Identificação de produtos de oxidação de cepas de Gluconobacter

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Obs. Conclusão sobre o pH alcalino está equivocado.

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Identificação de produtos de oxidação de cepas de Gluconobacter

  1. 1. Jintana Kommanee, Somboon Tanasupawat, Pattaraporn Yukphan, Duangtip Moonmangmee, Nuttha Thongchul, Yuzo Yamada Apresentação: Mauren Silveira
  2. 2. Identification and Oxidation Products of Gluconobacter StrainsIsolated from Fruits and Flowers in Thailand International Journal of Biology Vol. 4, No. 1; January 2012 Published by Canadian Center of Science and EducationReceived: October 20, 2011 Accepted: November 4, 2011 Published: January 1, 2012 www.ccsenet.org/ijb
  3. 3. INTRODUÇÃO Bactérias Promotoras de Crescimento em Plantas (BPCPs): Pseudomonas, Bacillus, Burkholderia, Streptomyces, Rhizobium, Bradyrhizobium, Acetobacter e Herbaspirilum, Agrobacterium radiobacter e Enterobacter cloacae Bacillus sp. –melancia-promoção do crescimento Produção de auxina, citocinina e etileno por Gluconobacter Paenibacillus macerans e Bacillus pumilus biocontrole sobre Xanthomonas vesicatoria e Alternaria solani no tomate Antimicrobiano de Bacillus sobre M. luteus e A. niger (antagonismo)
  4. 4. BACTÉRIAS ACÉTICAS Família Acetobacteriaceae são catalase +, oxidase – Produtoras de ácido a partir de glicose Colônias opacas de crescimentos 25-30°C e pH 5.5 Glicólise ausente devido à ausência de fosfofrutoquinase As desidrogenases ligadas à membrana funcionam melhor para oxidação do substrato entre pH 3.0 – 6.0  O pH ótimo para desidrogenases citosólicas está entre pH 8.0-11.00  São insuperáveis na OXIDAÇÃO incompleta de vários hidratos de carbono
  5. 5. ACETOBACTER X GLUCONOBACTER ACETOBACTER Superoxidantes Álcool Cetona e Ácidos CO2 e H2O Não produz pigmentos GLUCONOBACTER Sub-oxidante Álcool Cetona e Ácidos Produz pigmento marrom
  6. 6. O Gênero Gluconobacter 5 espécies: G.japonicus, G.oxydans, G.frateurii, G.albidus e G.thailandicus• Gram negativas• Sozinhas ou pares• Não formam esporos• Móveis ou não• Aeróbias• Colônias pálidas• 25-30ºC• pH 3,6..5,5-6,5• Catalase +• Oxidase –• Não há liquefação• Não produz Indol a partir de triptofano• Oxida etanol em ác. Acético e não reoxida o ácido por faltar succinato desidrogenase• Não oxida acetato em lactato pra H2O e CO2 (falta enzima Ciclo ác. Tricarboxílico)• O ácido é formado a partir da D-glicose e da D- xilose pela via fosfato-pentose• Prefere açúcar ao álcool• Fontes de carbono: D-manitol>Sorbol>Glicerol>D-frutose>D-Glicose• Meio padrão de isolamento: Etanol de Frateur• Precisam de vitaminas do complexo B (tiamina, ácido pantotênico e nicotínico)
  7. 7. INTERESSE BIOTECNOLÓGICOBIO-AROMÁTICO 2- FENIL-ALDEÍDOÁCIDO ACÉTICO Concentrações de substratoDIIDROXIACETONA alta poderia provavelmenteL-SORBOSE ser tolerados devido aoL-RIBOSE (droga anti-viral) desenvolvimento deMIGLITOL mecanismos de adaptação celular durante a faseDEXTRAN- exponencial lag e mais cedo DEXTRINASED-TAGATOSEALDEÍDOS QUIRAIS
  8. 8. DIIDROXIACETONAA PARTIR DO GLICEROLAÇÚCAR SIMPLES DE 3 CARBONOSCONHECIDO COMO GLICERONAREAÇÃO DE MAILLARD ENTRE O GRUPO AMINO DA QUERATINA E O GRUPO HIDROXILA DA DHA
  9. 9. METOTREXATOANTIFOLATODR. SIDNEY FARBER PEDIU AO DR. Y. SUBBAROW SINTETIZAR O METATREXATO PARA USAR NO TRATAMENTO DE LEUCEMIA INFANTIL (1940) ÁCIDO PENTANEDIÓICO
  10. 10. L -SORBOSEHexo-CETOSEA PARTIR DO D-SORBITOLOXIDAÇÃO REGIOSELETIVA D-GLUCOSE—HIDROGENAÇÃO QUÍMICA—D-SORBITOL— G.OXYDANS-- L-SORBOSE + ACETONA--DIACETONA L- SORBOSE—OXIDAÇÃO-- ÁCIDO 2-CETO-L GULÔNICO ÁCIDO ASCÓRBICO TEM VÁRIOS ISÔMEROS (CARBONOS C4 E C5 ASSIMÉTRICOS) APENAS O ISÔMERO L É ATIVO.
