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Os clones genómicos podem ser obtidos por PCR a partir de DNA cromossómico extraído das células.
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Biomol 1

  1. 1. FAGOS LAMBDA: comporta fragmentos maiores que plasmídeo. Limite de tamanho relacionado com capacidade de empacotamento para encaps. Propagam genoma dentro de bactérias. Dentro do DNA viram são mantidas informações para infecção e replicação do genoma. Célula hospedeira norteia o comportamento, replicação rápida reproduz vírus mais rápido. Infectam de modo horizintal. O genoma do fago λtem cerca de 50 kb. Na extremidade esquerda estão localizados os genes que codificamas proteínas da cabeça e cauda; os genes que codificamproteínas envolvidasno ciclo lítico mapeiam na extremidade direita. A região central do genomapode ser removida ou substituídapor DNAexógeno sem afectara capacidade de replicação do fago, permitindo a inserçãode DNA exógeno até≈25 kb. BIBLIOTECA GENÔMICA: fragmentação permite amplificação dos genes individuais, produzindo massa clonada. Uma amostra do DNA genômico total é primeiro separada mecânicamente ou parcialmente digerida por enzimas de restrição em grandes fragmentos. Essa população quase aleatória de fragmentos de DNA superpostos é, então, separada por eletroforese em gel para isolar trechos com de 15 Kb de comprimento. Ligantes sintéticos são unidos às pontas desses fragmentos, são formadas pontas adesivas, eos fragmentos são, então, inseridos em um vetor, tal como o DNA do fagol, preparado com as mesmas pontas adesivas. As E.coli são, então, infectadas com esses fagos recombinates. O lisado resultante contém fragmentos de DNA humano abrigados em um número suficientemente grande de vírus para garantir que quase todo o genoma esteja representado. Estes fagos constituem uma biblioteca genômica. DNA POLIMERASE REPLICATIVA: fidelidade com a replicação, as outras geral conseqüências compa ou incompatíveis com a célula por introdução de alterações nos caracteres hereditários. REPARO DE DNA: não possui compromisso com a informação. Complexo replicativo é interrompido até reparar. ENDO reparam no meio. EXONUCLEASES reparam falhas nas pontas. FOTORREATIVAÇÃO ENZIMÁTICA: remove dímeros de pirimidina formados por exposição do DNA ao UV, enzimas revertem a modificação, se ligam a ela mesmo na ausência de luz, mas só reagem com luz. REPARO DE BASES ALQUILADAS: guanina é muito afetada por agentes alquilantes, uma transferase reconhece e remove o grupamento metila causador da mutação, há degradação da enzima nesse processo. EXCISÃO DE BASES: clivagem da ligação base nitrogenada-desoxirrobose por glicosilases, preenchendo com a base correta pela DNApol (ocorre na correção da desaminação da citosina a uracila – remove a base, uma endo cliva em região adjacente, DNApol preenche e ligase liga). EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS: incisão endonucleotidica dos dois lados da lesão seguida de preenchimento pela DNApol, reparo de regiões curtas ocorre constitutivamente e de longas depende de indução por ocorrência de lesão. PROTEÍNA-TUS: interrompe movimento da forquilha, desencadeia sistema de reparo. Se liga à sequência consenso, funcionando como um terminador para a helicase. Ocorrência de erros: RADICAIS LIVRES (atuam sobre fita dupla), RADIAÇÃO, ELEMENTOS MÓVEIS (inserção de sequência heteróloga – geralmente não detectáveis). NATURAIS: aumento significativo de uma das bases, induz erros. BYPASS: base mutante é aceitada e qualquer base com pareamento é inserida, gerando um mutante. Frequência de mutações geralmente identificadas por surgimento de colônias diferentes. MENOR