O documento aborda a validação de métodos físico-químicos na indústria farmacêutica, destacando sua importância para garantir que os processos e resultados atendam as normas de qualidade e eficácia. São discutidos requisitos de legislação, etapas de validação e critérios para a validação de métodos analíticos, incluindo especificidade, linearidade e limites de detecção. A autora, Vanessa Rodrigues Lopes, com vasta experiência na área, detalha também sobre a qualificação de equipamentos e a necessidade de um plano mestre de validação.

1. Validação de métodos físico-
quimicos
Agosto - 2013

2. Vanessa Rodrigues Lopes
Farmacêutica, graduada pela Faculdade de Ciências Farmacêuticas da
Universidade de São Paulo – USP, São Paulo com especialização em
fármacos e medicamentos. Possui vários cursos de especialização nas áreas
de Validação Analítica, Estabilidade, Controle de Qualidade e Assuntos
Regulatórios por associações independentes. Experiência de 12 anos
adquirida nas empresas Bristol-Myers Squibb nas áreas de controle e
garantia de qualidade e Eurofarma na área de assuntos regulatórios onde
atua como especialista em assuntos regulatórios, como link entre as áreas
técnicas e regulatória na submissão de novos projetos, resposta à
exigências e treinamentos técnicos internos. Responsável pelos contatos
técnicos com a ANVISA para desenho de projetos e participação ativa nas
discussões de entidades para revisão da legislação técnica atual.

3. Tópicos
• Legislação envolvida no assunto;
• Importância da validação;
• Etapas prévias à validação;
• Parâmetros de validação e principais tendências;
• Reporte de validação;
• Mantendo “status” validado do método;
• Validação x verificação de métodos;
• Exercício – Montagem de protocolo de validação

4. Legislação e guias relevantes
• RDC 899/2003 – Validação de métodos analíticos;
• RDC 48/2009 – Alterações pós registro de
medicamentos;
• RDC 27/2012 – Validação de métodos bioanalíticos
• RDC 31/2010 – Equivalência Farmacêutica – fala
sobre validação parcial;
• CP 11/2012 – Impurezas e produtos de degradação
• INMETRO - DOQ-CGCRE-008 – Orientações para
validação analítica (rev. 03 – 2010);

5. Legislação e guias relevantes
• IUPAC: Harmonized guidelines for single laboratory
validation of methods of analysis – 2002
• FDA (draft): Analytical Procedures and Methods
Validation – 2000
• EURACHEM: The Fitness for Purpose of Analytical
Methods (1998)
• ICHQ2(R1) – Validation of analytical procedures: Text
and methodology

6. O que é validação?
• Ato documentado que atesta que qualquer
procedimento, processo, equipamento, material,
atividade ou sistema realmente e consistentemente
leva aos resultados esperados;
– RDC 17/2010 – Boas Práticas de Fabricação
• Process of defining an analytical requirement, and
confirming that the method under consideration has
performance capabilities consistent with what the
application requires.
– Eurachem: Fitness for purpose of analytical methods

7. Porque validar?
• Demonstrar que o método é apropriado para a
finalidade pretendida, ou seja, a determinação
qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de
fármacos e outras substâncias em produtos
farmacêuticos.
– RDC 899/2003 – Validação de métodos analíticos
• A validação é uma parte essencial de Boas Práticas
de Fabricação (BPF), sendo um elemento da garantia
da qualidade associado a um produto ou processo
em particular.
– RDC 17/2010 – Boas Práticas de Fabricação

8. Quando validar?
• Os métodos de controle de qualidade devem ser validados
antes de serem adotados na rotina, levando-se em
consideração as instalações e os equipamentos disponíveis.
– Parágrafo único. Os métodos analíticos compendiais não requerem
validação, entretanto antes de sua implementação, devem existir
evidências documentadas de sua adequabilidade nas condições
operacionais do laboratório.
– RDC 17/2010 – Boas Práticas de Fabricação
• No caso de metodologia analítica descrita em farmacopéias
ou formulários oficiais, devidamente reconhecidos pela
ANVISA, a metodologia será considerada validada.
– RDC 899/2003 – Validação analítica

