. scrofulaceum
(escuras) escuro; intensifican a cor M. gordonae
quando expostas à luz) M. flavescens
M. xenopi (42 ºC)
M. avium - intracellulare
(complexo)
III - Não Pouco pigmento amarelo M. malmoense
fotocromogênicas claro que não intensifica a M. terrae
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cor com a luz. M. gastri
M. nonchromogenicum
triviali (complexo)
M. haemophilum
IV - Crescimento rápido Pigmento amarelo intenso M. fortuitum
(crescem em 3 a 5 dias e M. chelonae, philey
causam infecções cutâneas M. smegmatis
ou oculares em pacientes
imunossuprimidos)

* Acúmulo de niacina - o M. tuberculosis não converte a niacina livre em
niacina ribonucleotídea provocando o acúmulo de niacina hidrossolúvel em meio
à base de ovo. No mercado existem algumas tiras de papel de filtro com
reagente, a produção de cor amarela no meio indica positividade.

* Redução do nitrato a nitritos - a bactéria tem nitroredutase, no meio tem
nitrito; adiciona-se sulfonilamida alfanaftilenodiamina (corantes vermelhos).

* Catalase - é uma prova diferente das outras provas de catalase; 30 %
de peróxido de hidrogênio mais Tween 80 a 10 % (detergente - ajuda na
dispersão das bactérias). Pingar uma a duas gotas sobre a colônia e dá
formação de bolhas.

A prova da aril-sulfatase é usada na diferenciação entre os grupos III e IV
de Runyon. A formação de cor rosa no substrato, próximo ao crescimento
bacteriano, após a adição de carbonato de cálcio - fenolftaleína livre - é uma
prova positiva para micobactérias patogênicas para o homem ( M. kansasii, M.
szulgai pulmonar e extra-pulmonar, M. malmoense e M. haemophilum).

1.6 - Prova de sensibilidade – TSAQ: as micobactérias têm resistência
aleatória às drogas, mesmo sem serem expostas a estas drogas; os pacientes
são, então, tratados com duas ou três drogas devido ao aparecimento de
mutantes resistentes.
O TSAQ é recomendado quando o paciente sofre reicidiva durante a
quimioterapia.
É aconselhável manter uma cultura de seis meses a um ano para o caso do
paciente não responder à terapia.

Concentrações das drogas (mg/mL) usadas em meios de cultura.

DROGA CONCENTRÇÃO
Tuberculostáticas MEIO DE LOW.-JEN. MEIO 7H11
Isoniazida (INH) 0,2 - 1,0 0,2 - 1,0
Ác. para-amino-salicílico (PAS) 0,5 8,0
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Estreptomicina 4,0 2,0
Rifampicina 40,0 1,0
Etambutol 2,0 7,0
Etionamida 20,0 10,0
Canamicina 20,0 6,0
Capreomicina 20,0 10,0
Cicloserina 30,0 30,0
Pirazinamida NT NT

* Prova direta: escarro pre-diluído e não diluído, colhido direto na placa,
com bacterioscopia positiva.

* Prova indireta: bacterioscopia realizada de uma colônia vinda de uma
cultura pura isolada a partir da amostra clínica.

O TSAQ direto é mais rápido (de três a quatro semanas) e o indireto mais
demorado (cinco a sete semanas), mas a direta só é bem sucedida quando há
muitos bacilos no material.
As placas de Petri são divididas em quatro quadrantes, sendo que cada
quadrante terá 5,0 ml de ágar: o primeiro não contém antimicrobianos
(contraste), o segundo, terceiro e quarto terão concentrações variáveis da droga
a ser avaliada (PAS, INH, Etambutol ou Rifampicina).
O método de discos é eficaz e simples.

2- Legionella, spp

Exitem várias espécies relacionadas à pneumonia e, consequentemente,
o material clínico usado é o escarro ou aspirado brônquico.
Podem ser encontrados esfregaços positivos pela coloração de Ziehl Neelsen,
mas também pode-se fazer esfregaços fixados pelo metanol e corados pelo
Gram.
As espécies que causam pneumonia são: L. micdadei, L. dumoffii, L. bozemanii,
L. longbeachae e L. pneumophila.
O método mais sensível para a detecção de Legionella, spp é o teste de
anticorpo fluorescente direto (DFA) que, quando realizado no escarro, pode ser
considerado positivo se forem encontrados de 1 a 5 microrganismos.

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A cultura é feita em BCYE a 35 ºC em 5 a 10 % de CO2, (exames diários
durante duas semanas), em 2 a 3 dias crescem colônias puntiformes, brilhantes,
convexas, circulares ou pouco irregulares e com borda contínua.
Apesar de serem bastões Gram negativos, não crescem em ágar Mac Conckey.
Após crescimento pode-se fazer a prova de DFA para confirmar isolamento
presuntivo. Tem-se, ainda, a IFI no soro.

