O documento descreve como uma mutação no gene SCARB2, que codifica a proteína LIMP-2, modifica os sintomas da doença de Gaucher em dois irmãos que compartilham as mesmas mutações no gene GBA. A mutação SCARB2 foi encontrada apenas no irmão que apresentava epilepsia mioclônica grave, sugerindo que a LIMP-2 é um modificador da doença de Gaucher.

2. Uma mutaçãono SCARB2 é um modificador na
doença de Gaucher
Universidade Federal do Maranhão – UFMA
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – LabGeM
Liga Acadêmica de Genética Médica – LAGeM
Poena Pereira da Silva/ Ciências Biológicas – Bacharelado
Doença de Gaucher

4. -O que é Doença
deGaucher?
Doença de Gaucher
- Erro inato do metabolismo, autossômica recessiva;
- Deficiência da enzima glicocerebrosidase ->
glicocerebrosídeo;
- Acúmulo progressivo de gordura nos lisossomos;
- Células de Gaucher;
- Baço, fígado e medula óssea.

5. -Oqueé Doença de
Gaucher?
-CélulasdeGaucher

6. -Oqueé Doença de
Gaucher?
-Viametabólica

7. -Oqueé Doença de
Gaucher?
-Viametabólica

8. -Oqueé Doença de
Gaucher?
- BaseGenética
 Gene GBA;
 Cromossomo 1;
 Mais de 240 mutações;
 L444P, N370S.

9. -Oqueé Doença de
Gaucher?
- Base genética
-Sinais e sintomas
Equimose e sangramentos fáceis;
Fadiga excessiva;
Anemia;
Fraturas óssea constantes;
Dores no ossos e articulações;
Aumento do abdômen e baço.

10. -Oqueé Doença de
Gaucher?
- Base genética
-Sinais esintomas
-Tipos da Doença
deGaucher
 Tipo I
- Aumento do baço, fígado;
- Deformidades ósseas.
 Tipo II
- Aparecimento precoce, 3 meses de vida;
- Múltiplas convulsões, hipertonia, apnéia e progressivo
retardo mental;
- Mais grave, compromete o pulmão.
 Tipo III
- Compromete os ossos;
- Quadro neurológico menos grave;
- Aparecimento tardio dos sintomas.
 Não neuropática
 Neuropática

11. -Oqueé Doença de
Gaucher?
- Base genética
-Sinais esintomas
-Tipos da Doença
deGaucher

12. -Oqueé Doença de
Gaucher?
- Base genética
-Sinais e sintomas
-Tipos da Doença de
Gaucher
- Diagnóstico
Exame de sangue
-Atividade da enzima glicocerebrosidase.
Amostra de tecido da pele

13. -Oqueé Doença de
Gaucher?
- Base genética
-Sinais esintomas
-Tipos da Doença de
Gaucher
- Diagnóstico
-Tratamento

15. Introdução
 Grande parte da ênfase na era da genética molecular tem sido
identificar genes e mutações;
 Irmãos com fenótipos diferentes mostram que outros fatores
além do genético podem influenciar;
 A DG é uma deficiência hereditária recessiva que causa a um
erro ou falta de produção da glicocerebrosidase, Gcase;
 Dividida em 3 grupos;
 Gcase é levada ao lisossomo através do LIMP-2;
 Mutação do SCARB2 (que codifica a LIMP-2) pode levar ao
quadro clínico de DG;

16. Introdução
 Irmãos possuírem o mesmo genótipo com as seguinte alterações
no GBA c.535G>C (p.Asp140His) e c.10936G>A (p.Glu326Lys),
herdadas da mãe, e c.586A>C (p.Lys157Gln) herdada do pai;
 Possuíam as mesmas alterações, porém o probando (P1)
apresentava um quadro mais grave e o seu irmão (P2) não
apresentava sinais clínicos da doença.

17. -Objetivo
 Relacionar a mutação do SCARB2
com a doença de Gaucher e epilepsia
mioclônica;
 Mostrar os mecanismos envolvidos
na enzima Gcase nesses pacientes.

