Aula sobre Cromatografia Líquida de alta eficiência.

1. Princípios básicos e Aplicações em
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(HPLC)
Wilder Douglas Santiago
Químico/PhD
wilderdsantiago@gmail.com

2. Aplicações da Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (HPLC)
HPLC
Toxicologia
Cosméticos
Fármacos
Pesticidas
Alimentos
Proteínas
Aminoácidos
Corantes
Pré-requisito: a amostra deve
ser solúvel na fase móvel

3. Histórico
outras fases estacionárias utilizadas: CaCO3 e sacarose
Em 1903 (século XX), o botânico russo M. Tswett conseguiu
separar pigmentos vegetais passando, através de uma coluna
contendo inulina em pó (um carboidrato), uma solução de
pigmentos de plantas dissolvidos em um hidrocarboneto.
Obteve um registro colorido do processo de separação !!!
GREGO → croma: cor ; grafia: registro = CROMATOGRAFIA
croma grafia
Inulina

4. O inventor
Mikhail Tswett

5. Evolução das Técnicas Cromatográficas
1903: Tswett – CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC)
extratos vegetais; coluna com Inulina/CaCO3; éter de petróleo
1938: Izmailov e Shraiber–CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD, TLC)
extratos vegetais; placa de vidro c/ alumina
ERA da “Cromatografia Moderna”: Prêmios Nobel – 1937, 1938, 1939.
1941: Martin e Synge – CROMATOGRAFIA GASOSA (CG, GC)
1952: Martin e James – CROMATOGRAFIA GASOSA (CG, GC) – P.Nobel
Décadas de 1960/1970
Karr, Jentoft, Gouwn, Huber, Hulsman, Snyder e Kirkiland (partículas
homogêneas)
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE, HPLC)
High Pressure Liquid Chromatography

6. Evolução das Técnicas Cromatográficas
Evolução partículas com o tempo....
1969: J.J.Kirkland da DuPont desenvolveu um processo para
produzir partículas de sílica com porosidade e tamanho controlados,
para preencher as colunas cromatográficas.

7. Evolução das Técnicas Cromatográficas
2000: Cromatografia Ultrarrápida – UHPLC
UPLC – “patente de nome”
UHPLC desenvolveu-se com a introdução das partículas de fases estacionárias
(FE) porosas ≤ 2 µm, juntamente com a busca contínua por análises mais
rápidas e eficientes. Desde a sua introdução em 2004, a UHPLC vem ganhando
espaço em todas as áreas de aplicação da HPLC em decorrência de suas
vantagens.
• tempo de análise;
• melhor resolução;
• detectabilidade;
• economia de fase estacionária e fase móvel;
• pequeno volume de amostra;
• transferência de um método HPLC → UHPLC;
• grande variedade de colunas e equipamentos;
• Química Verde.

8. Definição:
1) Método de separação que fundamenta-se nos diferentes graus de interação
dos solutos com a fase móvel e estacionária. Interações diferentes
originam velocidades de migração diferentes e, portanto, o processo de
separação em si.
2) Método de análise de substâncias em uma mistura, que envolve a
distribuição diferencial dessas substâncias em um sistema heterogêneo
bifásico.
FASE MÓVEL (aquela que se “move” através da coluna): líquido, gás ou fluido supercrítico
FASE ESTACIONÁRIA (aquela que permanece “fixa” dentro da coluna): líquido ou sólido
eluente eluato
eluição
O que é cromatografia???
Coluna

9. Analogia
O processo cromatográfico pode ser comparado a um
grupo de abelhas e moscas sobrevoando uma certa
região: ao passarem por uma flor, espera-se algum
efeito sobre as moscas e abelhas.
Fase estacionária Analitos

10. Analogia
O processo cromatográfico pode ser comparado a um
grupo de abelhas e moscas sobrevoando uma certa
região: ao passarem por uma lata de lixo, espera-se
algum efeito sobre as moscas e abelhas.
Fase estacionária Analitos

11. Detector
Analito
Coluna
Princípio

12. Princípio

13. T1
T2
T3

14. Interações
• Ligação de hidrogênio
• Dipolo induzido-dipolo induzido (Forças de van der Waals ou de Forças de
Dispersão de London)
• Atração eletrostática