3- Haemophillus influenzae

A doença é geralmente crônica com exacerbação purulenta periódica.
O paciente apresenta tosse improdutiva persistente, sibilo, dispinéia e
respiração asmática característica.
O material para exame é o escarro, lavado brôquico (bronquite) ou aspirado
transtraqueal.
A pneumonia por H. influenzae tipo B tende a ter distribuição lobar ou segmentar
simulando uma pneumonia pneumocócica.

Provas para H. influenzae:

# esfregaços corados pelo Gram - centrifugar a amostra antes de fazer o
esfregaço a partir do sedimento. Podem aparecer cocobacilos Gram negativos
(podem corar de vermelho-laranja) característicos como filamentos
pleomórficos.
# esfregaços corados pelo Azul de metileno - coram-se em azul escuro a negro.
# prova de Quellung (intumescimento de cápsula) - colocar uma gota de anti-
soro de H. influenzae tipo B, adicionar uma gota da amostra clínica (ou
suspensão colonial) e um pouco de solução de azul de metileno; quando
positiva confirma a identificação.
# detecção de anticorpos específicos capsulares - 5 minutos.
# ELISA
# aglutinação em látex e em lâmina.

Existem 464 cepas diferentes de H. influenzae, sendo que os biotipos II e
III são os mais isolados em culturas de escarro e material ocular em crianças de
1 a 5 anos.

Os Haemophilus requerem fatores X, V e NAD para seu crescimento.
Estes fatores são vendidos comercialmente em discos de papel que são
aplicados sobre o ágar inoculado que em seguida é incubado na estufa por 24
h. Observar o crescimento ao redor do disco.

Procedimento - cultura a identificar é colocado e em seguida em ágar de
Haemophilus, spp ( BHI).
Se for feito no Müller-Hinton colocar uma tira de fator X (hemina), outra de fator
V e NAD sobre o ágar (1,0 cm de distância), incubar e fazer leitura:

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1- H. aphrophilus - requer somente fator X
2- H. parainfluenzae - requer somente fator V
3- H. influenzae - requer fatores X e V

4- Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus e Streptococcus
pneumoniae.

Já foram vistos em aulas anteriores, bem como suas triagens.

OBSERVAÇÃO: microrganismos anaeróbios podem causar pneumoniae
necrotizante.

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AULA 7

EXSUDATO DE OROFARINGE

As infecções na cavidade oral podem acontecer também na cavidade oral
anterior (tendo como exemplos as gengivites marginais, gengivo-estomatites
cremosas ou gengivites úlcero-necrotizantes).
As patologias da cavidade oral posterior estão intimamente relacionadas com
faringites, amigdalites, epiglotites, coqueluches, difteria, infecções nas paredes
laterais ulceradas, glossites e infecções herpéticas.

GENGIVITES

1- Gengivites marginais - acontecem às margens da gengiva, próximas aos
dentes; é mais comum pela perda do suporte ósseo do dente criando bolsas
dentárias (fendas gengivais e ósseas ao redor dos dentes). Isto promove maior
acúmulo de bactérias e resíduos e a formação de cálculos levando à perda do
dente.
Os exsudatos são purulentos, acompanhados de edema e de dor.
Os agentes são, normalmente, os Streptococcus mitis ou S. salivarius. O
diagnóstico laboratorial é feito através da triagem para Streptococcus, spp.

2- Gengivite aguda - frequentemente se refere a esta afecção como gengivite
ulcerativa necrozante aguda (GUNA) ou angina de Vincent (gengivite + infecção
de garganta associada à Fusobacterium, spp + Treponema, spp ou Borrelia,
spp).
Não obedece a qualquer poder etiológico e não existe nenhuma evidência de
que seja contagiosa, mas está frequentemente associada a organismos
fusiformes (Fusobactérias, Borrelia, spp ou Treponema de Vincent).

Quadro cliínico: infecção aguda associada à dor, odor fétido com
ulcerações na boca e gengivas; pode haver sangamento sem febre e com
linfadenopatia. Assemelha-se a gengivites causadas por discrasias sangüíneas
ou infecções virais.

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Quadro laboratorial: faz-se exame direto do esfregaço com carbofucsina
diluída (corante de Ziehl-Neelsen diluído com 10 a 15 volumes de água
destilada) por quinze segundos.
O diagnóstico é feito pelo encontro de muitos espiroquetas e bacilos fusiformes
em meio a numerosos piócitos.
A cultura não é necessária para o diagnóstico desta infecção. As bactérias
desse tipo de infecção são anaeróbias.

