O documento discute diferentes tipos de marcadores moleculares e suas aplicações em genética e melhoramento de plantas. Aborda marcadores como RFLP, RAPD, microssatélites, AFLP e SNPs, explicando suas vantagens e desvantagens. Também apresenta informações sobre o avanço da genômica, com a sequência de genomas de diversas espécies vegetais.

1. Marcadores e Genômica
Engenheiro Agrônomo
Mestrando em Agronomia - Genética e Melhoramento de Plantas
Thiago Martins Pinheiro
thiago_mpinheiro@yahoo.com.br

2. Marcadores moleculares

5. Homozigotos e heterozigotos não são
diferenciados

6. Indivíduos
homozigotos e
heterozigotos
são diferenciados

7. Marcadores moleculares

12. Importância
• Melhoramento
– Marcadores moleculares ligados a diferentes
características de importância econômica tem
sido desenvolvidos, permitindo a seleção
indireta de características desejáveis em
gerações precoces, reduzindo tempo, fontes e
energia necessários.
• Estudos genéticos
– São ferramentas úteis para detectar variações
no genoma, o que aumenta o poder de análise
genética das plantas.

13. Importância
• Estudos de caracterização de populações
• Avaliação de germoplasma e populações de
melhoramento:
– Variabilidade
– Diversidade genética
– Classificação
– Distância genética
– Filogenia;
• Construção de coleções nucleares;

14. Importância
• Estrutura de populações
– Fluxo de genes
– Sistema de cruzamento
– O tamanho efetivo
• Evolução
• Construção de mapas genéticos;
• Mapeamento de QTLs
•Seleção assistida

15. Tipos de marcadores
• Marcadores isoenzimáticos
• Marcadores RFLP
• Marcadores baseados em PCR
–Marcadores RAPD
–Marcadores microssatélites
–Marcadores AFLP
–Marcadores SNPs

16. Marcadores isoenzimáticos
• Termo introduzido por Market & Moller (1959)
• Designa formas moleculares múltiplas de
enzimas que ocorrem em um mesmo
organismo e membros da mesma espécie
• Detecção, isolamento, e distinção: métodos
bioquímicos = cromatografia, filtração gélica,
eletroforese, etc.
• Controle genético: monogenético, co-
dominante = híbridos

17. Marcadores isoenzimáticos
• Aplicações:
–Caracterização da variabilidade genética de
populações naturais e espécies cultivadas;
–Estudos de evolução e dispersão de espécies e
análises filogenéticas;
–Identificação de ligação gênica entre isoenzimas
e caracteres de herança simples e complexa
–Identificação de acessos e cultivares;
–Seleção indireta de caracteres de interesse
agronômico;
–Aumento na resolução de mapas de ligação

18. Marcadores isoenzimáticos
• Vantagens
–Herança mendeliana simples
–Co-dominância
–Técnica barata
–Operacionalmente acessível
–Determinação genotípica dos locos em qualquer
parte da planta
–Análise simultânea de vários locos isoenzimáticos
–Não-detecção de efeitos deletérios, epistáticos
ou pleinotrópicos

19. Marcadores isoenzimáticos
• Desvantagens
–Cobertura reduzida do genoma (nº de locos
detectáveis)
–Baixo nível de polimorfismo por loco
–Especificidade de algumas isoenzimas em certas
partes da planta
–Expressão de certas enzimas é influenciada pelo
ambiente e estádio de desenvolvimento da
planta
–Complexidade de alguns zimogramas

20. Marcadores RFLP
• Polimorfismo no comprimento de fragmentos
de restrição (Restriction Fragment Length
Polymorphism)
• Enzimas de restrição  “tesouras” moleculares
• Criação/eliminação de sítios de restrição 
substituição ou modificação de par de bases,
deleções, inserções, inversões ou translocações

22. Marcadores RFLP
• Detecção
–Extração e purificação do DNA
–Tratamento com enzimas de restrição
–Separação por eletroforese em gel de agarose
–Transferência para suporte sólido (membrana de
náilon ou nitrocelulose)
–Fixação por alta temperatura ou luz UV
–Hibridização com sonda radioativa ou
quimioluminescência
–Autoradiografia (Raio X)

