Aula 9 eletroforese_pcr_sequenciamento
•Transferir como PPT, PDF•
2 gostaram•4,184 visualizações
Recomendados
Mais conteúdo relacionado
Mais procurados
Mais procurados (20)
Semelhante a Aula 9 eletroforese_pcr_sequenciamento
Semelhante a Aula 9 eletroforese_pcr_sequenciamento (20)
Último
Último (20)
Aula 9 eletroforese_pcr_sequenciamento
- 1. A técnica da Eletroforese para a análise de DNA e proteínas Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
- 2. Histórico • 1952, Markham and Smith – Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico Vou ali correr • 1955, Smithies um gelzinho e – Géis de amido funcionam bem para separar proteínas do soro humano já volto • 1967, Loening Tenho que ir senão – Géis de acrilamida com maior resolução e vou perder meu gel permitem separar ainda moléculas grandes de DNA • 1980, Schwartz and Cantor – Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos enormes • É hoje impossível imaginar um laboratório de biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante...
- 3. Eletroforese • Movimento de partículas dispersas num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme • DNA, carga negativa – Tem tendência a se dirigir ao polo positivo quando sujeito a um campo elétrico • Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica – Proteína deve ser desnaturada com detergente (SDS) • Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular
- 4. Eletroforese, etapas 1.Preparação do gel 2.Aplicação das amostras 3.Eletroforese 4.Coloração 5. Análise dos resultados
- 5. Preparação do gel Horizontal X Vertical Agarose X Poliacrilamida
- 6. Aplicação das amostras Definição do mapa das amostras por canaleta
- 7. Corrida do gel • Aplicação do campo elétrico • Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão • Terminais positivo e negativo • Tempo adequado, senão o DNA sai do gel
- 8. Coloração das moléculas • Brometo de etídio – Agente intercalante do DNA • Cancerígeno! – Composto fluorescente à luz UV – Gel de agarose • Prata – Gel SDS-PAGE • PoliAcrilamide Gel Electrophoresis – Melhor resolução • Coomassie blue, etc
- 11. Eletroforese em campo pulsado Grandes fragmentos de DNA
- 12. PCR a reação em cadeia da polimerase Prof. Dr. Francisco Prosdocimi http://dotsub.com/view/538a719f-927b-4192-8e95-18a92a9e95a5
- 13. Reação em cadeia
- 15. Síntese de DNA in vitro • Polimerase Chain Reaction – Reação em cadeia da Polimerase • Amplificação in vitro de moléculas de DNA – In vivo X In vitro X In silico • Procedimento análogo à replicação do DNA – Amostra de DNA; 2 primers; DNA polimerase; Tampão; dNTP
- 16. Etapas da PCR • Ciclos da PCR – Separação das fitas → 96°C – Anelamento dos primers → 60°C – Síntese do DNA → 37°C • Problema inicial da técnica – Durante a etapa de quebra das pontes de H e separação das fitas (DNA melting) a 96°C, a enzima polimerase era desnaturada e precisava ser acrescentada ciclo a ciclo... – Não permitia automação
- 17. História da PCR • Químico, 1966 – Doutor em bioquímica, 1972 – 2 anos de pós-doutorado numa industria farmacêutica • Deixou a academia para escrever ficção científica, foi dono de Kary Mullis, 1944 padaria por dois anos; voltou à indústria • 1983 → Teve a idéia de utilizar um par de primers para amplificação enquanto voltava para a casa à noite ao lado da namorada • Avisou na empresa e deixou-se que ele ficasse trabalhando na PCR, demorou um ano para padronizar a técnica • Perdeu a namorada logo depois, mas ganhou o Nobel de química (1993) • 1986 → utilização da enzima polimerase de Thermus aquaticus – Permitiu finalmente a automação da técnica • Controvérsias: Surfista, já foi divorciado 3 vezes, é um dos que acredita que o HIV não causa a AIDS, e diz ter tomado bastante LSD na década de 60/70 e que isso o ajudou a descobrir a afamada técnica! Taq polimerase
