O documento descreve um relatório sobre a análise de amostras de chocolate, café solúvel e café descafeinado usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Os resultados mostram os tempos de retenção e áreas dos picos da cafeína e teobromina nos padrões e amostras. As curvas de calibração permitiram determinar os teores destas substâncias nas amostras de concentração desconhecida.

1. ver
IFRJ – Campus Maracanã
Coordenadoria de Biotecnologia
Disciplina: Técnicas de Análises Bioquímicas
Turma: BM171
Professores: Hiram Araújo e Leila Pontes
Relatório de Técnicas de AnálisesRelatório de Técnicas de Análises
BioquímicasBioquímicas
HPLC (High-Performance Liquid Cromatography)HPLC (High-Performance Liquid Cromatography)
Avaliação:
Critério: Nota:
Apresentação
Introdução
Objetivos
Material Utilizado/ Métodos
Resultados
Discussão
Conclusão
Referências Bibliográficas
Total:
Alunos: Alexandre G. Garcez
Arthur de Lima
Bruno Oliveira
Rio de Janeiro, 13 de junho de 2011.
SumárioSumário

2. Introdução Pág.: 3; 4
Objetivos Pág.: 4
Material Utilizado e Métodos Pág.: 5; 6
Resultados
Discussões
Pág.: 6; 7;
8; 9; 10
Conclusão Pág.: 10
Referências Bibliográficas Pág.: 11
Anexo Pág.: 12
1.1. IntroduçãoIntrodução

3. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) – do inglês High-performance
Liquid Cromatography (HPLC) – é o tipo de cromatografia mais utilizado, empregada para
separar e determinar as espécies em diversos materiais orgânicos, inorgânicos e biológicos.
Esse tipo de método cromatográfico caracteriza-se pelo aumento do número de pratos
teóricos, o que está relacionado com a área da fase estacionária, de modo que quanto menor
o tamanho da partícula, maior a resistência ao fluxo da fase móvel. Desta forma, para que
haja uma boa resolução, na HPLC são utilizadas partículas de fase estacionária resistentes a
altas pressões, constituindo uma estrutura mais complexa e cara (figura 1) se comparada à
cromatografia líquida clássica. A partir disso, a cromatografia de alta eficiência pode
empregada em cromatografias de adsorção, troca-iônica, partição, afinidade e exclusão.
Figura 1: Diagrama esquematizando a instrumentação utilizada na HPLC. Fonte: SKOOG, D. A. et al.
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. In: ______. Fundamentos de Química Analítica. 8. ed. São
Paulo: Thomson, 2008. p 926.
As colunas utilizadas na HPLC são comumente feitas de aço e suportam pressões de
até 5,5x107
Pa, tendo de 15 a 50cm de comprimento e de 1 a 4mm de diâmetro, sendo
algumas forradas com uma superfície espelhada, que permite um empacotamento mais

4. eficiente da coluna.
A fase estacionária da HPLC é uma resina, que pode ser de três tipos diferentes, e
que se baseiam numa estrutura sólida e rígida, diferente das resinas em gel. Já a escolha da
fase móvel depende do tipo de separação desejada: separações isocráticas requerem uma
única bomba e dois ou mais solventes misturados em proporções fixas; enquanto que nas
separações em gradiente, requere-se duas bombas que bombeiam dois solventes diferentes
em proporções pré-determinadas. Um dos requisitos com relação à fase móvel na HPLC é
que os solventes sejam altamente puros, uma vez que, caso contrário, podem danificar a
coluna e interferir no sistema de detecção.
As bombas utilizadas na HPLC podem ser de pressão constante, permitindo um
fluxo sem pulsos pela coluna, mas que pode reduzir a velocidade deste caso haja uma
redução da permeabilidade da coluna, ou também podem ser de troca constante, que
mantém sempre o mesmo fluxo através da coluna independente de alterações desta durante
a cromatografia.
Os detectores mais comuns em HPLC baseiam-se em métodos
espectrofotométricos, que lêem absorbâncias tanto no espectro do visível quanto do
ultravioleta. Também são utilizados detectores de fluorescência e detectores eletroquímicos,
de modo que nos três tipos de detectores a sensibilidade é aumentada após a amostra passar
por um processo de derivatização, em que o analito é convertido antes ou após a sua
passagem pela coluna em um derivado químico.
2.2. ObjetivosObjetivos
• Verificar a presença das metilxantinas, cafeína e a teobromina, em amostra de
achocolatado por HPLC com coluna de fase reversa (C18), além de aplicar o método
quantitativo de padronização externa para determinar o teor de cafeína.
• Discutir a respeito da eficiência e limitações da técnica utilizada.
3.3. Material Utilizado e MétodosMaterial Utilizado e Métodos