18. Metodologia
 Relato de Caso
 Probando (P1): O paciente teve uma infância normal, com bom desempenho escolar. Aos 13
anos, iniciou um quadro de convulsões acompanhado de febre e sintomas semelhantes a
gripe. Devido a alterações na EEG, iniciou-se tratamento com Hidantoína e Fenobarbital.
Devido à sonolência excessiva, associou-se Primidona, melhorando o estado do paciente.
Ficou bem até os 14 anos, quando sofreu um acidente que rompeu o seu baço, tendo que ser
submetido a esplenectomia de urgência.
 Meses após o acidente, convulsões generalizadas tornaram-se mais graves e frequentes,
acompanhadas de escotomas visuais e ataques mioclônicos. Dosagem de cobre e CT de
crânio normais. Aos 18 anos, sua função intelectual estava bem abaixo de acordo com a
idade cronológica, com fraca memorização e conhecimento. Estava disártrico, com
movimentos lentos, mioclonia e escotomas visuais. Aos 19 anos, exames revelaram uma
queda da GCase e presença de células de Gaucher na medula óssea e no fígado. Função renal
e auditiva normais. Paciente submetido a plasmaférese para diminuir o acúmulo de
glicocerebrosídeo no cérebro, o que diminuiu a frequência das convulsões, mas continuaram
as mioclonias e os escotomas visuais. Aos 20 anos, paciente apresentava fraco
conhecimento, com dificuldade de nomear objetos comuns. Reflexos tendíneos profundos
ausentes nos tornozelos, preservados nos outros locais.
 Aos 21 anos, começou a depender de cadeira de rodas. Iniciou tratamento com apomorfina,
o que diminuiu bastante a mioclonia e as fotoconvulsões. Tratamentos com bromocriptina e
lítio foram iniciados, porém, foram suspensos por ineficácia ou efeitos colaterais. Com 26
anos, as mioclonias eram capazes de interromper a fala do paciente, e era totalmente
desatento durante as crises. Tônus muscular bastante aumentado, níveis de vitamina B12
normais. Contraiu ITU, sendo tratada, sem presença de proteína nas EAS de controle.
 Com 27 anos, o paciente se recusava a comer e perdeu peso, sendo submetido a
Gastrostomia. Aos 28 anos, o paciente contraiu endocardite infecciosa, que evoluiu para
óbito. À autopsia, foram encontrados: hepatomegalia, tecido esplênico acessório,
osteoporose e células de Gaucher na medula óssea e linfonodos. À neuropatologia, fibrose
meníngea e degeneração das colunas laterais da medula espinhal, mas sem presença de
células de Gaucher. Sem alterações renais.

19. Metodologia
 Relato de caso
 Após o diagnóstico, os níveis de GCase foram medidos em seus
pais e três irmãos;
 Seu irmão (P2) também foi deficiente na atividade da GCase e
carrega o genótipo GBA idêntico. Um exame completo aos 26
anos era normal, e um exame no baço e fígado mostrou o baço
muito maior que seu limite normal. Ele manteve-se saudável sem
hepatosplenomegalia palpável, dor óssea, episódios de
hemorragia, convulsões ou comprometimento cognitivo. Agora
60 anos de idade, ele tem seu próprio negócio e tem trabalhado
em profissões fisicamente exigentes. Ele não recebeu terapia de
reposição enzimática;
 A mãe do probando, uma portadora em seus 80 anos, também
não tem nenhum comprometimento cognitivo ou neurológica.
Sua genótipo GBA foi c.535G> C (p.Asp140His) + c.10936G> A
(p.Glu326Lys) /WT.

20. Metodologia
 Amostra dos pacientes
- Linfócitos, linfoblastos ou fibroblastos;
- Irmãos e mãe do probando;
- 13 pacientes com DG epilepsia mioclônica;
- 40 controles;
- Protocolos aprovados pelo Institute NIH Review
Board.
 Sequenciamento de DNA/cDNA
- DNA isolado dos fibroblastos dos irmãos, pacientes com
DG e controles;
- RNA -> cDNA.
exon 1-1F: 5’- GTCTTCGACGCCTCTGCGGC-3’
exon 12-1R: 5’-CAACTCATGGGTATTGCC-3’
exon 12-8F: 5’-GGTAGCTTCATCCAATATATC-3’
exon 12-2R 5’- GTGAACCAACTGTATAAGCTAC-3’

21. Metodologia
 Os plasmídeos e a transfecção
- Vetor de expressão neo-pCMV6;
- Tipo selvagem LIMP-2 e a mutação c.1412A>G;
- Os fibroblastos do irmão do probando (P2) foram transfectadas
com SCARB2 selvagem e mutado.
 Análise quantitativa de qPCR
 Ensaio de atividade daGcase
- Atividade de Gcase ensaiada em fibroblastos;
- Irmãos, mãe e controles;
- Substrato 4-metilumbeliferil-β-D-glucopiranósido;
- 3 réplicas de cada amostra.