- 18. PCR Sistema de reação: DNA molde (100 ng) Iniciadores (5 µM) dNTPs Tampão com MgCL2 Taq polimerase Protocolo de amplificação: Desnaturação: 95º C Anelamento: 45-60º C Extensão: 72º C
- 19. Filmes como técnica didática • http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/ • http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm • http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ
- 20. Interlúdio explicativo Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
- 21. Bioquímica + Biomol • Enzimas são proteínas, portanto: 1. São formadas por sequências de aminoácidos 2. Derivam de informações dispostas por genes no DNA, que deve ser transcrito e, posteriormente, traduzido 3. Podemos saber a sequência delas, tanto de aminoácidos quanto de nucleotídeos
- 23. >gi|188497753|ref|NM_000188.2| Homo sapiens hexokinase 1 (HK1), nuclear gene encoding mitochondrial protein, transcript variant 1, mRNA GAGGAGGAGCCGCCGAGCAGCCGCCGGAGGACCACGGCTCGCCAGGGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCA CGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCAGCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAG CTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTCTATGCCATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCA TAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCTCCCGGGATTTTAATCCAACAGCCAC AGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTCTGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTG GATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAATCATGAGAAAAACCAGAATGTTCACA >gi|188497754|ref|NP_000179.2| hexokinase 1 isoform HKI [Homo sapiens] TGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCAGTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGT MIAAQLLAYYFTELKDDQVKKIDKYLYAMRLSDETLIDIMTRFRKEMKNGLSRDFNPTATVKMLPTFVRS TGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGACAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACG IPDGSEKGDFIALDLGGSSFRILRVQVNHEKNQNVHMESEVYDTPENIVHGSGSQLFDHVAECLGDFMEK TTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTGATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAG RKIKDKKLPVGFTFSFPCQQSKIDEAILITWTKRFKASGVEGADVVKLLNKAIKKRGDYDANIVAVVNDT CGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAGCCATCAAAAAGCGAGGGGACTATGA VGTMMTCGYDDQHCEVGLIIGTGTNACYMEELRHIDLVEGDEGRMCINTEWGAFGDDGSLEDIRTEFDRE TGCCAACATCGTAGCTGTGGTGAATGACACAGTGGGCACCATGATGACCTGTGGCTATGACGACCAGCAC IDRGSLNPGKQLFEKMVSGMYLGELVRLILVKMAKEGLLFEGRITPELLTRGKFNTSDVSAIEKNKEGLH TGTGAAGTCGGCCTGATCATCGGCACTGGCACCAATGCTTGCTACATGGAGGAACTGAGGCACATTGATC NAKEILTRLGVEPSDDDCVSVQHVCTIVSFRSANLVAATLGAILNRLRDNKGTPRLRTTVGVDGSLYKTH TGGTGGAAGGAGACGAGGGGAGGATGTGTATCAATACAGAATGGGGAGCCTTTGGAGACGATGGATCATT PQYSRRFHKTLRRLVPDSDVRFLLSESGSGKGAAMVTAVAYRLAEQHRQIEETLAHFHLTKDMLLEVKKR AGAAGACATCCGGACAGAGTTTGACAGGGAGATAGACCGGGGATCCCTCAACCCTGGAAAACAGCTGTTT MRAEMELGLRKQTHNNAVVKMLPSFVRRTPDGTENGDFLALDLGGTNFRVLLVKIRSGKKRTVEMHNKIY GAGAAGATGGTCAGTGGCATGTACTTGGGAGAGCTGGTTCGACTGATCCTAGTCAAGATGGCCAAGGAGG