10. Quando revalidar?
• A metodologia analítica deverá ser revalidada nas seguintes
circunstâncias:
– mudanças na síntese da substância ativa,
– mudanças na composição do produto acabado,
– mudanças no procedimento analítico.
– Outras mudanças podem requerer validação dependendo da sua
natureza.
– RDC 899/2003 – Validação de métodos analíticos
• Alterações de formulação (excipiente, sabor, cor), alteração de
especificações e métodos, inclusão de novo fabricante do
fármaco ou alterações na sua rota de síntese, inclusão de
nova concentração ou forma farmacêutica do medicamento,
– RDC 48/2009 – Alterações pós registro

11. Responsáveis pela validação?
Responsável Técnico
assegurar a realização dos programas de validação
Responsável pelo Controle de Qualidade
assegurar que sejam feitas as validações necessárias, inclusive a validação dos
métodos analíticos e calibração dos equipamentos de controle
Responsável pela Garantia da Qualidade
assegurar o correto cumprimento das atividades de validação
RDC 17/2010 – Boas Práticas de Fabricação

12. Como validar?
Qualificação
•Conjunto de ações realizadas para atestar e documentar que quaisquer instalações, sistemas e equipamentos estão propriamente
instalados e/ou funcionam corretamente e levam aos resultados esperados. A qualificação é freqüentemente uma parte da validação,
mas as etapas individuais de qualificação não constituem, sozinhas, uma validação de processo;
Plano mestre
de validação
• Estabelece as estratégias e diretrizes de validação adotadas pelo fabricante. Ele provê informação sobre o programa de
trabalho de validação, define detalhes, responsabilidades e cronograma para o trabalho a ser realizado;
Protocolo de
validação
• Descreve as atividades a serem realizadas na validação de um projeto específico, incluindo o cronograma,
responsabilidades e os critérios de aceitação para a aprovação de um processo produtivo, procedimento de limpeza,
método analítico, sistema computadorizado ou parte destes para uso na rotina
Validação
• Deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas,
assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, precisão,
sensibilidade, limite de quantificação, exatidão, adequados à análise.
Relatório de
validação
• Documento no qual os registros, resultados e avaliação de um programa de validação são consolidados e sumarizados.
Pode também conter propostas de melhorias;

13. Requisitos prévios para validação
Padrões de referência:
1.4. Deve-se utilizar substâncias de referência oficializadas pela Farmacopéia
Brasileira ou, na ausência destas, por outros códigos autorizados pela legislação
vigente. No caso da inexistência dessas substâncias, será admitido o uso de
padrões de trabalho, desde que a identidade e o teor sejam devidamente
comprovados (RDC 899/2003)
• padrão secundário (padrão de trabalho): padrão utilizado na rotina
laboratorial, cujo valor é estabelecido por comparação a um padrão de
referência (RDC 17/2010) – NÃO ACEITOS EM VALIDAÇÃO!!!
• padrão de referência: são exemplares de fármacos, impurezas, produtos de
degradação, reagentes, dentre outros, altamente caracterizados e da mais
elevada pureza, cujo valor é aceito sem referência a outros padrões (RDC
17/2010);
– Farmacopeico: Adquirido de um compêndio oficial reconhecido pela ANVISA (RDC
37/2009);
– Caracterizado (primario): Análises para determinação absoluta da pureza e
identidade;

14. http://www.pharmtech.com/pharmtech/Peer-Reviewed+Research/Reference-Standard-Material-
Qualification/ArticleStandard/Article/detail/591372

15. Requisitos prévios para validação
Qualificação e calibração de equipamentos:
1.9. Para a garantia da qualidade analítica dos resultados, todos os
equipamentos utilizados na validação devem estar devidamente
calibrados e os analistas devem ser qualificados e adequadamente
treinados (RDC 899/2003);
• qualificação: conjunto de ações realizadas para atestar e documentar que
quaisquer instalações, sistemas e equipamentos estão propriamente instalados
e/ou funcionam corretamente e levam aos resultados esperados (RDC
17/2010);
• calibração: conjunto de operações que estabelece, sob condições
especificadas, a relação entre os valores indicados por um instrumento ou
sistema de medição ou valores representados por uma medida materializada
ou um material de referência, e os valores correspondentes das grandezas
estabelecidos por padrões (RDC 17/2010);

