O documento descreve métodos para detectar a síndrome de Prader-Willi e Angelman analisando o padrão de metilação no gene SNRPN no cromossomo 15. A PCR específica de metilação e a análise de fusão de amplicons podem identificar deleções e dissomias uniparentais, enquanto a MS-MLPA permite detectar duplicações raras.

2. Discente: Igor Vinícius
Acadêmico do curso de Ciências Biológicas – 6º período

3.  Epidemiologia:
 A prevalência da Síndrome de Prader-Willi varia de 1
para cada 15.000 a 30.000 indivíduos, acometendo
igualmente ambos os sexos (CASSIDY; DRISCOLL,
2009).
 Esse índice pode estar subestimado, pois há pacientes
que apresentam um quadro clínico moderado, com
características comportamentais sutis.

4. A síndrome de Prader-Willi foi
descrita primeiramente em
1956 em pacientes que
apresentavam:
 Atividade fetal diminuída
 Hipotonia infantil severa
 Problemas de alimentação
na infância
 Hipogonadismo e
hipogenitalismo
 Estatura baixa
 Mãos e pés pequenos
 Atraso no desenvolvimento
psicomotor
 Aparência facial
característica
 Retardo mental moderado
 Fome insasiável que levava a
um quadro de obesidade na
infância
 Problemas no
comportamento
 Tendência ao
desenvolvimento de
diabetes na adolescência.

5.  A Síndrome de Prader-Willi é causada por uma
deleção intersticial em 15q11-q13, no cromossomo
herdado do pai.
 Erro no imprinting: a fertilização por um
espermatozóide que ainda possui um imprinting
feminino produz uma criança portadora da síndrome.
 Dissomia uniparental, ocorrendo a herança dos dois
cromossomos 15 provenientes da mãe.

6.  Epidemiologia
 A prevalência da Síndrome de Angelman está estimada
em 1:10.000 a 1:40.000 nativivos em todo o mundo.
(CLAYTON-SMITH; LAAN, 2003) e atinge homens,
mulheres e todos os grupos raciais e éticos igualmente.
 A síndrome tem sido bastante divulgada nos últimos
anos, especialmente por causa da descoberta dos
mecanismos genéticos que levam ao surgimento da
doença.

7. A síndrome de Angelman
foi descrita pela primeira
vez em 1965 com base nas
características de três
crianças:
 Severo retardo mental;
 Epilepsia;
 Deglutição atípica;
 Marcha atáxica;
 Microcefalia;
 Dificuldades na fala;
 Movimentos desconexos;
 Sorriso frequente;
 Excitabilidade sem
motivo;
 Deficiência intelectual
grave e alterações no sono.

8.  A etiologia molecular da AS pode se dar de quatro formas:
 Deleção da região crítica do cromossomo materno
15q11q13;
 Dissomia uniparental paterno(UPD) do cromossomo 15;
 Imprinting genômico incorreto causando falta de
expressão da cópia materna do gene da proteína ubiquitina-
ligase E3A (UBE3A) no cérebro;
 Mutações intragênicas na cópia do gene herdado pela
mãe, que incluem deleção, inserção e mutações missense
no sítio de splicing.

9.  UBE3A faz parte de um pequeno subconjunto de genes
humanos que são “imprintados”. No cérebro, o gene
UBE3A derivado paternalmente é silenciado, e apenas
a cópia herdada maternalmente é ativa.
 UBE3A: gene candidato para o autismo. Alterações
genéticas na região cromossômicas 15q11-q13 são as
mais encontradas na maioria das mutações
identificadas e relacionadas aos Distúrbios do Espectro
Autista.

10.  A origem mais provável da UPD paterna é a não-
disjunção materna produzindo um embrião com
monossomia do cromossomo 15.
 Resgate pós-zigótico através da duplicação do
cromossomo 15 paterno.

11.  A deleção no centro de imprinting no gameta feminino
resulta em uma não troca do imprinting materno
adequadamente durante a ovogênese;
 Os alelos paternos continuam sendo expressos no
óvulo, que, quando é fecundado, origina um concepto
erroneamente “imprintado” e portador da AS.

12.  A metilação envolve a adição de um grupo metil ao DNA, por
exemplo, ao carbono 5 do anel de pirimidina da citosina,
ocorrendo uma redução da expressão genética.
 Ocorre geralmente em citosinas localizadas dentro de um
dinucleotídeo de citosina-guanina, conhecimentos como
“Ilhas CpG”.

13.  Detecção de metilação em ilhas CpG:
 Restriction Fragment Length Polymorphism
(RFLP): observa a diferença em sequências homólogas
do DNA, pela presença de fragmentos de diferentes
tamanhos após a digestão por uma endonuclease de
restrição específica.
 PCR específica de metilação usando amostras de DNA
tratadas com bissulfito e PCR alelo-específica, seguida
por eletroforose em gel.