AIPIEIMQGTGEELFDHIVSCISDFLDYMGIKGPRMPLGFTFSFPCQQTSLDAGILITWTKGFKATDCVG GCCTCTTATTTGAAGGGCGGATCACCCCGGAGCTGCTCACCCGAGGGAAGTTTAACACCAGTGATGTGTC HDVVTLLRDAIKRREEFDLDVVAVVNDTVGTMMTCAYEEPTCEVGLIVGTGSNACYMEEMKNVEMVEGDQ AGCCATCGAAAAGAATAAGGAAGGCCTCCACAATGCCAAAGAAATCCTGACCCGCCTGGGAGTGGAGCCG GQMCINMEWGAFGDNGCLDDIRTHYDRLVDEYSLNAGKQRYEKMISGMYLGEIVRNILIDFTKKGFLFRG TCCGATGATGACTGTGTCTCAGTCCAGCACGTTTGCACCATTGTCTCATTTCGCTCAGCCAACTTGGTGG QISETLKTRGIFETKFLSQIESDRLALLQVRAILQQLGLNSTCDDSILVKTVCGVVSRRAAQLCGAGMAA CTGCCACACTGGGCGCCATCTTGAACCGCCTGCGTGATAACAAGGGCACACCCAGGCTGCGGACCACGGT VVDKIRENRGLDRLNVTVGVDGTLYKLHPHFSRIMHQTVKELSPKCNVSFLLSEDGSGKGAALITAVGVR TGGTGTCGACGGATCTCTTTACAAGACGCACCCACAGTATTCCCGGCGTTTCCACAAGACTCTAAGGCGC LRTEASS TTGGTGCCAGACTCCGATGTGCGCTTCCTCCTCTCGGAGAGTGGCAGCGGCAAGGGGGCTGCCATGGTGA CGGCGGTGGCCTACCGCTTGGCCGAGCAGCACCGGCAGATAGAGGAGACCCTGGCTCATTTCCACCTCAC CAAGGACATGCTGCTGGAGGTGAAGAAGAGGATGCGGGCCGAGATGGAGCTGGGGCTGAGGAAGCAGACG CACAACAATGCCGTGGTTAAGATGCTGCCCTCCTTCGTCCGGAGAACTCCCGACGGGACCGAGAATGGTG ACTTCTTGGCCCTGGATCTTGGAGGAACCAATTTCCGTGTGCTGCTGGTGAAAATCCGTAGTGGGAAAAA 917 GAGAACGGTGGAAATGCACAACAAGATCTACGCCATTCCTATTGAAATCATGCAGGGCACTGGGGAAGAG CTGTTTGATCACATTGTCTCCTGCATCTCTGACTTCTTGGACTACATGGGGATCAAAGGCCCCAGGATGC aminoácidos CTCTGGGCTTCACGTTCTCATTTCCCTGCCAGCAGACGAGTCTGGACGCGGGAATCTTGATCACGTGGAC AAAGGGTTTTAAGGCAACAGACTGCGTGGGCCACGATGTAGTCACCTTACTAAGGGATGCGATAAAAAGG AGAGAGGAATTTGACCTGGACGTGGTGGCTGTGGTCAACGACACAGTGGGCACCATGATGACCTGTGCTT ATGAGGAGCCCACCTGTGAGGTTGGACTCATTGTTGGGACCGGCAGCAATGCCTGCTACATGGAGGAGAT GAAGAACGTGGAGATGGTGGAGGGGGACCAGGGGCAGATGTGCATCAACATGGAGTGGGGGGCCTTTGGG GACAACGGGTGTCTGGATGATATCAGGACACACTACGACAGACTGGTGGACGAATATTCCCTAAATGCTG GGAAACAAAGGTATGAGAAGATGATCAGTGGTATGTACCTGGGTGAAATCGTCCGCAACATCTTAATCGA CTTCACCAAGAAGGGATTCCTCTTCCGAGGGCAGATCTCTGAGACGCTGAAGACCCGGGGCATCTTTGAG ACCAAGTTTCTCTCTCAGATCGAGAGTGACCGATTAGCACTGCTCCAGGTCCGGGCTATCCTCCAGCAGC TAGGTCTGAATAGCACCTGCGATGACAGTATCCTCGTCAAGACAGTGTGCGGGGTGGTGTCCAGGAGGGC 917 x 3 = 2751 CGCACAGCTGTGTGGCGCAGGCATGGCTGCGGTTGTGGATAAGATCCGCGAGAACAGAGGACTGGACCGT CTGAATGTGACTGTGGGAGTGGACGGGACACTCTACAAGCTTCATCCACACTTCTCCAGAATCATGCACC AGACGGTGAAGGAACTGTCACCAAAATGTAACGTGTCCTTCCTCCTGTCTGAGGATGGCAGCGGCAAGGG GGCCGCCCTCATCACGGCCGTGGGCGTGCGGTTACGCACAGAGGCAAGCAGCTAAGAGTCCGGGATCCCC 3617-2751 = 866 AGCCTACTGCCTCTCCAGCACTTCTCTCTTCAAGCGGCGACCCCCTACCCTCCCAGCGAGTTGCGCTGGG AGACGCTGGCGCCAGGGCCTGCCGGCGCGGGGAGGAAAGCAAAATCCAACTAATGGTATATATTGTAGGG TACAGAATAGAGCGTGTGCTGTTGATAATATCTCTCACCCGGATCCCTCCTCACTTGCCCTGCCACTTTG CATGGTTTGATTTTGACCTGGTCCCCCACGTGTGAAGTGTAGTGGCATCCATTTCTAATGTATGCATTCA TCCAACAGAGTTATTTATTGGCTGGAGATGGAAAATCACACCACCTGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAG CCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACCAGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCC CGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCTTCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTG 3617 bp GCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGTCCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTG TGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGTCCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCA 3,6 kb TTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAATTTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTC GTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