16. Requisitos prévios para validação
Treinamento dos analistas:
1.9. Para a garantia da qualidade analítica dos resultados,
todos os equipamentos utilizados na validação devem
estar devidamente calibrados e os analistas devem ser
qualificados e adequadamente treinados (RDC 899/2003);

17. Plano mestre de validação
• Deve conter os elementos chave do programa de validação.
Deve ser conciso e claro, bem como conter, no mínimo:
I. uma política de validação;
II. estrutura organizacional das atividades de validação;
III. sumário/relação das instalações, sistemas, equipamentos e
processos que se encontram validados e dos que ainda deverão ser
validados (situação atual e programação);
IV. modelos de documentos (ex: modelo de protocolo e de relatório) ou
referência a eles;
V. planejamento e cronograma;
VI. controle de mudanças; e
VII. referências a outros documentos existentes.
– RDC 17/2010 – Boas práticas de fabricação

18. Protocolo de validação
• Devem incluir, no mínimo, as seguintes informações:
I. objetivos do estudo;
II. local/planta onde será conduzido o estudo;
III. responsabilidades;
IV. descrição dos procedimentos a serem seguidos;
V. equipamentos a serem usados, padrões e critérios para produtos e
processos relevantes;
VI. tipo de validação;
VII. processos e/ou parâmetros;
VIII. amostragem, testes e requisitos de monitoramento; e
IX. critérios de aceitação.
– RDC 17/2010 – Boas práticas de fabricação

19. Processos/Parâmetros da validação
• No caso de metodologia analítica não descrita em
farmacopéias ou formulários oficiais, devidamente
reconhecidos pela ANVISA, a metodologia será considerada
validada, desde que sejam avaliados os parâmetros
relacionados a seguir,
– Especificidade e Seletividade
– Linearidade
– Intervalo
– Precisão
– Limite de detecção (sensibilidade)
– Limite de quantificação
– Exatidão
– Robustez
– RDC 899/2003 – Validação de métodos analíticos

21. Categoria Finalidade
I
Testes quantitativos para a determinação do princípio
ativo em produtos farmacêuticos ou matérias–primas
II
Testes quantitativos ou ensaio limite para a
determinação de impurezas e produtos de degradação
em produtos farmacêuticos e matérias-primas
III
Testes de performance (por exemplo: dissolução,
liberação do ativo, etc)
IV Testes de identificação
Categorias de testes

22. Ensaios necessários por categoria
Parâmetro
Categoria
I
Categoria II
Categoria
III
Categoria
IVQuantitativo
Ensaio
Limite
Especificidade Sim Sim Sim * Sim
Linearidade Sim Sim Não * Não
Intervalo Sim Sim * * Não
Precisão
Repe Sim Sim Não Sim Não
Repro ** ** Não ** Não
Limite de detecção Não Não Sim * Não
Limite de quantificação Não Sim Não * Não
Exatidão Sim Sim * * Não
Robustez Sim Sim Sim Não Não
* pode ser necessário, dependendo da natureza do teste específico.
** se houver comprovação da reprodutibilidade não é necessária a comprovação da Precisão Intermediária.

23. Especificidade
É a capacidade que o método possui de medir exatamente um
composto em presença de outros componentes tais como
impurezas, produtos de degradação e componentes da matriz
Contém
compostos
semelhantes
Contém
fármaco
Quantitativamente: Seleção entre o alvo e compostos semelhantes;
Qualitativamente: Ausência de interferência na presença de compostos
semelhantes (comprovar pureza cromatográfica do pico alvo)
• Impurezas “disponíveis”: Contaminar amostra
• Impurezas “indisponíveis”: Estudo de stress ou comparação de métodos