23. Marcadores RFLP
• Vantagens
–Co-dominância
–Não afetados por pleiotropia, epistasia ou
variações ambientais
–DNA extraído de qualquer parte do organismo
–Não depende do estádio de desenvolvimento do
organismo
–Resultados altamente estáveis e reproduzíveis
–Ampla cobertura do genoma
–Disponibilidade de diversas enzimas de restrição

24. Marcadores RFLP
• Desvantagens
–Desenvolvimento de marcadores RFLP é
caro e trabalhoso
–Não permite automatização
–Inexistência de biblioteca de sondas para
espécies “menos importantes”

26. O marcador RFLP usa a técnica do
SOUTHERN BLOTTING

29. Marcadores SNPs
Vantagens
• Alta densidade no genoma
• Estáveis do ponto de vista
evolucionário
• Genotipagem dos SNPs não
se baseia na medida de
comprimento dos alelos
• Distinção dos alelos pode
ser automatizada
• Taxa de mutação
relativamente baixa
Desvantagens
• Alto custo de
desenvolvimento e
genotipagem

30. Marcadores RAPD
• DNA polimorfico amplificado ao acaso
(Random amplified polymorphic DNA)
• Primer curto (10 nucleotídeos), de sequência
arbitrária
• Amplificações de fragmentos de DNA ao acaso
• Detecção normalmente feita em gel de
agarose corado com brometo de etídio,
visualizado sob luz ultravioleta

31. Marcadores RAPD
• Vantagens
–Técnica simples, fácil e rápida de se obter
resultados
–Custo relativamente reduzido
–Aplicável em qualquer organismo
–Não emprega radioatividade
–Não necessita mão-de-obra altamente
especializada
–Não exige sequenciamento de nucleotídeos nem
desenho de primers específicos
–Necessidade mínima de DNA necessária

32. Marcadores RAPD
• Desvantagens
–Baixo conteúdo de informação genética em cada
loco (dominância)
–Baixa reprodutibilidade dos resultados (bastante
sensível a pequenas modificações
–Requer certa experiência com procedimentos
moleculares: preparo de soluções-estoque e
componentes da reação; manipulação cuidadosa
de micropipetas, reagentes e enzimas;
programação de termocicladores; etc

36. Marcadores microssatélites - SSR
• Sequência Simples Repetida (Simple Sequence
Repeat)
• 1 a 6 nucleotídeos repetidos em tandem (AACT 
AACTAACTAACTAACTAACT)
• Repetições
–Perfeitas  não são interrompidas
–Imperfeitas  interrompidas por bases não
repetidas
–Compostas  duas ou mais repetições estão
dispostas adjacentes
–Simples  Apenas uma repetição

37. Marcadores microssatélites - SSR
• Os produtos amplificados são observados em gel de
poliacrilamida desnaturante ou não-desnaturante, ou
em gel de agarose de alta resolução, corados com
brometo de etídio ou nitrato de prata
• Cada microssatélite constitui um loco genético
altamente variável, multialélico e de grande conteúdo
informativo
• Natureza altamente informativa + especificidade +
rapidez = eficiente ferramenta para estudos de genes
eucarióticos
• Microssatélites desenvolvidos para uma espécie
podem ser utilizados com sucesso em outras espécies

38. Marcadores microssatélites - SSR
• Uso
–Mapeamento genômico
–Mapeamento comparativo
–Estudos de ligação
–Identificação de genótipos
–Proteção de variedades
–Avaliação de pureza de sementes
–Utilização e conservação de germoplasma
–Estudos de diversidade
–Análise gênica e de QTLs
–Análise de pedigree
–Seleção assistida por marcadores
–Análise de bibliotecas para clonagem de genes

39. Marcadores microssatélites - SSR
Vantagens
• Uso fácil e eficiente
Desvantagens
• Necessidade de serem
isolados e desenvolvidos
especificamente para cada
espécie, não sendo possível
desenho de “primers
universais”
• Desenvolvimento 
processo demorado,
trabalhoso e com alto custo