- 24. Sequenciamento de proteínas • Degradação de Edman – Quebra-se o aminoácido N-terminal – Identifica-se o aminoácido quebrado – Sequenciamento de 50 a 70 aa’s • Espectometria de massa – Quebra-se a proteína em diversos pontos e verifica-se a massa dos fragmentos – Comparações com massas conhecidas dos aa’s identifica a sequência dos mesmos • Técnicas com limite de automação – Não permitem produzir dados em larga- escala – Para saber-se a sequência de um proteína, muitas vezes sequencia-se o DNA do organismo de interesse
- 25. O Sequenciamento de moléculas de DNA Prof. Dr. Francisco Prosdocimi >gi|33869444|gb|BC008730.2| Homo sapiens hexokinase 1, mRNA (cDNA clone MGC:1724 IMAGE:3163058), complete cds GGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCACGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCA GCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAGCTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTGTATGCC ATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCATAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCT CCCGGGATTTTAATCCAACAGCCACAGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTC TGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTGGATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAAT CATGAGAAAAACCAGAATGTTCACATGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCA GTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGTTGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGA CAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACGTTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTG ATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAGCGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAG(...) TGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAGCCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACC AGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCCCGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCT TCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTGGCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGT CCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTGTGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGT CCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCATTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAAT TTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTCGTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
- 26. Frederick Sanger • Único vivo dentre os 4 indivíduos que já venceram dois prêmios Nobel • ~1955: publicou a primeira sequência de aminoácidos da insulina – Ganhou o Nobel de química em 1958 • 1964: descobriu que as proteínas de bactéria iniciavam-se com o aminoácido formil-metionina • 1967: desvendou a sequência do RNA ribossomal 5S • 1975: inventou o método dideóxi para o sequenciamento do DNA • 1977: sequencia, pela primeira vez, o genoma inteiro de um organismo, o bacteriófago phi X 174 – 11 genes in 5386 bases sequenciadas “à mão“ – Ganha o segundo Nobel de química em 1980
- 27. O método de Sanger, 1975 Polimerização do DNA a ser sequenciado (molde) na presença de: DNA polimerase primer tampão dNTPs (desóxinucleotídeo) ddNTPs (didesóxinucleotídeo) O que faria um nucleotídeo que, ao invés da extremidade 3’OH, tem uma extremidade 3’H? Como acontece a síntese de moléculas de DNA? http://www.youtube.com/watch?v=Mz-4LSfecM4&feature=related (dideóxi)
- 28. Amplificação interrompida com didesoxinucleotídeos Desoxinucleotídeos dNTP O didesóxinucleotídeo não tem a extremidade 3’OH livre (...) e, portanto, não permite a incorporação de novas bases a 3’ quando é adicionado, (...) interrompendo a formação da nova cadeia definitivamente ddNTP Didesoxinucleotídeos