24. Especificidade – Planejamento do experimento
Preparação Objetivo
Padrões do alvo Avaliar a resposta básica do composto de interesse na técnica
Diluentes, fase móvel Avaliar ausência de resposta (ausência de picos no TR ou de resposta
no comprimento de onda ou na técnica utilizada – titulação por
exemplo)
Placebo branco Avaliar a ausência de resposta no TR ou comprimento de onda e
localizar os picos relacionados ao placebo (HPLC/CG)
Placebo contaminado com
padrão alvo
Avaliar o comportamento do alvo na matriz (se há alteração de
resposta por exemplo ou se há interação que possa ser verificada –
DAD)
Placebo contaminado com
impurezas disponíveis (na
concentração esperada)
Avaliar o comportamento das impurezas na matriz quando o alvo está
ausente. Localizar os picos relacionados exclusivamente às impurezas
disponíveis
Placebo contaminado com
impurezas disponíveis (na
concentração esperada) +
alvo
Avaliar o comportamento do alvo na matriz e com a presença de
impurezas
Amostras submetidas à
stress
Avaliar a pureza dos picos ou ausência de resposta na presença de
impurezas conhecidas e desconhecidas

25. Especificidade – Estudo de stress
• A empresa deverá apresentar estudos submetendo o
medicamento às seguintes condições de estresse:
I. Aquecimento;
II. Umidade;
III. Solução ácida;
IV. Solução básica;
V. Solução oxidante;
VI. Exposição fotolítica; e
VII. Íons metálicos.
• Justificar tecnicamente a não utilização de qualquer uma dessas
condições.
• Promover uma degradação de pequena extensão em torno de
10-30% (dez a trinta por cento). Justificar degradação inferior;

26. Estudo de stress – planejamento do experimento
Quanto degradar? Entre 10 e 30% (novos estudos demonstram que entre 5 e
15% seria mais adequado - menos degradação secundária)
Até quando degradar? Basear na literatura, tabela do TRS 929 da WHO (acima)
é geralmente aceita para “claim” de estabilidade na condição testada

27. Estudo de stress – Planejamento do experimento
Preparação Objetivo
Placebo degradado Avaliar e excluir os picos relativos exclusivamente à degradação do
placebo
Padrão controle Padrão não degradado para calculo de recuperação após degradação
Padrão degradado Avaliar os picos relativos aos degradantes do padrão (overlay com
placebo degradado para exclusão de picos do placebo). Avaliar
também a característica indicativa de estabilidade
Amostra controle Avaliar os picos relativos à amostra (interação do ativo com os
excipientes) e usada para calcular recuperação na degradação
Amostra degradada Avaliar os picos relativos à degradação do ativo na presença da matriz
(placebo) que pode ser diferente da degradação do padrão sozinho
(interação fármaco-excipiente)

28. Especificidade – Degradação forçada

30. Especificidade – Principais exigências
• Ausência de degradação nas condições testadas
ou degradação inferior a 10%;
• Degradação acima de 30%;
• Demonstrar condição indicativa de estabilidade
do método;
• Demonstrar pureza de pico: Aplicável somente à
métodos cromatográficos;
• Utilizar impurezas “disponíveis” para verificar se
há interação (teor e produtos de degradação);

31. Especificidade – Separação adequada?
http://www.aaps.org/uploadedfiles/content/sections_and_groups/regional_discussion_groups/swartzapr2010.pdf

34. Especificidade – O que reportar?
• Cromatogramas de todas as soluções analisadas;
• “Overlay” de cromatogramas do placebo, placebo
degradado, padrão, padrão degradado, amostra e
amostras degradadas;
• Descrição de quais picos podem ser excluídos por
pertencer exclusivamente à diluentes e/ou
placebo/placebo degradado;
• Tabela demonstrando a pureza dos picos dos alvos da
metodologia;
• Tabela constando a % de degradação nos estudos de
stress e quantidade de impurezas verificadas.