22. Metodologia
SDS-PAGE and Western blotting;
Imunofluorescência e microscopia confocal;
Análise de secreção extra-celular.

23. Resultados
 Diferentes níveis de atividade GCase nos irmãos refletiu diferenças
na expressão GCase
- P1 e P2 tem genótipos iguais para GBA;
- Diminuição nos níveis de Gcase em ambos os irmãos;

24. Resultados
 Diferentes níveis de atividade GCase nos irmãos refletiu diferenças na
expressão da GCase

25. Resultados
 A nova mutação SCARB2 interferiu na redução dos
níveis LIMP-2
- Os fenótipos discrepantes e diminuição na quantidade
de LIMP-2 em P1 solicitou sequenciamento do SCARB2
através do cDNA;
- Uma mutação heterozigótica, c.1412A>G; resultando na
alteração de um aminoácido , p.Glu47Gly.
- Também foi identificada na mãe e foi encontrada
apenas em um dos alelos;
- Não foi detectada no outro irmão (P2), nem nos
controles.

26. Resultados
 As células com a mutação p.Glu471Gly SCARB2 mostraram
excreção extracelular de Gcase

27. Resultados
 SCARB2 em outros pacientes com doença de Gaucher e
epilepsia mioclônica
- Avaliação das mutações de SCARB2 tinham associação com
GD e epilepsia mioclônica;
- Sequenciaram as regiões intrônicas de SCARB2 de 13
indivíduos que tinham GD e epilepsia mioclônica, mais 40
controles;
- Não detectaram diferenças que não fossem sinônimas;
- Identificaram 3 SNPs diferentes em SCARB2;
- Nenhum SNPs foi mais frequente entre os pacientes com
epilepsia mioclônica.

28. Discussão
 A elucidação do mecanismo molecular pelo qual a Gcase é submetido
dentro do lisossomo fornece uma boa noção para triagem de
modificadores genéticos candidatos para DG;
 Produção adequada de LIMP-2 pode ser um pré-requisito para o bom
funcionamento da Gcase principalmente em pacientes que possuem
deficiência nessa enzima;
 O SCARB2 pode levar o paciente a desenvolver o tipo 3 de GD;
 Isto é particularmente interessante à luz dos recentes relatórios que
identificam mutações SCARB2 homozigotos e heterozigotos em
pacientes com epilepsia mioclônica (Balreira et al. and Berkovic et al.,
2008, Dardis et al., 2009);

29. Discussão
 Epilepsia mioclônica é uma característica de outras doenças que
também são erros inatos do metabolismo relacionadas ao depósito
lisossômico;
 Por tanto é muito importante trabalhos que mostrem os
mecanismos e trajetos das proteínas lisossômicas afim de encontrar
tratamento mais completo para essas doenças;
 Curiosamente, Glu471, o aminoácido mutado no LIMP-2, já foi
discutido na literatura e dois resíduos de aminoácidos Asp470 e
Glu471 regulam a distribuição intracelular de LIMP-2;
 Com base no fenótipo clínico normal da mãe, a mutação
p.Glu471Gly sozinha não causa epilepsia mioclônica;

30. Discussão
 O probando (P1) apresenta tanto o problema na produção de GCAse
como apresenta problemas na LIMP-2, o seu transportador;
 Mutações SCARB2 não foram observadas em pacientes que não tinham
o tipo 3 da DG manifestando epilepsia mioclõnica;
 Vários modificadores podem fazer com pacientes do tipo 3 (neuropática)
de DG tivessem epilepsia mioclônica;
 A identificação de SCARB2 apenas no irmão com epilepsia mioclônica
segure que LIMP-2 é um modificador da DG;
 Enquanto neste caso LIMP-2 parece estar associado com a epilepsia
mioclônica, outras proteínas relacionadas no transporte ou
processamento de Gcase ou LIMP-2 poderia igualmente ter afetado no
genótipo do paciente.

31. Uma mutaçãono SCARB2 é um modificador na
doença de Gaucher
OBRIGADA!
Universidade Federal do Maranhão – UFMA
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – LabGeM
Liga Acadêmica de Genética Médica – LAGeM
Poena Pereira da Silva/ Ciências Biológicas – Bacharelado
Doença de Gaucher