numero de mutantes significa reparo POUCO ativo. Reparo MUITO ativo perpetua mutações. Mutação em sequências conservadas levam em geral a morte celular, não havendo contabilidade de mutantes nas colônias. BASES MAL PAREADAS: responsabilidade do sistema de correção de erro são ptnas codificadas pelos GENES mut. Remove segmentos de fita simples contendo mal pareamento. Um sinal específico direciona o sistema de excisão do erro para a fita recém sintetizada (reconhecimento das sequências GATC próximas ao erro). Fitas com GATC metiladas são as parentais, a outra é a recém. Tb reconhece adições, deleções e substituições. REPARO POR ECOMBINAÇÃO: fita complementar não danificada é utilizada como molde na substituição do fragmento lesado. Se o molde não estiver disponível fica uma lacuna, em organismos diplóides há a mesma ou quase a mesma sequência nos cromossomos homólogos. Em E.Coli a RecA pareia as duas moléculas de DNA homólogas e catalisa reações de troca de fita. SISTEMA SOS: expressão induzida por erros graves capazes de impedir a síntese do DNA, os genes SOS dão origem a enzimas de reparo, exemplo: dímeros de pirimidina, há excisão, ficam lacunas, RecA se liga, isso desativa o repressor dos genes SOS, lexA, cuja região possui um operador SOSbox. Logo RecA repara recombinando (com troca das fitas) e por indução de genes SOS. É usada RecA- em bactérias de laboratório para que a mutação induzida seja mais eficiente e não corrigida, na célula viva ela é necessária para reduzir o efeito letal da mutação. RecA Tb cliva repressores
  2. 2. de genes virais, permitindo síntese de unidades pteicas q vão compor o capsídeo e lisar a célula. RecBCD: atuam como topoisomerases, abrindo e clivando sequências defeituosas, agregando outras ptnas. A clivagem se dá dentro do motivo chi, gerando fita simples com gap que pode ser reconhecida pela RecA. Ela então gera uma junção de Holliday e um gap em outra fita. (OLHAR DESENHO) RuvAB: também catalisam troca de fitas, são como argola ao redor da fita dupla. REPARO SUJEITO A ERRO: genes SOS umuC e umuD incorporam qualquer base com o fim de prosseguir a replicação, resgatando a viabilidade da célula. UNIÃO DE EXTREMIDADES NÃO- HOMÓLOGAS: se ocorre quebra nas duas fitas (morte e câncer – causado por radiação ionizante, quimioterápicos e radicais livres). Extremidades são justapostas para recombinar, o mesmo complexo liga as extremidades e acaba por resultar em DNA com sequência alterada. HOMÓLOGAS: muito preciso em bactérias e leveduras, cromossomo homólogo ao lesado faz cópia da sequência perdida com quebra da dupla fita e transfere ela para o sítio de quebra no cromossomo lesado, restaurando a seq original. TRANSIÇÃO: purina por purina. TRANSVERSÃO: purina por pirimidina. MUTAÇÃO SINÔNIMA: códons de um mesmo AA. SENTIDO TROCADO: introduz AA, conservada ou não, de acordo com as similaridades dos aas. SEM SENTIDO: códon de parada. FRAMESHIFT. AGENTES MUTAGÊNICOS: causam alterações conformacionais e químicas sobre genoma. TRANSPOSON: tipo de transferência horizontal, causa alterações estruturais. Incidência em regiões regulatórias são menos destrutivas, na codificante interrompe transc da ptna. RECOMBINAÇÃO SÍTIO ESPECÍFICA: garantem mecanismo de inserção de fagos e transposons. DNA móvel, não envolve recombinação homóloga. DNA RECOMBINANTE: ligar 2 ou mais segmentos de DNA gerando molécula capaz de auto-replicação no hospedeiro. DNApol usava in vitro permite amplificação do gene, sendo usadas Tb enzimas de restrição, ligases, quinases, fosfatases que introduzem modificações sobre o DNA. Número de cópias do plasmídeo dentro da célula depende da ori de rep. TRANSFORMAÇÃO: introdução