35. Limite de detecção – LD ou LoD
• Limite de detecção é a menor quantidade do analito presente
em uma amostra que pode ser detectado, porém não
necessariamente quantificado, sob as condições experimentais
estabelecidas (RDC 899/2003);
– O limite de detecção é estabelecido por meio da análise de soluções de
concentrações conhecidas e decrescentes do analito, até o menor nível
detectável;
– Métodos não instrumentais: Pode ser feita visualmente, onde o limite de
detecção é o menor valor de concentração capaz de produzir o efeito
esperado (mudança de cor, turvação, etc);
– Métodos instrumentais: estimativa com base na relação de 3 vezes o
ruído da linha de base. Pode ser determinado analisando 3 curvas
contendo analito próximo ao limite de detecção ou de análise de
amostras do branco;

36. Limite de quantificação – LQ ou LoQ
• É a menor quantidade do analito em uma amostra que pode ser
determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as
condições experimentais estabelecidas (RDC 899/2003);
– Determinado, principalmente, para ensaios quantitativos de impurezas,
produtos de degradação em fármacos e produtos de degradação em
formas farmacêuticas. Pode ser útil para validação de teor em métodos
utilizados em validação de limpeza;
– O limite de quantificação é estabelecido por meio da análise de soluções
contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível
determinável com precisão e exatidão aceitáveis.
– Métodos instrumentais: estimativa com base na relação de 10 vezes o
ruído da linha de base.

38. LD e LQ – O que reportar?
• Limite de detecção:
– Tipo de abordagem utilizada (sinal ruído ou curvas);
– Valor de sinal ruído da linha de base com seu cromatograma;
– Cálculo utilizado para a determinação do LD
– Valor de LD na mesma unidade da especificação (usualmente em %)
• Limite de quantificação:
– Tipo de abordagem utilizada (sinal ruído ou curvas);
– Valor de sinal ruído da linha de base com seu cromatograma;
– Cálculo utilizado para a determinação do LQ
– Verificação da precisão e exatidão no LQ
– Valor de LQ na mesma unidade da especificação (usualmente em %)

39. Linearidade
• É a capacidade de uma metodologia analítica de
demonstrar que os resultados obtidos são diretamente
proporcionais à concentração do analito na amostra,
dentro de um intervalo especificado (RDC 899/2003).
– Análise de no mínimo 5 concentrações diferentes, conforme
tipo de validação – usualmente 3 replicatas de cada
concentração;
– Coeficiente de correlação (mínimo 0,99), intersecção com o
eixo Y, coeficiente angular, soma residual dos quadrados
mínimos da regressão linear e desvio padrão relativo.
– Se não houver relação linear, realizar transformação
matemática.

40. Tipo de validação Faixa a ser validada
Determinação quantitativa do
analito em matérias-primas ou
em formas farmacêuticas
De 80% a 120% da concentração teórica do teste
Uniformidade de conteúdo De 70% a 130% da concentração teórica do teste
Determinação de impurezas Do nível de impureza esperado até 120% do limite
máximo especificado. Quando apresentarem
importância toxicológica ou efeitos farmacológicos
inesperados, os limites de quantificação e detecção
devem ser adequados às quantidades de impurezas a
serem controladas
Dissolução De ±20% sobre o valor especificado para o intervalo.
Caso a especificação para a dissolução envolva mais
que um tempo, o alcance do método deve incluir –
20% sobre o menor valor e +20% sobre o maior valor.
Concentrações conforme tipo de validação

42. • Duas formas de
avaliação visual da
linearidade:
– Plotar resposta x
concentração
– Plotar
resposta/concentração x
log da concentração

43. EXERCÍCIO

45. Exemplo – Escitalopram Tablets USP
• Citalopram é isômero óptico do
escitalopram
• Padrão disponível: citalopram
HBr
• Especificação: 90 a 110% do
rotulado de escitalopram
• Concentração da amostra e
padrão: 0,5 mg/mL de
citalopram (0,62 mg/mL de
citalopram HBr)

46. Linearidade – Escitalopram tablets – teor e UC
• Teor e uniformidade de conteúdo (UC) com mesmo
método
• Concentração alvo do método – 100%: 0,5 mg/mL de
citalopram (usando 0,62 mg/mL de padrão de
citalopram HBr)
• Faixa de validação para teor: 80 a 120%
• Faixa de validação para UC: 70 a 130%
• Faixa a ser validada: 70 a 130% da concentração alvo
(considerando mesmo método para teor e UC)
• Considerar no mínimo 5 concentrações no intervalo

