Este documento descreve um experimento de cromatografia líquida de gel filtração realizado por alunos para separar uma mistura de dois corantes (Azul de Dextran e Vermelho de Fenol). Os alunos injetaram as amostras em uma coluna contendo resina Sephadex e eluíram os corantes com tampão fosfato, coletando frações para análise espectrofotométrica e construção do cromatograma. Os resultados mostraram que os corantes foram separados com sucesso.

1. Alunos: Carlos Eduardo, Dereck Robert, Marco Antonio e Rômulo Henrique
Turma MAM 381
Professores: Alexandre e Maria Elisa
Disciplina: Análise Instrumental II
Cromatografia Líquida de
Gel Filtração
Rio de Janeiro
07/06/2011

2. 1. Objetivos e descrição das amostras
• Separar os dois corantes (Azul de Dextran e Vermelho de Fenol);
• Construir o cromatograma da mistura de corantes.
Amostras:
• Solução aquosa de Azul de Dextran a 10 mg/ml (Peso molecular = 2.106
)
Fórmula Molecular do Azul de Dextran.
O Azul de Dextran é uma macromolécula composta por um grupo cromóforo
(de cor azulada) ligado covalentemente a um dextrano (polissacarídeo de elevado
peso molecular, composto por diversas unidades de α-D-glicose ligadas por ligações
glicosídicas 1-6).
Fórmula molecular do dextrano (polissacarídeo presente na estrutura do azul de dextrano).
• Solução aquosa de Vermelho de Fenol a 1 mg/ml (Peso molecular = 300).
Fórmula Molecular do Vermelho de Fenol.
O Vermelho de Fenol pode ser utilizado como indicador de pH na seguinte
faixa:
6,6 (Amarelo) < pH < 8,0 (Vermelho)
Na faixa intermediária sua solução adquire uma coloração alaranjada.

3. 2. Procedimento
Injetou-se, inicialmente, com a válvula da coluna aberta, 15 ml de fase móvel
(tampão fosfato pH 7,4) para retirar da fase estacionária (resina Sephadex) a azida
sódica. Daí, injetou-se mais 1ml de fase móvel para que este pudesse ser recolhido
em cubeta com caminho ótico de 0,5 cm. Esse primeiro volume recolhido serviu
como branco para poder zerar o espectrofotômetro.
Injetou-se, então, com o auxílio de micropipeta, 100 µl de solução aquosa de
Vermelho de Fenol, na coluna previamente recheada com resina Sephadex, com a
válvula da coluna fechada. Posteriormente, injetou-se 100 µl de solução aquosa de
Azul de Dextran. Aguardou-se alguns segundos para que os corantes pudessem
penetrar totalmente na fase estacionária e, então, injetou-se o tampão fosfato para
eluir os corantes. Aguardou-se a eluição da mistura, recolhendo-se frações de 2,0 ml
em cubetas com caminho ótico de 0,5 cm. Após a completa eluição da mistura,
recolheu-se mais uma cubeta. Então, levaram-se as cubetas contendo o efluente da
coluna para leitura em espectrofotômetro, nos comprimentos de onda 660 nm
(absorção máxima do corante azul) e 560 nm (absorção máxima do corante
vermelho).
Posteriormente, lavou-se a coluna com água destilada e, então, armazenou-
se a mesma na solução de azida de sódio 0,001%.
3. Equipamentos utilizados
3.1. Equipamentos e vidrarias
• Espectrofotômetro FEMTO 800XI;
• Software: FEMTOScan;
• Cubetas de caminho ótico de 0,5 cm;
• Coluna para Cromatografia Líquida Clássica.
3.2. Reagentes
• Azul de Dextran (solução aquosa) 10 mg/ml;
• Vermelho de Fenol (solução aquosa) 1mg/ml;
• Azida Sódica 0,001% (solução protetora da fase estacionária);
• Resina Sephadex;
• Tampão Fosfato pH = 7,4.

4. 4. Leituras Obtidas
Volume Recolhido
(ml)
Leitura 660 nm
(uA)
Leitura 560 nm
(uA)
2,00 0,030 0,035
4,00 0,015 0,026
6,00 0,022 0,021
8,00 0,284 0,262
10,00 0,273 0,253
12,00 0,110 0,106
14,00 0,065 0,067
16,00 0,058 0,062
18,00 0,055 0,060
20,00 0,020 0,026
22,00 0,012 0,127
24,00 0,108 0,576
26,00 0,040 0,584
28,00 0,030 0,616
30,00 0,050 0,571
32,00 0,025 0,389
34,00 0,023 0,142
36,00 0,017 0,048
38,00 0,040 0,050
40,00 0,025 0,029
5. Discussão dos resultados
Após a eluição das amostras, verificou-se que o volume de amostra recolhido
foi maior que o volume injetado. Isso se deve ao fato de que ocorre diluição da
amostra quando esta é eluida pela coluna a partir da ação da fase móvel.
Caso desejasse trabalhar com um maior volume de amostra, seria
necessário o comprimento da coluna e, consequentemente a quantidade de fase
estacionária contida nessa coluna. Além disso, seria necessário também um volume
maior de fase móvel.

5. As leituras obtidas geraram o cromatograma acima, onde conseguimos

6. As leituras obtidas geraram o cromatograma acima, onde conseguimos