da quimera (plasmídeo) dentro de hospedeiro competente (E.Coli)e verificação das colônias. Plasmídeos: é usado em insertos pequenos e que possuem pouca especificidade para se ligarem ao vetor. Contém um ou mais genes de resistência a drogas ( selecionar as bactérias transformadas)Tem tb um sítio de clonagem múltipla que apresenta muitos sítios-alvo de enzimas de restrição. É neste sítio que são inseridos os fragmentos de DNA. Alguns tem o gene Lac Z (enzima b – galactosidase - facilita a seleção das bactérias transformadas). O gene Lac Z está em contiguidade com o sítio de múltipla clonagem. Quando no plasmídeo é inserido um fragmento de DNA, esse gene é interrompido e não há produção da b -galactosidase. Essa enzima age sobre um substrato incolor chamado X-gal que é adicionado ao meio convertendo-o em um corante azul. A colônia que apresenta o plasmídeo sem o gene Lac Z interrompido fica azul (do contrário fica branca). Fagos: Para clonar fragmentos muito grandes. Cosmídeos: Parecido com o fago, porém é mais fácil para manipular por não possuir especificidade. Mini-prep (TÉCNICA DE LISE ALCALINA): Centrifugação da cultura→ Ressuspensão em tampão→adição de NAOH/SOS: lise bacteriana em pH alcalino→ neutralização do lisado (com acetato de potássio)→ centrifugação e descarte do DNA cromossômico→ DNA plasmidial no sobrenadante (com adição de isopropanol). DNA plasmidial fica em solução por renaturar mais fácil, o genômico ppta. SÍTIOS MÚLTIPLOS DE CLONAGEM: vários locais únicos de clivagem para endonucleases de restrição, os quais constituem o sítio de inserção. AUXOTRÓFICAS: dependem de nutrientes específicos. COMPATIBILIDADE PLASMIDIAL: inserir mais de um plasmídeo com origens de replicação diferentes, a célula não vê como material duplicado e descarta um deles. A origem deve ser compatível com a plataforma usada. DEFOSFORILAÇÃO previne o plasmídeo de se ligar nele mesmo. VETORES DE CLONAGEM: insertos de DNA genômico, transcrito reverso cDNA, de subclonagem ou sintético (em geral obtidos por recombinação homóloga). ATIVIDADE NÃO ESPECÍFICA: pode ocorrer
  3. 3. por erro de tamponamento ou no método de incubação. Solventes orgânicos podem ser usados para terminar reação. LIGANTES/ADAPTADORES: transformam extremidades abruptas em coesivas. TRANSFERÊNCIA WESTERN: Nesta técnica, submete-se a amostra à eletroforese em um gel de SDS poliacrilamida. Após separadas no gel as proteínas são transferidas por contato ou por um campo elétrico para a superfície de uma lâmina de polímero. Adiciona-se um anticorpo específico para a proteína de interesse. Adiciona-se um segundo anticorpo marcado radiativamente específico para o primeiro. Um auto- radiograma revela uma faixa escura onde está a proteína de interesse. Como alternativa, o segundo anticorpo pode conter uma enzima que gera um produto corado. ENZIMAS DE RESTRIÇÃO TIPO 2: sequências de reconhecimento são, em geral, constituídas por quatro a seis pares de nucleótidos, e palindrómicas. Clivagem ocorre dentro ou próxima. Bactérias que produzem endonucleases de restrição também contêm as enzimas de modificação correspondentes que metilam bases no local de reconhecimento das endonucleases. MODIFICAÇÃO DAS EXTREMIDADES DO DNA: por preenchimento parcial das extremidades 3’ recuadas, por preenchimento total, por remoção das 3’ projetadas (polimerase de DNA do fago T4, polimerase Klenow, nuclease S1 e mung bean) – extremidades coesivas são convertidas em cegas. Adição de linkers – cegas em coesivas, p minúsculo na frente. Adição de adaptadores – coesivas em coesivas diferentes. Cauda de homopolímeros – cegas em coesivas pela transferase terminal. DESFOSFORILAÇÃO: Remoção dos grupos 