14.  Após o DNA ser separado por eletroforese em gel 0,1%
e aderido a uma membrana de nylon, o que se espera
na análise da eletroforese é:
 Pacientes com PWS apresentarem uma banda materna
não metilada, enquanto os com AS apresentem uma
banda paterna não metilada.

15.  MS-MLPA: Uma sonda de MLPA contem dois
oligonucleotídeos: um sintético e um longo derivado
de M13.
 A seqüência detectada pela sonda de MS-MLPA
contêm uma sequencia de reconhecimento para a
HpaII ou HhaI. Sondas que reconhecem seqüência que
estão metiladas geram um sinal. Se o sítio CpG estiver
não metilado, o complexo sonda MS-MLPA e DNA
genômico será digerido e não vai gerar produto de PCR
nem amplificação exponencial do mesmo.

16.  Foi realizada a amplificação de sonda dependente de
ligação específica de metilação multiplex (MS-MLPA)
para validar o método de análise de metilaçao-
específica (MS-MA).
 MS-MLPA detecta número de cópias de genes e tem a
capacidade de diferenciar deleções de possíveis UPDs.

17.  52 amostras de sangue pacientes.
 19 deles foram testados através da PCR específica para
metilação e tratadas com bissulfito para a região do
promotor SNRPN e foram positivas tanto para PWS (12)
como para AS (7).
 As outras 33 amostras foram de indivíduos não-afetados.
 O DNA genômico foi extraído de sangue periférico (3 mL)
com o uso do Kit da PUREGENE ® DNA Purification.

18.  Para a análise de metilação, foi extraído DNA
genômico com bissulfito de sódio e utilizando o KitTM
DNA Methylation, de acordo com o protocolo do
fabricante.
 Após o tratamento com bissulfito, amplificou-se por
PCR um fragmento de 322 pb da região promotora do
gene SNRPN e o exon parcial correspondente aos
nucleotídeos g.5 ao g.326.

19.  A PCR foi feita em um volume de reação de 20 µl usando
um buffer 1x do conjunto de reagentes SYBR Green I
LightCycler FastStartMaster, primers a 0,5 µM cada, 4 mM
de MgCl2 e 2 µl de DNA tratado com bissulfito.
 Ativação de desnaturação 95 ° C por 10 min.
 30 ciclos com uma temperatura de desnaturação de 95 ° C
durante 10 s; anelamento a 68 ° C durante 30 s e um
aumento de 72 ° C a uma velocidade de transição rápida de
20 ° C / s.

20.  Produtos de PCR foram desnaturadas a 95° C;
 Abaixou para uma temperatura de 40° C;
 Aqueceu-se a 95° C novamente com uma taxa de
transição térmica de 0,05° C/s, monitorando-se
continuamente a fluorescência.
 A análise dos dados foi realizada com o software
LightCycler, Ver. 5,32 (Roche Diagnostics), com o
derivativo de alterações de fluorescência no eixo y e a
temperatura no eixo x.

21.  Uma mistura dos probes foi comprada da MRC-
Holland e continham 43 probes, 25 específicos de
genes da região crítica para a PWS/AS (15q11-12).
 Dentre esses específicos, 15 são sensíveis à metilação e
contêm o sítio de restrição para a HhaI e somente 5
deles foram selecionados por se ligarem a seqüências
alvo metiladas e, portanto, adequados para a
diferenciação genotípica.

22.  Essas 5 sondas têm como alvo regiões imprintadas. 4 delas
hibridizam na região promotora do SNRPN gerando
fragmentos de tamanhos de 142, 166, 190 e 247 pb e 1 sonda
na região promotora (exon 1) que codifica para a necdina
(NDN) gerando um fragmento de PCR de 418 pb.
 Foi utilizado 80 ng de DNA genômico para cada amostra
testada. Usou-se 10 mol/L de Tris-EDTA para diluição do
DNA se necessário.
 Após 16 h de hibridização à 60° C, amostras foram
igualmente divididas em 2 alíquotas. A primeira alíquota
foi submetida à ligação apenas, enquanto que a segunda foi
submetida à ligação e digestão enzimática.

23.  A normalização e análise dos dados foi feito pelo
software GeneMarker, Ver. 1.4 normaliza a altura
do pico (intensidade de fluorescência) de cada
fragmento.
 Dados resultantes foram colocados em um modelo de
regressão em uma razão: proporção entre a
intensidade da fluorescência no eixo y e do tamanho
do fragmento no eixo x.

24.  Proporções da intensidade da fluorescência de 1.5:
duplicação; 1.0: sequência selvagem; 0.5: deleção e 0.0:
ausência da sequência.
 Os limites superiores e inferiores para as proporções de
altura usadas para determinar os números de cópia
foram estabelecidos como: <0.65 para deleção e >1.35
para duplicação.