  11. 11. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS ACÉTICAS22 AMOSTRAS DE FRUTAS NATIVAS DA TAILÂNDIA2 AMOSTRAS DE FLORES (PETÚNIAS)3-5 DIAS EM MEIO GEY LÍQUIDO(GLICOSE/ETANOL/ EXTRATO DE LEVEDURA) pH 4.0 MEIO GEY ÁGAR + 0,3% CaCO AAB PRODUZEM HALO
  12. 12. CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA 2 DIAS EM MEIO ÁGAR GYPG (glicose/peptona/glicerol) pH 6.8 30°C GRAM NEGATIVOSCARACTERIZAÇÃO FISIOLÓGICA E BIOQUÍMICACARACTERIZAÇÃO QUIMIOTAXONÔMICA
  13. 13. CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICAAMPLIFICAÇÃO DO GENE ITS16S-23S rRNA POR PCRPRIMERS: (1522F-16S)(posição 1522-1540 no 16S rRNAE.coli) (38R-23S) (posição 38-22 no 23S rRNAE.coli) (715 Bp)ENDONUCLEASES DE RESTRIÇÃO: BstNI, MboII e MboI SEQUENCIAMENTO: PRIMERS: 1522F, 38R, Talaf, Talar
  14. 14. RESULTADO SEQUENCIAMENTO
  15. 15. PRODUÇÃO DA L-SORBOSE A PARTIR DO D-SORBITOL pH 6.3-4.7 24 h-200rpm 30°C 39,68 g/L 30°C-48H Meio Batata líq ANÁLISE QUANTITATIVA DE PRODUÇÃO DE L-SORBOSE FEITA PELA REAÇÃO DO RESORCINOLREAÇÃO SIMPLES OBSERVADA PELA PRESENÇA DE CETOSE IDENTIFICADAPELO DESENVOLVIMENTO DA COLORAÇÃO VERMELHO-CEREJA NO MEIO
  16. 16. PRODUÇÃO DE L-SORBOSE POR G. frateurii Notícia boa: 100% do D-sorbitol biotransformado em L-sorbose em 24 horas, das 48 horas padrão, em 30°C chegando a produzir 39.68 g/L de L-sorbose Notícia má: Em estudo anterior (2000) da mesma equipe, outra cepa de G. frateurii (CHM 54) produziu em 48 horas 50 g/L de L-sorbose
  17. 17. PRODUÇÃO DE DHA A PARTIR DO GLICEROL 5% glicerol e ANÁLISE QUANTITATIVA 1% extrato de DE PRODUÇÃO DE DHA: levedura pH5.0 REAÇÃO DA DIFENILAMINA 1 ML 30°C /4 dias Melhor:42,52 g/LBatata 10ML/Shaker pH ideal favorece ativação BATATA 30°C de enzimas e impede que 24HR 24hr outras degradem o produto formado 50G/L GLICEROLDESENVOLVIMENTO ANÁLISE QUANTITATIVA DE PRODUÇÃO DE DHA: 200 mL DA COR AZUL NO REAÇÃO DA MEIO DIFENILAMINA
  18. 18. PRODUÇÃO DE DHA POR G.oxydans –PHD27 Concentração g/L DHA 44,1g/L OD 600(nm) Hora de bioconversão Crescimento celular DHA
  19. 19. CONCLUSÃODos isolados selvagens de Gluco no bacte r obtidos em frutas e petúnias da Tailândia para produção de L-sorbose e Diidroxiacetona (DHA), os mais produtivos foram G. frate urii para L-Sorbose e G. o xydans para DHA, ambos isolados da fruta Longan. Apesar da produção em bancada do L- sorbose se mostrar pouco rentável, a produção de DHA se mostrou satisfatória, indicando nível máximo durante a fase estacionária de crescimento da cultura.Na produção do L-Sorbose houve uma alteração grande de pH do meio e como a enzima D-Sorbitol desidrogenase ligada a membrana, que funciona melhor em pH alcalino, é crucial para a biotransformação, talvez tenha sido um dos fatores que limitou a concentração do produto. Apesar do rendimento ter sido de 100%, há na literatura dados que comprovam que o aumento da L-Sorbose no meio impede o consumo de O2 pelas células de Gluco no bacte r.Na produção de DHA o valor de 44,1 g/L na capacidade da cepa PHD27 em transformar o glicerol sob condições ótimas de crescimento na escala laboratorial pode indicar uma cepa selvagem candidata à produção eficiente e competitiva comparada às atualmente utilizadas em escala industrial.
  20. 20. RENDIMENTO BIOLÓGICO INDUSTRIAL
  21. 21. RENDIMENTO QUÍMICO INDUSTRIAL
  22. 22. Este trabalho foi escolhido porapresentar pesquisa de novosmicrorganismos selvagensvoltados à produção decompostos com valor agregadono mercado e substratosbaratos. OBRIGADA

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