5. • Material Utilizado:
▪ Água Milli-Q
▪ Metanol
▪ Agitador Magnético com aquecimento (Marca: NovaTécnica, Modelo: NTNO3)
▪ Proveta de 100mL
▪ Béquer 50mL
▪ Vidro de relógio
▪ Bastão de vidro
▪ Funil
▪ Papel de Filtro
▪ Balão volumétrico 100mL
▪ Suporte universal
▪ Argola
▪ 2x Pipeta volumétrica de 1mL
▪ Pró pipete
▪ Solução de Carrez I K4[Fe(CN)6]
▪ Solução de Carrez II Zn(C2H3O2)2
▪ Swinex (25mm / 0,45uL)
▪ Tubo do tipo Eppendorf
▪ Seringa Syringe (1mL)
▪ Seringa
▪ Padrões de concentração TC1, TC2, TC5, TC10, TC20, TC50 em ppm (partes por milhão)
▪ Achocolatado Nescau (0,4998g) (Validade: 01/09/2010)
▪ Café Nescafé Solúvel (Validade: 01/12/2011)
▪ Café Nescafé descafeinado (Validade: 01/02/2011)
▪ Balança Scientech®
SA210
▪ UltiMate®
3000 HPLC focused (Marca: DIONEX)
▪ Coluna cromatográfica C-18 de 100 x 2,1mm com poro de 3µm
▪ Coluna cromatográfica C-18 de 100 x 4,6mm
▪ Detector de UV_VIS

6. ▪ Detector Diode Array
• Métodos:
Pesou-se aproximadamente 0,20g de chocolate em pó, em becher de 100mL.
Adicionou-se 50 mL de água milli-Q, ferveu-se por aproximadamente 5 minutos e deixou-
se em repouso até atingir a temperatura ambiente. Transferiu-se quantativamente a solução
resultante para balão volumétrico de 100mL. Adicionou-se 1 mL de cada uma das duas
soluções de carrez e após agitação, deixou-se o sistema em repouso por 5 min. Avolumou-
se então, até o traço de referência, em seguida filtrou-se, abandonando os primeiros 5 mL.
Uma pequena parte de cada uma das soluções finais filtrou-se novamente para tubos
eppendorf, usando filtro para amostra aquosa, com 25 mm de diâmetro e 0,45 µm de poro.
Com a amostra em mãos deu-se início a cromatografia no aparelho de HPLC. Usou-
se os 6 padrões (TC 1, TC 2, TC 5, TC 10, TC 20, TC 50) que já estavam prontos. Antes de
injetá-los no aparelho, lavou-se a seringa de vidro com água milli-Q 3 vezes e após rinsou-
se novamente por 3 vezes, só que com o padrão que seria injetado, repetindo este
procedimento antes de cada injeção. Feito isso, injetou-se cada padrão separadamente
esperando-se sempre o tempo de eluição completa de todos os componentes. A quantidade
injetada foi superior a 20 µL. Após, colocar-se todas os padrões no aparelho, adicionou-se a
amostra, realizando antes a lavagem da seringa 3 vezes com água milli-Q e rinsagem com a
própria amostra 3 vezes.
Por fim, realizou-se a análise da cromatografia realizada, observando-se as
características dos gráficos obtidos.
4.4. ResultadosResultados
Nossos resultados desta prática são expressos através de uma tabela adquirida pelo
computador acoplado ao HPLC, que nos expressa valores como o tempo de retenção (Ret.
Time), a área dos picos do cromatograma (Area), o peso molecular (Height), a concentração
(Amount) - além da média destes valores (Average), e o desvio padrão (Rel. Std. Dev.) - das
moléculas de cafeína e de teobromina presentes em cada um dos padrões e na amostra de