O tratamento é feito com Penicilina (1.000 a 1.500 mg/dia) ou Eritromicina
como droga de segunda escolha.
Observando sempre uma boa higiene não haverá reicidiva.
Ë uma infecção que atinge mais adultos do que crianças sendo os fatores
predisponentes a má higiene bucal e doença sistêmica.
Quando a infecção chega à faringe esta é recoberta por uma pseudomembrana
fina, amarelo-acinzentada.
A coleta é feita com um Swab seco e o procedimento laboratorial é o mesmo da
GUNA.

3- Gengivo-estomatite cremosa - há formação de porções esbranquiçadas
sobre a gengiva suspeitando-se, quase sempre, de uma infecção por Candida,
spp.
Pelo Gram podem-se encontrar células leveduriformes e algumas pseudohifas
Gram positivas no exudato.
A cultura feita no Sabouraud ou ágar batata que é exame confirmativo.
O tratamento é feito com Nistatina (Micostatin oral).

FARINGITES E AMIGDALITES (TONSILITES)
Os principais agentes etiológicos destas infecções na faringe e amígdalas
são de origem bacteriana, sendo o S. pyogenes, flora normal faringeana de
pessoas sadias, citado como o mais importante dos agentes.
Este fato dificulta a diferenciação entre a doença e a colonização por este
agente.

No que se refere à lesão diftérica e estomatites, estas podem atingir a
faringe, portanto, o estudo laboratorial para a detecção desses agentes
etiológicos deve ser feito quando houver evidências clínicas.
Microrganismos, tais como H. influenzae tipo B e S. pneumoniae são
frequentemente identificados no laboratório como agentes de faringites, muito
embora possam fazer parte da flora normal.

Quando os pacientes estão hospitalizados, podem ser encontrados
bacilos Gram negativos, como Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella

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pneumoniae, porém, não são patógenos orofaringeanos e não devem ser
relatados.

Existam várias bactérias que podem causar infecções na orofaringe: S.
aureus, Micobacterium gengivalis e M. hominis (BAAR), Corynebacterium
diphteriae, N. gonorrhoeae e Actinomyces, sp (anaeróbio).
A N. meningitides não é considerada como agente etiológico das faringites. Hoje
em dia a faringite gonocócica é mais rara devido aos hábitos sexuais; por outro
lado, é fundamental que o médico informe especificamente ao laboratório de
que há suspeita de infecção gonocócica. Apenas nesses casos o material da
garganta deverá ser semeado em meios de cultura especiais para N.
gonorrhoeae (ágar chocolate em anaerobiose).

O procedimento laboratorial depende do quadro da bacterioscopia direta,
que vai indicar a predominância do agente etiológico.
É necessário observar bem a morfologia das bactérias para uma triagem correta
e isolamento fidedigno.
A presença de cocos Gram negativos riniformes na orofaringe de crianças de 0
a 6 anos não sugere infecção gonocócica, pois, na flora normal dessas crianças
há N. catarrhalis, que simula um quadro gonocócico.

Existem bactérias filamentosas, Gram positivas, que podem ser
encontradas na cavidade oral e que causam algumas infecções faringeanas
(Actinomyces, spp que são anaeróbias).
O ideal é que quando estejamos frente a algumas infecções de orofaringe,
façamos lâminas para corar pelo Gram, Ziehl-Neelsen e Fontana-Tribondou.

A difteria é uma infecção aguda causada por cepas toxigênicas, que são
bacilos Gram positivos pleomórficos e claviformes (Corynebacterium diphteriae).
Estes bacilos apresentam coloração uniforme e, quando em cultura velha,
descoram-se facilmente. Possuem grânulos de reserva de polimetanofosfato, os
quais são metacromáticos e conhecidos como corpúsculos de Volutina ou de
Babes-Ernst.
As cepas toxigênicas são lisogenizadas pelo fago beta e produzem uma toxina
(sintetizada no local da infecção) que é absorvida e transportada por via
hematogênica, causando efeitos tóxicos no coração e nervos periféricos.
Os bacilos multiplicam-se na superfície das mucosas onde produzem a toxina
que necrosa os tecidos adjacentes, provocando uma resposta inflamatória com
formação da chamada pseudomembrana diftérica, composta de bactérias,
epitélio necrosado, fagócitos e fibrina. O seu aparecimento ocorre, inicialmente,
nas tonsilas ou faringe posterior, podendo atingir o palato e região nasofaríngea,
laringe e traquéia.
A difteria laringeana é, particularmente, perigosa devido à possibilidade de
asfixia.
A difteria cutânea é comum em regiões tropicais, mas tem-se observado o seu
crescimento em outras regiões. Acredita-se que pesquisas rotineiras de C.
diphteriae de lesões de pele poderão revelar alta incidência desta bactéria,
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determinando a pele como importante reservatório deste microorganismo. A
difteria assemelha-se muito à angina de Vincent, sendo diferentes apenas no
laboratório.

