O documento descreve três métodos microbiológicos para dosagem de antibióticos: diluição em série, turbidimétrico e difusão em ágar. O método da diluição em série determina a concentração inibitória mínima de um antibiótico, enquanto o turbidimétrico mede a inibição do crescimento microbiano. O método de difusão em ágar relaciona o tamanho da zona de inibição com a dose do antibiótico.

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3. INTRODUÇÃO
A potência (atividade) de um agente
antimicrobiano é determinada comparando-se
a dose que inibe o crescimento do
microrganismo sensível com a dose da
preparação padrão do agente que produz
inibição similar.
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4. MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS PARA
DOSAGEM DE ANTIBIÓTICOS
o Método da diluição em série
o Macrodiluição
o Microdiluição
o Método turbidimétrico
o Método de difusão em ágar
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5. DILUIÇÃO EM SÉRIE - MACRODILUIÇÃO
Resposta: “tudo ou nada”
MIC
Click Farna– E-learning farmacêutico MIC

6. DILUIÇÃO EM SÉRIE - MICRODILUIÇÃO
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7. DILUIÇÃO EM SÉRIE
Potência
Testa-se concomitantemente padrão e amostra:
P = CIMA X 100
CIMP
Para maior precisão, ensaia-se concentrações intermediárias
entre o tubo com concentração inibitória mínima e o
imediatamente anterior.
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8. DILUIÇÃO EM SÉRIE
Vantagens
o Mais sensível a baixas concentrações que outros métodos
o Fornece a CIM ativa da substância analisada
Desvantagens
o A precisão está relacionada ao intervalo de concentração utilizada
o Há interferência de soluções turvas ou coradas
o Há necessidade do padrão e amostra serem estéreis
NÃO É MUITO UTILIZADO
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9. MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
o Baseia-se na inibição do crescimento microbiano medido
através da turbidez (transmitância ou absorvância) da
suspensão de microrganismos adequados/sensíveis ao
composto contido em um meio com o antibiótico.
o A resposta do microrganismo é função direta da
concentração da substância.
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10. MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
Padronização do microrganismo para utilização no doseamento
35 2 ºC
20-24 h
25% transmitância
530 nm
+
Sol. fisiológica
35 2 ºC
20-24 h
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11. MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
Progressão geométrica
Triplicata
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12. MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
35 2 ºC
3 a 4 horas
0,5 mL de formaldeído 12%
Click Farna– E-learning farmacêutico Λ = 530 nm

13. MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
Potência
P
Calcula-se a potência através de métodos estatísticos
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14. MÉTODO TURBIDIMÉTRICO
Vantagens
Mais rápido
Desvantagens
o O pH pode influenciar o crescimento do microrganismo
o Há interferência de soluções turvas ou coradas (padrão e amostra não
devem precipitar em contato com o meio)
o Padrão e amostra devem ser solúveis em água ou em solventes miscíveis
em concentração tal que não interfira no crescimento
o Há necessidade do padrão e amostra serem estéreis (substâncias
termolábeis não podem ser ensaiadas por esta técnica)
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15. DIFUSÃO EM ÁGAR
Considerações gerais
Relaciona o tamanho da zona de inibição com a dose da substância
ensaiada.
O método emprega meio de cultura sólido inoculado, distribuído em
placas, em sistema de bicamada, através do qual a substância teste se
difunde.
É fundamentalmente um método físico, no qual o microrganismo é usado
como revelador.
Mas está sujeito a muitos outros fatores físicos e químicos além da simples
interação entre o fármaco e o microrganismo:
Natureza do meio
Capacidade de difusão
Tamanho da molécula
Estabilidade da amostra
É essencial que se trabalhe com réplicas, de forma a compensar os
desvios, inerentes ao ensaio ou acidentais.
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16. DIFUSÃO EM ÁGAR
Método- Testes preliminares
A partir de parâmetros especificados em ensaios anteriores e
referentes a determinação da potência de antibióticos descritos
pela Farm. Bras. IV, USP e FDA, são realizados testes
preliminares para padronizar as condições a serem utilizadas
verificando parâmetros como:
Microrganismo Concentração do inóculo
Meio de cultura Concentração do fármaco
Solução diluente
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17. DIFUSÃO EM ÁGAR
Ensaio do tipo quantitativo:
2X2 5X1
P
A1 A5
A1 A2
A2 A4
P1 P2
3X3
A3
P1
A1 A3
P3 P2
A2
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18. DIFUSÃO EM ÁGAR
Cultura de manutenção
Repique deve ser feito a cada 7 dias
Conservação: refrigerador a 4 ºC
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19. DIFUSÃO EM ÁGAR
Repique do microrganismo para utilização no doseamento
35 2 ºC
20-24 h
25% transmitância
580 nm
+
Sol. fisiológica
35 2 ºC
20-24 h
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20. DIFUSÃO EM ÁGAR
Preparo das placas
Papel de filtro
21 mL
Ágar
4 mL
Ágar inoculado
(47 ºC) Click Farna– E-learning farmacêutico

21. DIFUSÃO EM ÁGAR
Ensaio
Utilizando placas de Petri, em capela de fluxo laminar, transfere-se 21,0 mL
de meio para cada placa (camada base).
Após a solidificação desta camada, adiciona-se 4,0 mL de meio inoculado.
Assim que esta camada se solidificar, distribuir os cilindros ou templates de
aço inoxidável.
Com auxílio de pipetador automático transfere-se as alíquotas de padrões e
amostras, 200 µL, para cada orifício.
P1
A1 A3 As placas devem ser incubadas a 35ºC 2ºC e após 18-20
horas medem-se os diâmetros dos halos de inibição com
auxílio de um paquímetro.
P3 P2
A2
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22. DIFUSÃO EM ÁGAR
Preparo das placas
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23. DIFUSÃO EM ÁGAR
Preparo das soluções padrão e amostra
10mg do padrão primário ou o equivalente em
relação ao peso médio
[100µg/mL]
BV 100mL
0,8mL 1,6mL 3,2mL
BV 10mL BV 10mL BV 10mL
[8µg/mL] [16µg/mL] [32µg/mL]
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24. DIFUSÃO EM ÁGAR
E. coli B. subtilis
Diâmetro do halo é função da
concentração do antibiótico
•Relação linear: diâmetro do halo
(mm) X log da concentração
S. luteus Click Farna– E-learning farmacêutico