40. Exemplo de Microssatélites

41. Marcadores AFLP
• Polimorfismo no comprimento de fragmentos
amplificados (Amplified Fragment Lenght
Polymorphism)
• Amplificação do DNA via PCR para detectar
diferenças em um conjunto de fragmentos
selecionados e digeridos com enzima de
restrição
• Crucial utilização de DNA genômico altamente
puro  garantir completa digestão

42. Marcadores AFLP
• Utiliza duas enzimas de restrição, uma de
corte raro e outra de corte frequente
• Os produtos da amplificação são separados
em gel de poliacrilamida desnaturante (alto
nível de resolução). Polimorfismo detectado
por presença ou ausência de bandas
• Revelação feita com radioatividade,
visualização por auto-radiografia; nitrato de
prata ou fluorescência

43. Marcadores AFLP
• Uso:
–Mapas de ligação
–Clonagem de genes
–Acessar diferenças genéticas entre indivíduos,
populações e espécies
–Estudos filogenéticos
–Discriminação de variedades
–Registro de variedades (testes de distinção,
homogeneidade e estabilidade)
–Monitoramento da herança de características
agronômicas

44. • Uso
– Diagnóstico de doenças
– Análise de pedigree
– Análise de diversidade genética
– Análise de marcadores ligados a características
de interesse
– Análise de erosão genética causada por
melhoramento
– Estimativa de taxas de fecundação cruzada em
populações melhoradas
Marcadores AFLP

45. Marcadores AFLP
• Vantagens
–Capacidade de analisar várias regiões
diferentes do genoma
–Capacidade de analisar grande número de
locos polimórficos simultaneamente
–Alta reprodutibilidade e robustez
–Número de marcas geradas virtualmente
ilimitado
–Alto valor informativo
–Herança mendeliana

46. Marcadores AFLP
• Desvantagens
–Nível de polimorfismo detectado é menor
quando comparado com outros
marcadores
–Dificuldade de identificar variantes alélicos
em um loco específico

47. Marcadores SNPs
• Polimorfismo em único nucleotídeo (Single
Nucleotide Polymorphism)
• Detectam polimorfismos de uma única base no
genoma
• Deve ocorrer em pelo menos 1% da população para
ser considerada SNP
• 90% do polimorfismo no genoma humano são SNPs
• Sequenciamento em larga escala de espécies
vegetais tem permitido evidenciar presença de
SNPs (Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Glycine
max, Cucumis melo, Zea mays, etc)

48. Marcadores SNPs
• Natureza bi-alélica e abundantes no genoma
• Estimativas
–Genoma humano: 1 SNP : 1000 bases ou menos
–Milho: 1 SNP : 70 bases
• Visualização (técnicas):
–Cromatografia líquida de alta pressão
desnaturante (DHPLC)
–Polimorfismo conformacional fita única (SSCP)
–Outros métodos de clivagem química ou
enzimática

49. Marcadores SNPs
• Indispensável validação experimental dos dados
obtidos para se conhecer o potencial informativo
de cada polimorfismo
• Métodos de validação e genotipagem disponíveis
atualmente
–Microarranjos
–Cromatografia líquida de alta pressão
desnaturante (DHPLC)
–Espectrometria de massa

50. Marcadores SNPs
–Ensaios com extensão de primers
–PCR em tempo real
–Minissequenciamento
–Sequenciamento de única base
–Digestão por enzimas de restrição (RFLP)

51. Marcadores SNPs
• Uso:
–Mapas de resolução 100x maior que os existentes
–Melhoramento assistido por marcadores
moleculares
–Construção e integração de mapas genéticos e
físicos
–Estudos de genética de populações
–Estudos de filogenias

52. Marcadores SNPs
–Análise de genes
–Descobertas da base genética molecular de
importantes características vegetais
–Associação entre doses de alelos e expressão
fenotípica (poliploides)
–Identificação de variedades