Diagnóstico laboratorial:

# Coleta do material - colhe-se com Swab que devem ser inoculados em meio
de Loeffler ou Tinsdale para posterior encaminhamento.

# Bacterioscopia - colorações em Gram, Albert Layborn e Azul de metileno de
Loeffler. No Gram visualizam-se bacilos diftéricos pleomórficos Gram positivos.
Em Albert Layborn, bacilos esverdeados com granulações de Volutina.
Pelo corante de Loeffler, bacilos róseos.

# Isolamento e identificação - os meios utilizados são: Tinsdale (com telurito
de potássio), Loeffler e ágar sangue (para outros microorganismos como o S.
pyogenes), incubados a 37 ºC por 6 a 18 horas. Após a semeadura no meio de
Loeffler, devem ser feitos esfregaços do crescimento bacteriano, os quais são
corados pelas técnicas já citadas.
Para o isolamento das colônias suspeitas, as mesmas devem ser repicadas em
meio Tinsdale. Neste meio as colônias de C. diphteriae são lisas, de cor cinza
escuro, brilhantes e convexas com coloração marrom, não se prestando, porém,
para colorações, testes imunoquímicos ou toxigenicidade, necessários para a
identificação definitiva. Para tanto, as colônias típicas isoladas no Tinsdale,
devem ser novamente repicadas em meio de Loeffler para posterior
caracterização.
As características do bacilo diftérico são: catalase positiva reduzem nitratos, não
hidrolizam uréia, glicose e maltose positivas, CO2 positivo, sacarose e trealose
negativas.

Outro meio que pode ser usado é o CT (cistina e telurito) que é melhor e
mais duradouro do que o Tinsdale.

# Pesquisa de toxina diftérica - In Vitro, a prova de Elek e In Vivo a prova de
letalidade em cobaias. As provas devem ser padronizadas e o técnico bem
treinado.

Espécies de interesse: C. diphteriae, C. ulcerans, C. haemoliticus, C.
aquaticum, C. pseudodiphteriticum (hoffmanii), C. xefrosis, C. pyogenes renale,
C. pseudotuberculosis (ovis) e C. bovis.

Observações: O C. ulcerans pode causar faringite pseudomembranosa,
porém, não produz toxina.

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AULA 8

DOENÇAS SEXUALMENTE TRANSMITIDAS – DST.

INTRODUÇÃO

As DST exigem uma transmissão por contato direto íntimo representado
pelo coito.
É difícil determinar quando a promiscuidade sexual, prostituição por excelência,
passou a ser estigmatizante, mas, seguramente, a estigma passou a
acompanhar as doenças a elas ligadas.
A partir do último quarto do século passado, os diferentes quadros e seus
diferentes agentes passaram a ser identificados. A multiplicidade de variações
sexuais tem proporcionado não só um novo mecanismo de transmissão para
doenças classicamente não relacionadas, mas também a disseminação das
venéreas. Dessas considerações de longa data a União Brasileira contra
doenças venéreas tem visto a denominação de DST não como uma expressão
apenas estigmatizante, mas uma visão epidemiológica nova para um problema
antigo. Vemos nas DST um grupo de doenças endêmicas de múltiplas causas
que incluem as doenças venéreas em um número crescente de entidades
clínicas e síndromes que tem como traço comum a transmissão durante a
atividade sexual.

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GONORRÉIA

Tem como agente a Neisseria gonorrhoeae.
A contaminação pode ser sexual e acidental; está em 1° lugar entre as
DST, tendo como faixa etária mais acometida entre 15 e 30 anos e
predominando no sexo masculino.

Causas de manutenção da endemia:
1) Fatores relacionados com sexo (promiscuidade sexual, homossexualismo,
prostituição etc);
2) Atitude pública (indiferença ao contágio e auto medicação);
3) Fracasso das autoridades sanitárias;

Período de Incubação:
O período de incubação é de 2 a 10 dias; existem relatos de 24hs e casos que
ultrapassam 15 dias.

Agente Etiológico:

São cocos gram negativos riniformes agrupados 2 a 2 com faces côncavas,
aeróbios, imóveis, sensíveis a antissépticos e morrem fora do habitat. São intra
e extra celular e suas características morfotintoriais podem estar alteradas nos
processos crônicos ou após antibioticoterapia.
A característica extra celular é da fase aguda. Foi determinado recentemente o
fator R (plasmïdio de resistência às drogas) e os achados mais recentes são as
cepas capsuladas.
É uma doenças exclusiva de seres humanos.

Meio de Cultura:
1) Ágar Sangue (não hemólise);
2) Ágar Ascite;
3) Ágar Chocolate;
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