- 29. G C T T T A C C T G C A A G T T C A AC T T C A G T C A TG G G A C C C A G 5’ 3’ T A G ATGCTTC ||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ 5’
- 30. C T T T T C G C A C A A T A G T C A AC T G T G T C C AG TG G A C C C T A G 5’ 3’ G ATGCTTC A ||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ 5’
- 31. T C T C C T G T C A A G T T A C CA AC T T G T A G C A TG G G A C C C A G 5’ 3’ T A G ATGCTTCTG |||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’
- 32. C AT G C TA T T A T TT C T G C G C CA A G T G C C A G T G A A T A G C GC A C 5’ 3’ ATGCTTCTGGCAGATCT ||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ 5’
- 33. A T GAA G A G T T T T GA G C T TA C T GT G C A T C C AC C G CA GA T C CC 5’ 3’ ATGCTTCTGGCAGAT ||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ 5’
- 34. CC A T T T T T GAA G A TA CG A C G GT T C A G T GA GA T T C G C C C C AC 5’ 3’ ATGCTTCTGGCAGAT ||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ 5’
- 35. A T T GA CC A G A G T T T C A G C T TA GT G T C T G C AC G T C CA GA C AC 5’ 3’ ATGCTTCTGGCAGAT ||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ 5’
- 36. 5’ 3’ ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT População de ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT moléculas ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT Incorporação aleatória do ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT didesóxi ATGCTTCT ATGCTTCTGGCAGATCT Quantidade ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT precisa entre didesóxi e ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT desóxi ATGCTTCTGGCAGAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA 3’ 5’
- 38. • molde • polimerase • dN TPs •ddG TPs •ddA TPs •ddT TPs •ddC TPs G A T C
- 42. Modelo original Etapa 1 Marcação do primer Amplificação Tipo-PCr 4 reações necessárias, uma para cada base Eletroforese separa fragmentos de Etapa 2 diferentes tamanhos Eletroforese Leitura manual da sequência de baixo pra cima
- 43. Sanger e o fago Phi 174 De fato, esse tipo de sequenciamento manual continuou acontecendo por décadas...
- 44. Modelo moderno Applied Byosystems, 1986 Marcação fluorescente do ddNTP Leroy Hood, 1938- 1 reação necessária, todas as bases lidas ao mesmo tempo Eletroforese separa fragmentos de diferentes tamanhos Leitura da automática sequência, de baixo pra cima, por um laser http://www.youtube.com/watc h?v=ezAefHhvecM
- 45. Cromatograma
- 46. As máquinas necessárias para o sequenciamento • Primeira etapa: junta-se os reagentes em poços de placas e coloca-se na máquina de PCR para a reação de amplificação interrompida • Diferenças com relação ao PCR – Utilização de um só primer – Utilização dos ddNTPs • Uma vez prontas, as sequências de diferentes tamanhos contendo os didesóxi amplificados devem ser enviadas ao sequenciador de DNA mais próximo
- 47. O que faz um sequenciador de DNA? • Segunda etapa: realiza a eletroforese capilar – O sequenciador executa a eletroforese em géis capilares ultra-finos – Um sensor é responsável por emitir um laser e verificar qual o comprimento de onda emitido pelo didesóxi
- 49. Exercício Dê a sequência de DNA da canaleta apontada azul = Guanina amarelo = Timina vermelha = Adenina verde = Citosina http://www.youtube.com/watch? v=dUjMf2ZezIw&feature=related