5’P das extremidades do DNA pela fosfatase alcalina para impedir a recircularização do vector (aumenta a eficiência de clonagem) ou a ligação intermolecular do DNA dador, em particular, a ligação de fragmentos de DNA de regiões genómicas diferentes. Tratamento com fosfatases diminuem o backgound. ISOLAMENTO DE RNAm: A cromatografia de afinidade em coluna oligo-dT éutilizada no isolamento de mRNA eucariótico. O RNA citoplásmico éconstituído fundamentalmente por RNAs ribossómicos (rRNAs) e RNAs de transferência (tRNAs). Os RNAs mensageiros (mRNAs), são muito menos abundantes, mas têm caudas poli-A que hibridam com oligo-dTs covalentemente ligados àmatriz da coluna. Após hibridação, os rRNAs e tRNAs são removidos da coluna por lavagem, sendoos mRNAs depois eluídos com um tampão de baixa concentração salina. A preparação de mRNA purificado resultante contém muitas moléculas de mRNA diferentes que codificam diferentes proteínas. ETAPAS DA CLONAGEM: preparação/escolha do vetor > ligação do vetor e incerto > transformação no hospedeiro > seleção de clones (a partir do fenótipo observado na célula – por isso é importante usar um gene repórter na cepa). PREPARAÇÃO: digestão do plasmídeo, dirigida com 2 enzimas de restrição, não dirigida com 1. Klenow ou T4-DNApol preenche extremidades 5’ proeminentes resultado da digestão. Linkers podem ser adicionados nas extremidades com o sítio de restrição desejado. Purificação do vetor pode ser feita por ELETROFORESE. O controle é feito com os plasmídeos(taxa de realização) e os incertos puros(contaminação). Taq polimerase: coloca A amais que pode ser usado a favor. Apresenta resistência a temperatura e é usada no PCR. PCR: o controle da temperatura permite que o primer anele no lugar correto. Para replicar fragmento compreendido entre dois primers, alvo inicial é o RNAm, primers de múltiplas timinas anelam na cauda poli-A que só existe nos RNA processados, por transcriptase reversa se faz o cDNA. cDNA é denaturado (96°C) para primers anelarem e haver ampliação. Ciclos consecutivos vão fornecer fragmento amplificado com enriquecimento de determinadas sequências.
  4. 4. Os clones genómicos podem ser obtidos por PCR a partir de DNA cromossómico extraído das células. São adicionados primers que ladeiam a região de DNA que se pretende clonar, sendo amplificado apenas o DNA entre os primers(incluindo os primers). Esta técnica permite obter selectivamente uma curta extensão de DNA cromossómico. Os clones de cDNA podem ser obtidos por RT-PCR a partir de mRNA extraído das células, e purificado por cromatografia de afinidade em coluna oligo-dT. O primeiro primer (oligo-dT) é depois adicionado à população de mRNAs, sendo utilizada a transcritase reversa para produzir a cadeia de cDNA complementar. Pode ser em tempo real ou não, permitindo monitoramento da progessão, permite ver a partir de qual ciclo há p sinal de interesse, por fluorescência. CURVA DE DISSOCIAÇÃO: garante se não ocorreram reações secundárias e não há sequências inespecíficas amplificadas. Há picos de fluorescência quando o fluoróforo for liberado pela temperatura. A polimerase passa em cima da sonda liberando ela, oq dá a fluorescência. KNOCKOUT: Deleção de um gene específico (ou uma família de genes) de um genoma funcional. Pode- se inviabilizar a proteína do produto, deletar determinada região, marcar ponto de deleção com K7 para saber que ocorreu, é grande, então tem q ver viabilidade. ANTI-SENSE: Função: modular a expressão gênica por hibridização seletiva a seqüência complementar do mRNA ou pre-mRNA alvo. Habilidade de atingir a expressão de genes específicos;Pode ser usado para modificar a forma de splicing. Inibição