53. Características RFLP RAPD SSR AFLP
Ação gênica Co-dominante Dominante Co-dominante Dominante
Número de
alelos/loco
Multi-alélico 2 Multi-alélico 2
Disponibilidade de
marcadores no
genoma
Ilimitada Ilimitada Ilimitada Ilimitada
Nível de polimorfismo Alto Alto Muito alto Muito alto
Necessidade de
procedimentos
prévios
Construção
bibliotecas
genômicas ou
cDNAs
Não há
Desenho de
primers
Não há
Concentração de DNA 10 mg 25 ng 50 ng 500 ng
Marcação radioativa Sim / não Não Não Sim / não
Reprodutibilidade Alta Média Alta Média
Investimento Alto Médio Alto Médio

54. Genômica
• Genoma: Conjunto completo de cromossomos de
uma espécie
• Genômica: É o estudo da estrutura e função dos
genomas inteiros
• Genômica estrutural e funcional
• Genômica estrutural: Estuda a estrutura dos
genomas inteiros através do sequenciamento do
DNA dos mesmos
• Genômica funcional: Estuda a função das
sequências obtidas na genômica estrutural

55. Espécies sequenciadas e em andamento até o dia 10 de Junho de 2009
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome)

56. Espécies sequenciadas e em andamento até o dia 24 de Novembro de
2009 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome)

57. Espécies sequenciadas e em andamento até o dia 21 de Abril de 2010
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome)

58. Espécies sequenciadas e em andamento até o dia 3 de Maio de 2010
Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/genome

59. Genômica: Exemplos de plantas sequenciadas
• O genoma da primeira planta a ser totalmente
seqüenciado foi a da Arabidopsis thaliana em 2001.
• Em seguida foi sequenciado o do Arroz (Oryza
sativa) em 2002.
• O Brasil vem se destacando nessa área e
participou do sequenciamento de: A cana-de-
açúcar (Saccharum officinarum), o eucalipto
(Eucalyptus ssp), o Café (Coffea ssp), o milho e a
banana (único ainda em andamento).

60. Exemplos de alguns microrganismos
fitopatogênicos sequenciados
•Xylella fastidiosa (Amarelinho dos citros),
•Xanthomonas campestris (cancro cítrico),
•Magnaphorte oryzae (brusone)

61. Xylella fastidiosa

62. Xanthomonas campestris
Magnaphorte oryzae

63. Exemplos de algumas espécies vegetais
sequenciadas
• Eucalipto (Eucalyptus globulus subsp. globulus)
• Cana-de-açúcar (Saccharum officinarum)
• Café (Coffea arabica)
• Milho (Zea mays)

65. Genômica no Brasil
• 1998: criação de uma
rede de laboratórios para
sequenciamento: rede
ONSA
• Instituto virtual.
• Criado e financiado pela
FAPESP

66. Estudos de genômica comparativa ou sintenia
• Uma análise comparativa entre
monocotiledôneas mostrou que o genoma do
cloroplasto da cana de açúcar é muito semelhante
ao do milho mas não ao do arroz e do trigo.

67. Fonte: Zimmer et al. (2003)

68. Bioinformática
• Análise da informação biológica utilizando a
ciência da computação.
• Envolve desenvolvimento de bancos de dados
on-line e de algoritmos (programas) para
comparação de dados genéticos.
• Genômica Estrutural e Funcional
• Proteômica e Metabolômica
• Construção de mapas genéticos e mapeamento
de QTLs

69. Diferentes abordagens
para o estudo da
Biotecnologia em plantas
e suas interrelações

70. Desafios...
• Produzir mais alimentos em menor área, com
menos água e menos insumos
• O desenvolvimento de uma agricultura
sustentável é a chave para a diminuição da
pobreza, segurança alimentar e proteção
ambiental
Considerações finais

71. A aplicação criteriosa e segura da biotecnologia
na agricultura, juntamente com a utilização
racional dos recursos genéticos, podem
aumentar a lucratividade dos agricultores,
produzir melhores alimentos, e menor
dependência de agroquímicos.

72. thiago_mpinheiro@yahoo.com.br