47. Faixa [Citalopram/mL] na faixa Diluição da solução mãe
70% 0,35 mg/mL 0,7 mL/10 mL
80% 0,40 mg/mL 0,8 mL/10 mL
90% 0,45 mg/mL 0,9 mL/10 mL
100% 0,50 mg/mL 1,0 mL/10 mL
110% 0,55 mg/mL 1,1 mL/10 mL
120% 0,60 mg/mL 1,2 mL/10 mL
130% 0,65 mg/mL 1,3 mL/10 mL
• Solução mãe: 5,0 mg/mL (citalopram) = 6,2 mg/mL (citalopram HBr)

48. Exemplo – Escitalopram Tablets USP
• Padrão disponível: Citalopram
HBr
• Especificação: vide tabela
• Método não tem padrão das
impurezas individuais: %área
• Concentração alvo do método:
Especificação de cada impureza
• Faixa de linearidade: Do nível
esperado (ausente) até 120% do
máximo esperado (maior valor –
0,5%) – LOQ até 0,6%
• Concentração do padrão: 0,5
mg/mL - 100%

49. Faixa Concentração
impureza
[citalopram/mL] na faixa Diluição da solução mãe
LOQ LOQ LOQ De acordo com o LOQ
20% 0,1% 0,5 mcg/mL 1,0 mL/10 mL
40% 0,2% 1,0 mcg/mL 2,0 mL/10 mL
60% 0,3% 1,5 mcg/mL 3,0 mL/10 mL
80% 0,4% 2,0 mcg/mL 4,0 mL/10 mL
100% 0,5% 2,5 mcg/mL 5,0 mL/10 mL
120% 0,6% 3,0 mcg/mL 6,0 mL/10 mL
• Solução mãe: 5 mcg/mL (citalopram base)

50. Exemplo – Escitalopram Tablets USP
• Padrão disponível: Escitalopram
Oxalate
• Especificação: NLT 80% do
rotulado de escitalopram
• Concentração da amostra e
padrão: L/900 sendo L = 10 mg.
• Concentração alvo do método:
0,01 mg/mL (10 mg/900 mL) –
100% (escitalopram base)
• Perfil de dissolução?

51. • Produto teste
• Produto referência/comparador

52. Linearidade – Escitalopram tablets – dissolução
• Concentração alvo do método – 100%: 0,01 mg/mL de
escitalopram base livre
• Especificação de dissolução: minimo 80% dissolvido em
30 minutos, ou seja, concentração mínima de 0,008
mg/mL
• Perfil de dissolução – menor valor: 38,05%
• Faixa de validação para dissolução: -20% do menor
valor e +20% do maior valor (18% a 120%)
– 38% - 20% = 18%
– 100% + 20% = 120%

53. Faixa [Escitalopram/mL] na faixa Diluição da solução mãe
18% 0,0018 mg/mL 0,9 mL/100 mL
20% 0,002 mg/mL 0,1 mL/10 mL
40% 0,004 mg/mL 0,2 mL/10 mL
60% 0,006 mg/mL 0,3 mL/10 mL
80% 0,008 mg/mL 0,4 mL/10 mL
100% 0,010 mg/mL 0,5 mL/10 mL
120% 0,012 mg/mL 0,6 mL/10 mL
• Solução mãe: 0,2 mg/mL (escitalopram base)

54. Linearidade – O que pode acontecer?
• Concentração alvo do método – 100%: 0,01 mg/mL de
escitalopram base livre
• Especificação de dissolução: minimo 80% dissolvido em
30 minutos, ou seja, concentração mínima de 0,008
mg/mL
• Perfil de dissolução – menor valor: 38,05%
• Faixa de validação para dissolução: -20% do menor
valor e +20% do maior valor (18% a 120%)
– 38% - 20% = 18%
– 100% + 20% = 120%

55. • Mesmo o método sendo igual para impurezas e teor,
não dá pra usar a mesma curva por falta de linearidade

56. • Sem co-relação linear aceitável

57. • Pela ANVISA: Avaliação visual do
gráfico dos resíduos – aparenta
alguma co-relação?
• Normalmente os resíduos
devem estar igualmente
distribuidos acima e abaixo do
zero, caso contrário aparentam
co-relação;
• Calculo estatístico e minitab
existem para acessar não
subjetivamente tal
adequabilidade