7. achocolatado, café solúvel e café descafeinado. Todos os valores a seguir são provenientes
de um detector de luz UV/Visível:
Cafeína
Sample Sample Name
Ret.Time
(min)
Area
(mAU*min
)
Height
(mAU)
Amount
(µg/mL) Type
Plates
(EP)
1 TC1 2,067 5,8715 53,1657 1,3234 MB 2816
2 TC2 2,067 10,7175 107,4134 2,4156 bMB 2943
3 TC5 2,06 27,6 270,5283 6,2208 MB 2881
4 TC10 2,06 53,4727 538,1205 12,0522 MB 2990
5 TC20 2,06 102,7172 1047,049 23,1515 MB 3047
6 TC50 2,053 213,7789 2146,645 48,1838 MB 2927
7 Achocolatado 2,06 5,0635 54,265 1,1413 BMb 3142
8 Café solúvel 2,067 47,3775 488,8662 10,6785 BMB 3114
9Ca Café descafeinado 2,067 1,7296 23,6063 0,3898 BMB 4420
Average: 2,061 59,8887 602,4553 13,4984 2964
Rel.Std.Dev: 0,22% 127,42% 127,57% 127,42% 3,64%
Teobromina
Sample Sample Name
Ret.Time
(min)
Area
(mAU*min)
Height
(mAU)
Amount
(µg/mL) Type
Plates
(EP)
1 TC1 1,44 6,3971 64,4558 1,4221 BM 1722
2 TC2 1,44 11,9196 130,7436 2,6497 BMB 1765
3 TC5 1,44 29,6647 326,5343 6,5945 bM 1773
4 TC10 1,44 56,6686 642,9679 12,5975 BM 1848
5 TC20 1,44 108,0406 1236,078 24,0175 BM 1864
6 TC50 1,44 214,482 2396,779 47,6796 M 1765
7 Achocolatado 1,44 56,2543 627,0766 12,5054 MB 1872
8 Café solúvel n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
9 Café descafeinado 1,467 22,7203 293,3458 5,0508 Rd n.a.
Average: 1,44 69,061 774,9479 15,3523 1801
Rel.Std.Dev: 0,00% 105,30% 105,40% 105,30% 3,27%
As médias dos valores e o desvio padrão apresentados são referentes apenas ao
achocolatado, por ser a amostra purificada por nosso grupo. Também é possível observar
algumas informações da tabela nos cromatogramas anexados à este relatório.
5.5. DiscussãoDiscussão

8. Ao observar os cromatogramas dos padrões observamos dois picos, eles são
referentes a teobromina e a cafeína, sendo a teobromina presente no chocolate e a cafeína
presente no café. Através destes cromatogramas é possível a elaboração de uma curva de
calibração com a concentração (em ppm) pelas áreas dos picos, adquiridas pelo aparelho.
Com a curva de calibração pudemos encontrar o teor de teobromina e cafeína em outras
amostras de concentração desconhecida. Esta curva de calibração está apresentada em
anexo, e nela podemos notar uma pequena diferença quanto a concentração prevista pelo
HPLC, isto se deve porque a curva de calibração foi realizada por meio das concentrações
teóricas do padrão, e elas divergem com as concentrações calculadas pelo aparelho, que é
mais preciso.
No cromatograma dessas amostras podemos observar que o achocolatado possui
dois picos, um maior referente a teobromina, e outra referente a cafeína, que também se
apresenta neste em menor quantidade, porém pode aumentar com o tempo de exposição do
chocolate ao ambiente, já que por conta de ambos serem alcalóides bem semelhantes da
família das metil-xantinas, sob estímulos químicos podem acabar se convertendo, e a
cafeína tende a ser um subproduto da teobromina.
No café solúvel podemos observar um pico maior que diz respeito a cafeína
presente na amostra, e no café descafeinado é possível notar que um dos picos foi
identificado como teobromina. Nenhuma das amostras de café possui teobromina, porém
no café descafeinado o programa interpretou como sendo este composto por conta do
tempo de retenção semelhante desta substância, que provavelmente é uma impureza, já que
este tempo foi informado ao aparelho e armazenado em um banco de informações, como
sendo específico à teobromina. Também é importante notar que ainda existe, mesmo que
em concentrações muito pequenas, resquícios de cafeína na amostra de café descafeinado,
pois o processo não apresenta 100% de eficiência. Normalmente é feito dissolvendo-se a
cafeína em água e posteriormente utilizando um solvente orgânico como o metileno ou
acetato etílico que irá absorver esta cafeína da água, e posteriormente pode ser decantado, e
a água evaporada para que o café retorne a forma cristalina.

9. Foi possível observar impurezas tanto nas amostras de concentração desconhecidas
como nos padrões, porém em um aparelho de HPLC isso não será um problema já que uma
curva de calibração interna será elaborada com base dos tempos de retenção informados ao
aparelho, sendo insensível, portanto, a pequenos ruídos que não deformem os picos das
substâncias alvo na purificação. Caso haja deformação a área utilizada para a elaboração da
curva pode ser também alterada, por conta disso é bastante importante avaliar os melhores
solventes e a melhor proporção entre eles para serem utilizados como fase móvel, também
pode-se usar um gradiente de polaridade, caso a forma isocrática não apresente uma
qualidade de purificação aceitável, mesmo após a alteração das proporções da fase móvel.
Tanto a cafeína quanto a teobromina possuem um caráter predominantemente
apolar, porém a cafeína costuma ser mais polar quando está em condições idênticas as
submetidas a teobromina, isto se deve por conta da diferença entre as constantes de
protonação das duas substâncias. Quanto mais moléculas estiverem protonadas, maior será
o caráter apolar desta substância, e conseqüentemente, sob o efeito de uma fase móvel
apolar, ela eluirá mais rapidamente, por conta de sua fraca interação com a fase
estacionária. Neste ensaio em particular podemos observar que a primeira espécie a eluir é
a teobromina, portanto ela possui um caráter apolar mais acentuado nessas condições.
O uso de água junto ao metanol aumenta a polaridade da fase móvel, o que é
importante, pois caso a força da fase móvel seja muito acentuada muitas espécies podem
eluir em conjunto, carreadas facilmente por ela, e independente de suas pequenas diferenças
de polaridade acabarão aparecendo no cromatograma em tempos de retenção bem
próximos, sendo assim a purificação não teria a eficiência desejada. Uma polaridade muito
acentuada faria exatamente o contrário, aumentando muito o tempo de retenção das
amostras e isto diminuiria a eficiência do ensaio, pois demoraria mais do que o desejável.
É importante também discorrer a respeito da eficiência do HPLC em comparação a
outras cromatografias líquidas, o que é possível observar no cromatograma quando
observamos a largura da base dos picos. Com o aumento do número de pratos teóricos, por
conta da diminuição das partículas utilizadas como fase estacionária, temos maiores
“obstáculos” para as substâncias que eluem, desta forma é possível separar substâncias bem
semelhantes, como a cafeína e a teobromina utilizadas neste ensaio. Outros fatores como o