ou impedimento do transporte, splicing, 5´capping, 3 ´polyadenylatione tradução do RNA pela inibição da interação do RNA com outras moléculas como proteínas e outros ácidos nucléicos. Inibir a ligação do ribossomo (5´região); bloquear a tradução (região codificante) ou Inibir o splicing (sítio splicing). ANTI-GENE: Sob certas circunstâncias o DNA pode adotar uma conformação de TRIPLA HÉLICE, que pode ser inter ou intramolecular. Tripla hélice intermolecular são formadas pela adição de uma terceira fita seqüência específica ao sulco maior da dupla hélice de DNA. São moléculas de polipurinas ou polipirimidinas que se unem a fita rica em purina do alvo. São ligantes específicos para dupla fita de DNA. Na região PROMOTORA causa competição com fatores de transcrição, impedindo estericamente. No interior da região a ser transcrita provoca bloqueio. IRNA DE INTERFERÊNCIA: Mutagênese direcionada baseada na observação de que em muitos sistemas a expressão de um RNA dupla fita causa a degradação do mRNA correspondente. Fácil síntese e manipulação. Simples aplicação. Resistente à ação de nucleases.Baixo custo. Resposta rápida. Permite estudar ação de genes em organismos de difícil manipulação em laboratório. Necessidade de conhecimento prévio da seqüência alvo. Optimização da aplicação e do dsRNA (fita dupla de RNA).DICER: picota a fita de RNA, é uma RNase 3. Esses fragmentos vão se ligar a complexos protéicos formando os RISC (ver desenho). VERIFICAR SE O DNA É DE UM MESMO ORGANISMO: fazer o sequenciamento do genoma afim de verificar se há compatibilidade com organismos similares, ver se é euca ou proca. Se não houver similaridade no nível genômico, ver se tem no nível protéico. Uma enzima de restrição particular reconhece somente
  5. 5. uma seqüência única de bases. DNAs de origens diferentes sob a ação da mesma enzima de restrição produzem fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de dois diferentes organismos (por exemplo, bactéria e homem) podem ser ligados por renaturação das regiões de fita simples. Se os fragmentos de DNA humano são misturados com o DNA plasmidial linearizado, permitindo a ligação entre eles, uma molécula de DNA plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada. Este plasmídeo híbrido pode ser inserido numa bactéria através de transformação e então o inserto será replicado como parte do plasmídeo. MICROCHIPS: Os micro-chips de DNA são fabricados por máquinas robóticas com múltiplas pontas de impressão, que liberam gotículas de solução de DNA em posições específicas numa placa de vidro, que é do tamanho de lamínula de microscópio. A disposição de cada molécula de DNA no chip deve ser relacionada com um gene específico. Por técnicas de hibridização, cDNA preparado de RNA-m extraído de um determinado tecido apontará no micro-chip quais genes estão ativos e quais estão inativos nesse tecido. GFP: Para a localização intra-celular de uma proteína, o método mais empregado atualmente é o da proteína de fluorescência verde, ou GFP ("green fluorescent protein"). Por esse método, uma pequena seqüência de DNA que codifica para uma peptídeo fluorescente é ligado a uma das extremidades de um gene alvo. O gene alvo codificará, portanto, uma proteína recombinante, ou proteína de fusão. A maior parte dela continuará a codificar a sua seqüência nativa, mas uma pequena porção terá atividade fluorescente e assim a proteína poderá ser detectada no interior da célula. Em que compartimento celular seu produto gênico atua (ou seja, a proteína que ele codifica), Com quais proteínas ele interage, Quais funções bioquímicas específicas ele coordena.

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