15. Entendendo o cromatograma - conceitos

16. Entendendo o cromatograma - conceitos
Migração Diferencial
Base da separação cromatográfica
Diferentes velocidades médias que as moléculas dos solutos
migram através da coluna

17. Entendendo o cromatograma - conceitos
Tempo necessário para a eluição de um componente não retido

18. Assimetria dos picos
Nunca serão totalmente simétricos, pois o movimento da fase móvel
distorce o formato dos picos, que só seriam totalmente gaussianos se a
fase móvel permanecesse parada.
Entendendo o cromatograma - conceitos

19. A extensão do alargamento de uma banda depende do
tempo que a FM fica em contato com a FE, o qual por sua
vez depende da vazão da FM.
• VOLUME DE RETENÇÃO (VR) é o volume da fase móvel
necessário para eluir o analito a uma dada vazão (F).
Volume de retenção, VR = tR F
• VOLUME MORTO (VM) é o volume total de solvente na coluna entre
as partículas da fase estacionária (partículas não porosas) e no
interior dos poros das partículas (partículas porosas, tipo esponja).
Portanto, se o tempo para que a fase móvel ou o soluto não retido
passe pela coluna é tM, e a vazão é F:
VM = tM F
Entendendo o cromatograma - conceitos

20. ▪ FATOR DE RETENÇÃO*: o fator de retenção (k) é o grau de
retenção de um componente da amostra na coluna, sendo definido
como o tempo necessário para eluir o pico (tR) menos o tempo
necessário para a FM passar através da coluna (tM).
k =
tR – tM
tM
=
t‘R
tM
De acordo com Snyder,
1<k<10
Entendendo o cromatograma - conceitos

21. Entendendo o cromatograma - conceitos
• O fator de seletividade a (ou fator de separação) para os solutos 1 e
2 é definido como a razão entre a constante de distribuição do soluto
mais retido (2) e a constante de distribuição para o soluto menos
retido (1).
• A seletividade deve
ser > 1,0 para que haja
a separação dos picos.
• Seletividade é
dependente de muitos
fatores que afetam K
tal como a natureza da
FE, composição da FM,
e propriedades dos
solutos.
Seletividade

22. Entendendo o cromatograma - conceitos
• A resolução Rs de uma coluna nos diz o quanto duas
bandas se distanciam uma em relação a outra em
comparação com as suas larguras.
• A resolução fornece uma medida quantitativa da
habilidade da coluna em separar dois analitos.
Rs = (tR)2–(tR)1
w1 + w2
2 Rs = (tR)2–(tR)1
(w1 + w2)/2
Ideal:
Rs > 1,5
Resolução

23. Eficiência e pratos teóricos
“Martin & Synge em 1952, a cromatografia é comparada com a
destilação, por também ser uma técnica de separação”
Entendendo o cromatograma - conceitos

24. Trazendo esse modelo de concepção para a cromatografia
“a coluna cromatográfica teria também seus “pratos teóricos”,
isto é, etapas de equilíbrio (retenção/liberação) ao longo da coluna,
sem lugar definido para ocorrer, mas com um número de estágios
hipotéticos de equilíbrio (etapas teóricas) recorrente, que dependeria
do comprimento da coluna, da temperatura, da natureza da fase
estacionária, da natureza da substância em retenção/liberação e, no
caso, também da natureza da fase móvel, pois, dependendo da fase
móvel, ela pode interagir mais ou interagir menos com a substância
em processo e assim aumentar ou diminuir o número de etapas de
retenção/liberação. “
Entendendo o cromatograma - conceitos

25. O número de pratos teóricos, N, de uma substância, uma medida
da eficiência de separação da coluna, vai depender dos mesmos
parâmetros, com relação similar, na equação:
em que tR é o tempo de retenção de pico da substância
e Wb é a largura do pico da substância medida na sua
base. N é adimensional, pois tR e W são medidas de
tempo.
Entendendo o cromatograma - conceitos
N = 16 tR
wb
2
N = 5,546 tR
W ½
2
Para picos mal
resolvidos

26. Entendendo o cromatograma - conceitos