10. diâmetro e tamanho da coluna podem interferir na cromatografia, no nosso caso a coluna
utilizada no cromatógrafo com detector UV possui um diâmetro menor, em comparação a
que possui um detector Diode Array, e como possuem o mesmo tamanho e mesma fase
estacionária, a eficiência de separação é maior no primeiro.
O detector Diode Array quando comparado ao detector UV apresenta uma melhor
eficiência, tendo uma sensibilidade maior, já que pode mostrar diferentes substâncias no
processo de separação que não seriam detectadas no detector UV por não absorverem luz
no espectro de onda definido.
6.6. ConclusãoConclusão
No HPLC podemos observar uma eficiência muito maior comparado as outras
cromatografias líquidas, como discutido isto acontece por conta do aumento de número de
pratos teóricos, que independente do caráter da cromatografia (seja de exclusão, adsorção,
troca iônica, bioafinidade, etc) irá gerar maiores “obstáculos” ou estabelecer interações
mais íntimas com as substâncias eluidas, permitindo portanto a observação de pequenas
variações nas características de substâncias distintas, porém semelhantes, sendo possível
portanto separações que não eram realizadas em outras cromatografias.
No ensaio desta prática foi possível a purificação, e a discussão a respeito dos
resultados obtidos, quanto a eficiência e a interpretação dos dados, mostrando inclusive a
importância do técnico entender os detalhes do funcionamento do aparelho, para que não
chegue a resultados errôneos por conta das informações armazenadas no sistema.

11. 7.7. Referências BibliográficasReferências Bibliográficas
Literatura:
1. SKOOG, D. A. et al. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. In: ______.
Fundamentos de Química Analítica. 8. ed. São Paulo: Thomson, 2008. p 924-
945

12. 0,00 0,13 0,25 0,38 0,50 0,63 0,75 0,88 1,00 1,13 1,25 1,37 1,50 1,62 1,75 1,87 2,00 2,12 2,25 2,37 2,50 2,62 2,75 2,87 3,01
-50
125
250
375
500
625
80007_06_2011_CAFEINA#8 Cafesoluvel UV_VIS_1
mAU
min
1-0,2732-0,4203-0,587
4-1,1205-1,213
6-1,473
7-1,9208-Cafeína-2,067
9-2,57310-2,72711-2,893
WVL:272nm
0,00 0,13 0,25 0,38 0,50 0,63 0,75 0,88 1,00 1,13 1,25 1,37 1,50 1,62 1,75 1,87 2,00 2,12 2,25 2,37 2,50 2,62 2,75 2,87 3,00
-200
500
1.000
1.500
2.00007_06_2011_CAFEINA#9 Cafedescafeinado UV_VIS_1
mAU
min
1-0,127
2-0,340
3-1,220
4-Teobromina-1,467
5-1,7406-1,9137-Cafeína-2,0678-2,207
9-2,57310-2,72711-2,893
WVL:272nm
Anexo
(da esquerda para a direita: Achocolatado, Café Solúvel, Café Descafeinado)
0,00 0,13 0,25 0,38 0,50 0,63 0,75 0,88 1,00 1,13 1,25 1,37 1,50 1,62 1,75 1,87 2,00 2,12 2,25 2,37 2,50 2,62 2,75 2,87 3,01
-100
200
400
600
800
1.000
1.20007_06_2011_CAFEINA#7 Achocolatado UV_VIS_1
mAU
min
1-0,2932-0,3273-0,5074-0,587
5-1,1136-1,200
7-Teobromina-1,440
8-Cafeína-2,060
9-2,327
10-2,71311-2,880WVL:272nm