25.  Espera-se que o amplicon dos pacientes com PWS
derretam a uma temperatura mais alta (~87°C) devido
às maiores concentrações de GC oriundos dos alelos
paternos metilados.
 Um amplicon de um paciente com AS derreteria a uma
temperatura mais baixa (~83°C) devido aos alelos não
metilados paternos.
 Um aplicon de mesmo tamanho do tipo selvagem
possuiria ambos os picos no espectro de fusão.

26. Picos de fusão de amplicons detectados em uma amostra de tipo selvagem à
82.37 e 86.74°C.

27. Pico de fusão de um único amplicon à 83°C, indicando ou uma deleção típica
de AS ou uma dissomia uniparental paterna do cromossomo 15.

28. Pico de fusão um único amplicon à 86,68°C, indicando ou uma deleção
típica de PWS ou uma dissomia uniparental materna do cromossomo 15.

29.  Comparou-se os dados da proporção de altura obtida
com as 5 sondas sensíveis à metilação (4 SNRPN e 1
NDN) para uma amostra tratada com ligação e reações
de ligação/digestão.
 Os autores encontraram que os padrões distintos da
proporção de altura eliminou a possibilidade de
deleções, levantando as possibilidades de UPD ou
defeitos no centro de imprinting.

30.  Amostra de um paciente com AS testada: a proporção
de altura das sondas do cromossomo 15
permaneceram próximas a 0,5 após a ligação e
amplificação (similar ao padrão de ligação de PWS).
 Porém, uma proporção de altura de 0 (0 cópias) foi
observada nas 5 sondas sensíveis à metilação após
ligação, digestão e amplificação por PCR.
 Isso foi distinto dos tipos selvagem e dos padrões de
ligação/digestão da PWS. Alelo paterno não
metilado.

31.  Determinação do status de UPD para PWS e AS
 Foram testadas as amostras de PWS-UPD por MS-
MLPA. Todas as sondas do cromossomo 15 tiveram
uma proporção de altura de 1.0 após ligação e
amplificação. Foi compatível com outras amostras de
PWS com status de UPD confirmados.

32.  Ao contrário, se uma amostra tiver perdido o alelo
materno e herdado as duas cópias do pai, tem-se um
caso de AS-UPD. Encontrou-se uma proporção de 0
para todas as sondas sensíveis à metilação após ligação,
digestão e amplificação.
 Esse padrão é predito dentro da suposição de que os
dois alelos paternos herdados não estão metilados e
serão digeridos pela HhaI, não havendo produtos de
PCR e portanto, não amplificados.

33.  Detecção de duplicação rara no cromossomo 15
 Os resultados mostraram que todas as sondas do
cromossomo 15, exceto o 4, tiveram uma proporção de
intensidade de fluorescência de 1,5 após a ligação e
amplificação por PCR.
 Encontrou-se diferentes proporções de intensidade de
fluorescência para sondas sensíveis à metilação (0.5) e
para as específicas de regiões não-metiladas (1.5).

34.  O gene SNRPN está localizado na região crítica para as
PWS/AS, onde o promotor e o éxon 1 parcial está
completamente metilado no cromossomo materno e não
metilado no cromossomo paterno.
 É usada na análise de metilação com base na PCR e gel,
com 99% de taxa de detecção para pacientes com PWS e
80% para os pacientes com AS.
 1% restante de pacientes com PWS: variantes em uma única
base ou deleções pequenas.
 20% de pacientes com AS: sequência variante no gene
UBE3A ou causa desconhecida.

35.  Porém, a análise de metilação baseada em PCR e no gel
consome muito tempo e está sujeita à contaminação
cruzada.
 A MS-MA pode determinar padrões aberrantes de
metilação de DNA na região promotora e no éxon
parcial 1 do gene SNRPN.
 Varredura das amostras podem ser completadas dentro
de 45 minutos em um ensaio em tubo-fechado.

36.  Limitações do MS-MA: não consegue diferenciar as
deleções da UPD e padrões de imprinting raros
atribuídos à duplicação no cromossomo na região
crítica para as PWS/AS.
 Deve ser complementada por técnica que mostre a
origem parental dos cromossomos, utilizando
marcadores STR altamente polimórficos no
cromossomo 15.

37.  A análise de STR requer amostras do probando e dos
pais.
 Requer grande quantidade de DNA para o tratamento
com bissulfito.
 Compensados pelo MS-MLPA: informação do status de
metilação e do número de cópias pelo uso das enzimas
de restrição específicas de sítios metilados. Não exige
amostras dos pais e pouca quantidade de DNA do
paciente (20-200 ng).

38.  A análise de STR fornece dados de confirmação de
status UPD. Já a MS-MLPA é usada para confirmar
status de metilação e número de cópias de genes.
 Apesar da análise de STR ainda ser necessária para
confirmar o status de UPD, a combinação da MS-MA e
da MS-MLPA pode levar à substituição de testes
citogenéticos tradicionais como o FISH.