58. Linearidade – O que reportar?
• Tabela contendo as concentrações x respostas obtidas
analíticamente para no mínimo 5 concentrações;
• DPR verificado entre as replicatas de cada uma das
concentrações (usualmente 3 replicatas);
• Grafico da linearidade para cada método
• Valor do coeficiente de co-relação (r);
• Gráfico de resíduos
• Equação da reta obtida e eventuais transformações
matemáticas para obtenção de resposta linear (log por
exemplo);
• Valor de y-intercepto obtido

59. Precisão
• A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados
obtidos em uma série de medidas de uma amostragem
múltipla de uma mesma amostra.
– Repetibilidade (precisão intra-corrida): concordância entre os
resultados dentro de um curto período de tempo com o
mesmo analista e mesma instrumentação = no mínimo, 9
determinações no linear do método, ou seja, 3 concentrações
na baixa, média e alta, com 3 réplicas cada ou mínimo de 6
determinações a 100% da concentração do teste
(usualmente até 2%)
– Precisão do sistema – uma preparação avaliada 6 vezes;
– Precisão do método – 6 preparações avaliadas 1 vez;

60. Precisão
• Precisão intermediária (precisão inter-corridas): concordância
entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias
diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos
diferentes. Para a determinação da precisão intermediária
recomenda-se um mínimo de 2 dias diferentes com analistas
diferentes (usualmente até 5%)
• Reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial): concordância
entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes. Estes
dados não precisam ser apresentados para a concessão de
registro (usualmente até 5%)
– A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de
variação (CV%), não podendo ser superior a 5%

61. Precisão do sistema

62. Precisão do método – intra e inter

64. Precisão – O que reportar?
• Tabela contendo os valores de avaliação da precisão do
sistema e da variação encontrada;
• Tabela contendo os valores de avaliação da precisão do
método por 1º analista usando 1º equipamento no 1º
dia;
• Tabela contendo os valores de avaliação da precisão do
método por 2º analista usando 2º equipamento no 2º
dia;
• Tabela contendo a sumarização dos valores de precisão
do método pelos 2 analistas;

65. Exatidão
• A exatidão de um método analítico é a proximidade dos
resultados obtidos pelo método em estudo em relação
ao valor verdadeiro.
• Fármaco
– Uso de metodologia analítica proposta na análise de uma
substância de pureza conhecida (padrão de referência);
– Comparação dos resultados entre metodologias;
• Forma Farmacêutica
– Placebo contaminado com quantidade conhecida de fármaco
ou da substância que se quer avaliar (no caso da
indisponibilidade de amostras de certas impurezas e/ou
produtos de degradação = comparação entre metodologias

66. Exatidão - Procedimento
• 9 determinações contemplando o intervalo
linear do procedimento:
– 3 concentrações na baixa – 3 replicatas;
– 3 concentrações na média – 3 replicatas;
– 3 concentrações na alta – 3 replicatas;
• Determinar a relação entre a concentração
média determinada experimentalmente e a
concentração teórica correspondente

70. Robustez
• A robustez de um método analítico é a medida de sua
capacidade em resistir a pequenas e deliberadas variações dos
parâmetros analíticos. Indica sua confiança durante o uso normal
(RDC 899/2003)
– Durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se considerar a avaliação da
robustez. Constatando-se a susceptibilidade do método à variações nas condições
analíticas, estas deverão ser controladas e precauções devem ser incluídas no
procedimento.

71. Robustez
• Teste de Youden: método confiável para avaliação da robustez de
métodos analíticos, por meio de um delineamento que envolve
sete parâmetros analíticos combinados em oito experimentos
(descrito no guia INMETRO/2010);
• Cada variação é avaliada em relação à condição não alterada;
por exemplo, condição “C” (não alterada) e “c” (alterada):

73. http://www.scielo.br/pdf/bjps/v45n2/v45n2a07.pdf

74. Robustez – O que reportar?
• Tabela com a avaliação dos resultados obtidos com a
metodologia alterada x não alterada;
• Resultados do cálculo para matriz de Youden;
• Definição das especificações de alteração que devem
ser consideradas significativas para cada parâmetro
avaliado;
• Parâmetros que tiveram resultados significativamente
diferentes da condição não alterada;
• Recomendações para inclusão no método analítico
original – quais parâmetros devem ser estritamente
monitorados;