25. DIFUSÃO EM ÁGAR
A maneira como o antibiótico é colocado em contato com o meio
de cultura define as seguintes técnicas utilizadas para difusão em
ágar:
técnica de cilindros em placas
técnica de orifícios ou poçinhos
técnica de disco ou papel
técnica de gotas ou depósito em superfície
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26. DIFUSÃO EM ÁGAR – CILINDROS EM
PLACA
Cilindros de vidro, porcelana, aço inoxidável, alumínio
etc
Diâmetro interno: 6,0 mm 0,1 mm
Diâmetro externo: 8,0 mm 0,1 mm
Altura: 10,0 mm 0,1 mm
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27. DIFUSÃO EM ÁGAR – TEMPLATE OU
MOLDES DE AÇO
o São moldes de aço inoxidável com orifícios nos quais são colocados as
soluções padrão e amostra
o É o mesmo princípio da técnica cilindros em placa, porém o manuseio é
mais prático
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28. DIFUSÃO EM ÁGAR – ORIFÍCIOS OU
POÇINHOS
o São perfurados pequenos poços no meio de cultura através de
instrumento adequado de maneira que forme um cilindro embutido no
meio sólido
o Os halos podem ser irregulares se o instrumento que servirá para a
construção dos orifícios não for padronizado
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29. DIFUSÃO EM ÁGAR – DISCO DE PAPEL
o Discos de papel com 13 mm de diâmetro
o 60 µL
o Solução P e A com pipeta ou imersão por tempo pré definido
o Os discos podem ser colocados manualmente com auxílio de pinça estéril
sobre a superfície do meio ou através de equipamento apropriado sobre o
meio inoculado
o Amostra com alta concentração de solvente orgânico
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30. DIFUSÃO EM ÁGAR – GOTAS OU DEPÓSITO EM
SUPERFÍCIE
o Adiciona-se 2 a 3 µL da solução P e A na superfície do ágar com
microsseringa
o Permite automação
o Pouco utilizado
o A superfície do gel deve estar seca
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31. DIFUSÃO EM ÁGAR
Vantagens
o Em todas as técnicas deste método as amostras não precisam estar
estéreis
o As técnicas de cilindro e de orifício mostram-se mais sensíveis à
pequenas concentrações que a de disco
o Técnica de disco é mais simples, rápida e de melhor precisão, além de
permitir o ensaio com altas concentrações de solvente orgânico
Desvantagens
o As técnicas de cilindro e de orifício são mais trabalhosas e necessitam de
cuidados extremos no manuseio das placas
o Suspensões interferem nas técnicas de cilindro e de disco
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32. DIFUSÃO EM ÁGAR
Fatores que interferem no ensaio:
Conteúdo de água presente no meio
Qualidade do ágar
Densidade do inóculo
pH do meio e das soluções utilizadas
Tempo e temperatura de incubação
Forma ativa da substância
Coeficiente de difusão da substância e velocidade de
crescimento do microrganismo
Halos pequenos: deixar a substância difundir antes de incubar
Halos grandes: incubar as placas antes de colocar as amostras
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33. DIFUSÃO EM ÁGAR
Cálculo dos resultados
Pot = Antilog M x 100
M = F/b b = E/I I = log R
F = 1/3[(A1+A2+A3)-(P1+P2+P3)]
E = ¼[(A3+P3)-(A1+P1)]
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34. DIFUSÃO EM ÁGAR
Cálculo dos resultados
P1 P2 P3 A1 A2 A3
I 14,0 15,5 16,4 13,2 15,2 17,0
II 13,0 15,3 16,6 13,3 15,0 16,3
III 13,0 15,2 16,4 13,2 15,0 16,0
IV 13,2 15,4 16,6 13,1 15,3 16,4
V 13,0 15,0 16,6 13,2 15,2 16,2
VI 13,2 15,4 16,2 13,2 15,1 16,6
Soma 79,4 91,8 98,8 79,2 90,8 98,5
Média 13,23 15,30 16,47 13,20 15,13 16,42
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35. DIFUSÃO EM ÁGAR
Cálculo dos resultados - exemplo
I = log R (R=2) E = ¼[(A3+P3)-(A1+P1)] b = E/I
I = log 2 E = ¼[(32,88-26,43)] b = 1,6125/0,301
I = 0,301 E = 1,6125 b = 5,3571
F = 1/3[(A1+A2+A3)-(P1+P2+P3)] M = F/b
F = 1/3[(44,75-45,00)] M = -0,0833/5,3571
F = -0,0833 M = -0,01556
Pot = Antilog M x 100
Pot = Antilog -0,01556 x 100
Pot = 96,49%
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36. CONCLUSÃO
o A necessidade de confirmação da eficácia terapêutica dos
produtos medicamentosos constitui-se em aspecto de
preocupação. E ainda há que se considerar o aspecto
econômico, assim como o de falsificação com moléculas
estruturalmente similares.
o Os bioensaios são extremamente necessários para que se
tenha um controle de qualidade eficaz destes antimicrobianos
de uso tão difundido.
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37. Todos os direitos reservados - 2012