75. Intervalo
• O intervalo especificado é a faixa entre os limites de
quantificação superior e inferior de um método
analítico. Normalmente é derivado do estudo de
linearidade e depende da aplicação pretendida do
método.
• É estabelecido pela confirmação de que o método
apresenta exatidão, precisão e linearidade adequados
quando aplicados a amostras contendo quantidades de
substâncias dentro do intervalo especificado.

76. Estabilidade das soluções
• Não detalhada na RDC 899/2003;
• Necessária para garantir que o analito tem estabilidade
no mínimo no tempo de análise;
• Importante para garantir as condições nas quais o
analito é estável (refrigerado, ambiente) para
estabelecer por exemplo,
– soluções-mãe de compostos pouco disponíveis ou
caros,
– Tempo no qual as soluções podem ser mantidas para
uma eventual investigação de resultados não
conforme;

78. Relatório de validação
• Art. 490. Os relatórios devem refletir os protocolos
seguidos e contemplar, no mínimo, o título, o objetivo
do estudo, bem como fazer referência ao protocolo,
detalhes de materiais, equipamentos, programas e
ciclos utilizados e ainda, os procedimentos e métodos
que foram utilizados.
– Art. 491. Os resultados devem ser avaliados, analisados e
comparados com os critérios de aceitação previamente
estabelecidos.
– Art. 492. Os Departamentos responsáveis pelos trabalhos de
qualificação e validação devem aprovar o relatório completo.

79. Alterações permitidas
em métodos já
validados
ANVISA não tem reconhecido e
solicita precisão, especificidade
e linearidade – Farmacopeia
Mercosul em CP

80. Validação x verificação de métodos
• Não há guia da ANVISA. RDC 17/2010 é vaga.
• Capítulos da USP (farmacopeia americana) <1225>
intitulado “validação de métodos compendiais” e
<1226> “verificação de métodos compendiais”.
– Capítulo <1225> Descreve a validação de métodos analíticos
com todos os parâmetros definidos. O resultado é um
método validado para uma amostra específica. Este
procedimento é recomendado para a validação de métodos
desenvolvidos internamente.
– Capítulo <1226> Provê recomendações para a demonstração
de que o laboratório tem a habilidade de utilizar o método de
forma adequada.

81. Exemplos de
parâmetros para
verificação de métodos
Não há guia da ANVISA, cada
laboratório deve fornecer
racional para escolha dos
parâmetros de verificação

82. Referências
• IUPAC - http://www.iupac.org/publications/pac/2002/pdf/7405x0835.pdf
• FDA -
http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidanc
es/UCM122858.pdf
• ICH -
http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Ste
p4/Q2_R1__Guideline.pdf
• ISO 17025 - http://www.saba.org.ir/saba_content/media/image/2011/04/1821_orig.pdf
• INMETRO - http://www.inmetro.gov.br/Sidoq/Arquivos/CGCRE/DOQ/DOQ-CGCRE-8_03.pdf
• EURACHEM - http://www.eurachem.org/images/stories/Guides/pdf/valid.pdf
• AGILENT - http://www.chem.agilent.com/Library/primers/Public/5990-5140EN.pdf
• WHO – reference standards -
http://www.who.int/medicines/areas/quality_safety/quality_assurance/GeneralGuidelinesEs
tablishmentMaintenanceDistributionChemicaReferenceSubstancesTRS943Annex3.pdf
• ANVISA – CP 11/2012 -
http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/042a338049f229df96d7bfaa19e2217c/Consul
ta+P%C3%BAblica+n%C2%B0+11+GGMED.pdf?MOD=AJPERES
• AOAC – variabilidade - http://www.eoma.aoac.org/app_f.pdf
• Estatística - http://www.cprm.gov.br/publique/media/Andriotti_Tecnicas_estatisticas.pdf

83. OBRIGADA!!!
rodrigues.van79@gmail.com